La vaccination maternelle contre le virus inactivé autogène renforce l'immunité au PRRSV chez les porcelets Partie 1

Abstrait:

L'immunité d'origine maternelle est un élément essentiel pour la survie et le succès de la progéniture chez les porcs pour se protéger des agents pathogènes circulants tels que le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin de type 2 (PRRSV-2).

Le but de cette étude est d'étudier le transfert de l'immunité anti-SRRP aux porcelets issus de cochettes ayant reçu le virus vivant modifié (MLV) seul (traitement (TRT) 0), ou en combinaison avec l'un des deux virus inactivés autogènes. vaccins (VIA, TRT 1 plus 2). Les porcelets de ces cochettes ont été provoqués avec la souche autogène de PRRSV -2 à l'âge de deux semaines et leur réponse immunitaire adaptative (IR) a été évaluée jusqu'à 4 semaines après l'inoculation (dpi).

La RI humorale et cellulaire systémique a été analysée chez les cochettes avant la mise-bas, chez les porcelets, avant l'inoculation et à 2 et 4 wpi. Les deux AIV ont partiellement protégé les porcelets avec une pathologie pulmonaire réduite et une augmentation du gain de poids ; La TRT 1 a également réduit la virémie des porcelets, ce qui s'explique le mieux par la production induite par le VIA d'anticorps neutralisants chez les cochettes et leur transfert aux porcelets. Chez les porcelets, avant l'inoculation, les principaux producteurs systémiques d'IFN étaient les lymphocytes CD21 plus B. De 0 à 4 wpi, le rôle de ces lymphocytes B a décliné et les lymphocytes T CD4 sont devenus les principaux producteurs systémiques d'IFN.

Les bons virus vivants font référence à des virus qui ne causent pas de maladie et qui ont une certaine relation avec l'immunité du corps humain. Les virus vivants peuvent stimuler le système immunitaire humain pour produire une réponse immunitaire, renforçant ainsi l'immunité humaine. Des études ont montré qu'une fois que le corps humain est infecté par un virus vivant, il libère certains médiateurs et cytokines, qui peuvent activer les cellules immunitaires, favoriser le fonctionnement du système immunitaire et améliorer la capacité du corps à résister aux virus.

De plus, les virus bénins et viables peuvent également occuper les cellules de manière compétitive, ce qui rend difficile l'invasion et la reproduction des agents pathogènes, protégeant ainsi le corps humain contre d'autres infections. Par conséquent, une infection virale bénigne et vivante appropriée peut améliorer l'immunité humaine, mais une infection excessive peut entraîner la maladie. Par conséquent, dans la vie quotidienne, les gens doivent veiller à contrôler l'infection par des virus vivants et à améliorer leur immunité grâce à un mode de vie sain. De ce point de vue, nous devons améliorer l'immunité. Cistanche peut améliorer considérablement l'immunité. La cendre de viande contient une variété d'ingrédients biologiquement actifs, tels que des polysaccharides, deux champignons et Huangli, etc. Ces ingrédients peuvent stimuler diverses fonctions du système immunitaire. cellules semblables à des cellules, augmentant leur activité immunitaire.

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Dans les poumons, les lymphocytes T CD8 étaient les primaires et les lymphocytes T CD4 étaient les producteurs secondaires d'IFN, y compris un nouveau sous-ensemble de lymphocytes T CD8 −CCR7− CD4 porcins, des cellules CD4 TEMRA potentiellement différenciées en phase terminale. En résumé, cette étude démontre que la vaccination maternelle contre le VIA peut améliorer la protection des porcelets en pré-sevrage contre le PRRSV-2 ; il montre l'importance du transfert d'anticorps neutralisants aux porcelets et introduit deux nouveaux sous-ensembles de cellules immunitaires chez les porcs : les cellules CD21 plus B productrices d'IFN et les cellules T CD8 −CCR7− CD4.

Mots clés:

vaccination maternelle; vaccin autogène inactivé; transfert d'immunité; réponse immunitaire humorale; réponse immunitaire à médiation cellulaire; cellules T; PRRSV; porc; cellules B productrices d'IFN; Cellules CD4 TEMRA.

1. Introduction

L'immunité d'origine maternelle (MDI) chez les mammifères est une symphonie impressionnante ("complexité harmonieuse" - [1]). Dans ce système, ou symphonie, une mère transfère une protection immunitaire (temporaire et/ou durable) à sa progéniture soit pendant la gestation par le placenta, après la naissance par les sécrétions mammaires, ou les deux [2] : les humains reçoivent des immunoglobulines pendant la gestation et éventuellement par voie mammaire. sécrétions [3] ; les chiens et les rongeurs reçoivent des immunoglobulines pendant la gestation et par les sécrétions mammaires, et les porcs et autres animaux d'élevage ne reçoivent des immunoglobulines que par les sécrétions mammaires.

Comme d'autres espèces, les porcelets reçoivent ce MDI sous forme d'immunoglobulines, de cellules immunitaires et d'autres molécules liées au système immunitaire [4,5]. Alors que les immunoglobulines peuvent être reçues de différentes truies (= adoption croisée), seules les mères biologiques peuvent réussir à transférer des cellules immunitaires à leur progéniture [5], et la quantité de colostrum ingérée chez les porcelets diminue considérablement la mortalité et améliore les performances [6 ]. Ces cellules immunitaires comprennent les lymphocytes B [7], ainsi que différents sous-ensembles de lymphocytes T - CD4, CD8 et principalement les récepteurs des lymphocytes T (TCR) - lymphocytes T δ [8].

Ces sous-ensembles de lymphocytes T peuvent ensuite être distingués en fonction de leur stade de différenciation et de leur modèle de ralliement. Chez le porc, la chaîne CD8 est utilisée pour différencier les lymphocytes CD8 − naïfs des lymphocytes T CD8 plus expérimentés en antigène ou mémoire [9–11]. L'expression du récepteur de chimiokines (CCR) 7 distingue en outre CCR7 plus la localisation des ganglions lymphatiques des cellules T CCR7− de localisation tissulaire périphérique [12]. Avec une analyse combinée CD8 / CCR7, nous pouvons alors distinguer plusieurs sous-ensembles différents de lymphocytes T : CD8 −CCR7 plus lymphocytes T CD4 naïfs, CD8 plus CCR7 plus lymphocytes T CD4 à mémoire centrale (TCM) et CD8 plus CCR7 − mémoire effectrice (TEM ) cellules T CD4 ; lymphocytes T CCR7- et lymphatiques CCR7 + CD8, et CD8 −CCR7−, CD8 plus CCR7−, et CD8 plus CCR7 plus TCR-δ T lymphocytes.
Bien que nous ayons précédemment signalé que les cellules T TCR-δ porcines possèdent un modèle de homing inverse par rapport à leurs homologues TCR-, le rôle spécifique de ces différents sous-ensembles n'a pas encore été décrit [13]. Les sous-ensembles de cellules immunitaires et les anticorps sont transférés à la progéniture pour les protéger contre divers agents pathogènes [4,5].

Pendant des décennies, l'agent pathogène le plus désastreux pour les porcs a été les virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (PRRSV, [14,15]). Il existe deux principaux types de PRRSV : les types 1 et 2 (PRRSV-1 et 2) ; leur grande diversité et leurs capacités immunosuppressives font du PRRSV une maladie problématique, entraînant d'énormes pertes économiques pour l'industrie porcine [16] et jusqu'à présent, alors que les vaccins offrent une protection partielle contre le PRRSV, ils n'ont pas été en mesure de contrôler complètement cette maladie.

Deux principaux types de vaccins sont disponibles pour protéger contre le PRRSV : les vaccins à virus vivants modifiés (MLV) et les vaccins inactivés, principalement les vaccins autogènes inactivés (VIA) ; cependant, les deux types font face à leurs défis.

La longue durée de développement des vaccins MLV très immunogènes signifie qu'ils sont généralement plus hétérologues aux souches de PRRSV répandues dans les élevages, et bien que les AIV soient dirigés contre ces souches répandues dans les élevages, leur nature inactivée les rend généralement moins immunogènes.

Ces défis conduisent à un manque de protection, en particulier chez les jeunes porcs, qui peut être attribué à trois facteurs : premièrement, le taux de mutation élevé du PRRSV limite la protection hétérologue, ce qui réduit l'efficacité du vaccin MLV ; deuxièmement, sa capacité immunosuppressive limite les vaccins plus faibles (par exemple, les AIV) et son retard dans l'induction d'une réponse immunitaire protectrice rend les jeunes porcs particulièrement sensibles [17] ; et troisièmement, notre compréhension de la réponse immunitaire au PRRSV, en particulier chez les porcelets, est limitée. Loving et Lunney ont produit une belle revue concernant la compréhension générale de la réponse immunitaire au PRRSV [18,19].

Principalement en raison du temps prolongé pour établir l'immunité induite par le vaccin contre le PRRSV, les producteurs de porcs vaccinent souvent les cochettes et les truies pour permettre le transfert de l'immunité aux porcelets. La recherche sur la vaccination maternelle à l'aide d'un MLV commercial contre le type PRRSV-1 n'a pas empêché la vaccination des porcelets âgés de 2 ou 3-semaines et a partiellement protégé les porcelets contre la provocation hétérologue [20]. Cette stratégie de vaccination a également induit des cellules sécrétant des IgG, des IgA et des interférons (IFN) spécifiques du PRRSV-1- dans le colostrum et le lait des truies vaccinées. Ces cellules productrices d'IFN sont très importantes dans les réponses antivirales, y compris dans le SDRP [19,21].
Cette vaccination a également induit des IgG sériques anti-SRRP, qui étaient détectables après l'âge de six semaines pour les porcelets non vaccinés et restaient stables chez les porcelets vaccinés avant l'épreuve ; pourtant, les cellules sécrétant de l'IFN n'ont pas pu être distinguées des niveaux de fond chez les porcelets pré-sevrés [22]. Alors que l'utilisation des MLV est une norme de l'industrie, un schéma de vaccination combiné d'une primo-vaccination MLV et d'une vaccination de rappel AIV semble prometteur pour surmonter chacun des inconvénients de l'utilisation indépendante des MLV et des AIV.

Par conséquent, l'objectif principal de cette étude était de déterminer non seulement si, mais aussi comment, la vaccination maternelle avec deux AIV différents (traitement (TRT) 1 plus 2) peut stimuler à elle seule une vaccination MLV standard de l'industrie (TRT 0 ), afin de mieux protéger la progéniture d'un défi PRRSV2 précoce. À cette fin, nous avons étudié la réponse immunitaire humorale et à médiation cellulaire (CMI) induite par le vaccin chez ces cochettes et nous avons testé des cochettes sevrées précocement au sein de chacun de ces groupes à l'âge de 2 semaines. La réponse immunitaire systémique et locale de ces porcelets a été suivie pendant 2 à 4 semaines.

Nous montrons que la vaccination de rappel AIV pourrait améliorer la protection des porcelets contre le challenge PRRSV à l'âge de 2 semaines et nous identifions également les mécanismes immunitaires sous-jacents et caractérisons la réponse humorale anti-SRRP et CMI chez ces jeunes porcs. De plus, nous avons détecté deux nouveaux types de cellules chez les porcs : (1) les cellules T CD8 −CCR7− CD4 qui contribuent fortement à la production d'IFN- dans le lavage bronchoalvéolaire (BAL) - cellules CD4 TEMRA potentielles, et (2) une source majeure de la réponse anti-SRRP surtout chez les porcelets - cellules B productrices d'IFN.

2. Matériels et méthodes

2.1. Conception de l'étude, animaux et traitement des échantillons

Le but de cette étude était d'évaluer l'effet de différentes séries de vaccination maternelle contre le PRRSV2 sur l'immunité protectrice des porcelets sevrés contre le PRRSV-2. Avant l'étude, une souche PRRSV -2 circulante (polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP), 1-7-4) d'une entreprise porcine de Caroline du Nord a été isolée et propagée par deux sociétés indépendantes de sciences biologiques ; ils ont produit deux vaccins autogènes distincts. Les deux vaccins contenaient des composants exclusifs différents, mais contenaient la même souche 1-7-4 PRRSV-2 inactivée. La conception de cette étude est illustrée à la figure 1.

Les deux vaccins ont été administrés par voie intramusculaire en une série de quatre doses avant la mise-bas : selon le calendrier de vaccination de l'entreprise porcine de Caroline du Nord, 46 cochettes PRRSV-2 négatives dans une ferme de truies commerciale ont été vaccinées avec le vaccin Ingelvac PRRS MLV (Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH, Allemagne) neuf semaines avant la reproduction. Pour maintenir une terminologie cohérente tout au long de cette étude, les porcs femelles sexuellement matures inscrits (définis ici comme cochettes) seront appelés cochettes même après qu'ils ont été élevés et ont donné naissance (communément appelés truies). Quatre semaines avant la reproduction, des échantillons de sang ont été prélevés sur toutes les cochettes pour le sérum, puis les cochettes ont été réparties en trois traitements : TRT 0 (vaccination MLV uniquement) ; TRT 1 (vaccination MLV plus 4 doses de vaccin 1 inactivé autogène (1-7-4) ); ou TRT 2 (vaccination MLV plus 4 doses de vaccin inactivé autogène (1-7-4) 2).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) et le titre sérique de neutralisation du foyer fluorescent (FFN) le plus élevé (critères immunitaires primaires) et la réponse IFN des lymphocytes T CD4 la plus élevée (critères immunitaires secondaires) contre la souche d'épreuve d'AIV au sein de leur groupe. Pour TRT 1 plus 2, ces titres FFN variaient de 1:4 à 1:128. Puisque TRT {{10}} n'avait aucun titre contre la souche AIV, nous avons choisi les cochettes avec les titres anti-MLV les plus élevés ; ces titres variaient de 1:16 à 1:32. La réponse IFN chez toutes les cochettes sélectionnées variait de 0 0,09 à 0,21 % du total des lymphocytes T CD4.

Chacune de ces cochettes a fourni quatre porcelets pour l'étude de provocation. À l'âge de 2 semaines (= 0 semaines après l'infection, wpi), les quatre porcelets ayant les poids de portée les plus moyens ont été sélectionnés pour l'étude de provocation et transportés dans les installations d'hébergement de niveau de biosécurité 2 de la North Carolina State University ( NCSU) Laboratory Animal Resources (LAR) (Raleigh, Caroline du Nord). Ici, ils ont été assignés au hasard à l'un des six enclos dans la même pièce; deux porcs par traitement étaient logés dans chaque enclos (un par cochette). En résumé, il y avait un total de 36 porcelets dans l'étude avec 12 porcelets par groupe de traitement.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106◦ F) et le manque de réponse à la stimulation physique. Ce porc a été inclus dans toutes les analyses jusqu'à la semaine 3 et ses poumons ont été évalués pour la pathologie. Aucune analyse de cytométrie en flux (FCM) n'a eu lieu pour cet animal à l'autopsie.

Un jour après le sevrage et l'arrivée au NCSU, tous les porcelets ont été inoculés par voie intranasale avec 1 × 105,5 PRRSV-2 particules virales (souche autogène 1-7-4) dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate 1X (PBS, Corning, Corning, NY, USA) (500 µL/narine), maintenus en décubitus dorsal pendant 30 secondes et retournés dans leurs enclos. La moitié des animaux ont été sacrifiés à 2 dpi et les animaux restants ont été sacrifiés à 4 dpi. À l'autopsie, le BAL, les poumons et les ganglions lymphatiques trachéobronchiques (LN TrBr) ont été prélevés et traités comme décrit précédemment [13].

L'échantillonnage a eu lieu avant l'inoculation (0 wpi) puis une fois par semaine, comme le montre la figure 1. Le sérum a été recueilli dans des tubes de tubes séparateurs de sérum (SST) (Becton Dickinson (BD) Biosciences, San Jose, Californie, États-Unis), et le sang pour l'isolement des PBMC a été recueilli dans des tubes d'héparine (BD Biosciences). Le logement des animaux était conforme au guide des National Institutes of Health pour les animaux de recherche. Les porcelets avaient un accès illimité à l'eau, étaient nourris avec un régime de sevrage transitoire, puis un régime régulier deux fois par jour, et maintenus à 83 °F avec un cycle lumière/obscurité de 12- heures. Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université d'État de la Caroline du Nord (IACUC) ID # 17-166 A (29 novembre 2017).

2.2. Propagation, titrage et évaluation des virus

L'isolat viral PRRSV-2 (souche, 1-7-4) a été propagé sur des macrophages alvéolaires porcins (PAM) négatifs au PRRSV dans du RPMI-1640, 1 x avec de la L-glutamine (Corning, Corning, NY , États-Unis) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (VWR, Radnor, PA, États-Unis) et d'un antibiotique-antimycotique 1X (Corning) (appelé RPMI-complet) pendant environ 30 h dans des flacons T-75 (Sarstedt, Nümbrecht, Allemagne) jusqu'à ce qu'un effet cytopathique soit observé. Les flacons ont été congelés-dégelés une fois et le surnageant a été centrifugé à 2200 g à 4°C pendant 10 min. Pour concentrer le virus, le surnageant a ensuite été transféré dans des tubes à centrifuger Nalgene de 36 ml (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) et centrifugé dans une ultracentrifugeuse Sorvall 100S (Sorvall, Thermo Fisher Scientific), Newtown, CT, USA) à 73 ,000 g à 4 ◦C pendant 2 h.

Le surnageant a été jeté et le culot a été remis en suspension dans du milieu (RPMI complet) et stocké dans des aliquotes de 100 µL à -80 °C. Les titres de dose infectieuse de culture tissulaire 50 (TCID50) des solutions mères virales ont été déterminés à l'aide de PAM comme décrit précédemment (méthode Spearman-Karber TCID50 selon le manuel des tests de diagnostic de l'OIE [Organisation mondiale de la santé animale, anciennement l'Office international des épizooties (OIE ), "Chapitre 2.8.7 Syndrome reproducteur et respiratoire porcin", Terr. Man., n° mai 2015, 2015].

2.3. virémie

Le sérum isolé a été analysé par le laboratoire de diagnostic de la société porcine de Caroline du Nord à l'aide d'une réaction en chaîne par polymérase quantitative à transcription inverse (RT qPCR) avec un kit d'ARN/ADN pathogène 5X MagMAX (Thermo Fisher Scientific) et un kit VetMAX PRRSV qPCR (Thermo Fisher Scientific). Le sérum de cochettes vaccinées était PRRSV-négatif (qPCR) à la mise-bas, comme déterminé par le laboratoire de diagnostic vétérinaire de l'Iowa State University (ISU VDL, Ames, IA, USA). Les valeurs ∆Ct ont été calculées en soustrayant la valeur Ct d'un échantillon de la valeur Ct considérée comme PRRSV-négative (Ctneg=37) pour PRRSV : ∆Ct=37 − Ctx.

2.4. Validation des anticorps neutralisants et détermination des échantillons positifs

Des échantillons de sérum de cochettes et de porcelets ont été expédiés au laboratoire de recherche et de diagnostic sur les animaux de l'Université d'État du Dakota du Sud (Brookings, SD) qui a effectué la détermination des anticorps neutralisants (NA) PRRSV-2 en utilisant le FFN et la souche d'inoculation 1-7-4. Un résultat positif est la dilution de sérum la plus élevée avec une réduction de 90 % ou plus du nombre d'unités de formation de foyers fluorescents [23].

2.5. Procédures d'autopsie, notation et isolement des cellules tissulaires

À l'autopsie (2 ou 4 wpi), les animaux ont été sacrifiés en utilisant une injection intraveineuse létale d'Euthasol (Covetrus, MW, 390 mg/mL de pentobarbital, 50 mg de phénytoïne/mL). Ensuite, les poumons, le thymus et les LN TrBr ont été récoltés.

Pour les poumons, des photos dorsales et ventrales ont été prises ; les poumons ont été rincés avec 1 × PBS pour recueillir le lavage alvéolaire bronchique (BAL) et cinq échantillons au total ont été prélevés pour l'histologie : un chacun des lobes caudaux droit et gauche, des lobes moyens droit et gauche, puis un du lobe accessoire. Les échantillons d'histologie ont été fixés dans un fixateur formaldéhyde / Zn (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) pendant 24 h, transférés dans de l'éthanol à 70% et colorés avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E). Les lames colorées (histologie) et les photos pulmonaires (pathologie macroscopique) ont été expédiées à l'ISU VDL et notées par un pathologiste diagnostique vétérinaire qui ne connaissait pas les traitements et les dates d'autopsie ; Les scores des lésions pulmonaires et des pneumonies interstitielles ont été réalisés comme décrit précédemment [24].

Les vues dorsale et ventrale des photos pulmonaires ont été évaluées pour le pourcentage de poumon atteint de pneumonie. Plus précisément, le pourcentage de pneumonie a été estimé visuellement pour chaque lobe pulmonaire, et le pourcentage total pour l'ensemble du poumon a été calculé sur la base de la proportion pondérée de chaque lobe par rapport au volume pulmonaire total. Chacun des quatre lobes cranioventraux représentait 10 %, le lobe accessoire 5 % et chacun des deux lobes caudaux représentait 27,5 % du poumon total.

Des coupes d'histopathologie pulmonaire ont été examinées à l'aveugle à la recherche de lésions microscopiques et chaque lobe a reçu un score estimé basé sur la gravité de la pneumonie interstitielle comme suit : 0=pas de lésions microscopiques ; 1=pneumonie interstitielle minime ; 2=pneumonie interstitielle légère ; 3=pneumonie interstitielle modérée ; 4=pneumonie interstitielle abondante ; 5=pneumonie interstitielle multifocale sévère ; 6=pneumonie interstitielle diffuse et sévère. Pour tous les tissus collectés (poumons, thymus et LN TrBr), le tissu a été coupé en petits morceaux et pressé à travers des crépines rondes en acier inoxydable (Grainger, Lake Forest, IL, USA) dans des tubes de 50 ml avec du PBS glacé pour éluer suspensions monocellulaires. Les amas fibreux ont été filtrés avec des filtres de 40 µm (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

2.6. Isolement du sang périphérique, stimulation virale et coloration/analyse IFN-FCM

L'isolement des PBMC a été réalisé à l'aide d'une centrifugation de densité Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, Suède) et de tubes SepMate -50 ml (STEMCELL Technologies, Vancouver, Colombie-Britannique, Canada) selon le protocole du fabricant. Les comptages de PBMC et de cellules en suspension de cellules individuelles ont été effectués sur un système de comptage de cellules CASY (Schärfe System, maintenant : Roche Innovatis AG, Bielefeld, Allemagne). Pour le test de production d'IFN, 5 × 105 PBMC et lymphocytes des poumons et des LN TrBr ont été étalés en huit répétitions dans une plaque 96-puits à fond rond (Corning) dans 100 µl de RPMI complet et reposés pendant la nuit dans un incubateur à 37◦ C et 5 pour cent de CO2. Le lendemain matin, 100 µL de RPMI-complet contenant la souche PRRSV 1-7-4 (Multiplicité d'infection, MOI=0.1) ont été ajoutés à chaque puits ; les plaques ont été remises à l'incubateur pour 24 h de stimulation virale.

Pendant les 4 dernières heures de culture, du monensin (5 µg/mL, Alfa Aesar, Haverhill, MA, USA) a été ajouté pour bloquer la libération d'IFN- par les cellules. À la fin de l'incubation de 24 h, les répliques ont été regroupées et colorées comme indiqué dans le tableau 1 ; en moyenne, 276 756 lymphocytes vivants (SLL) ont été enregistrés sur un Cytoflex à l'aide du logiciel CytExpert (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). L'analyse des données a été réalisée avec FlowJo version 10.6.1 (FLOWJO LLC). La hiérarchie de déclenchement pour l'analyse de la réponse IFN est illustrée aux figures 4 et 5 pour les PBMC et à la figure supplémentaire S1 et à la figure 7 pour le BAL, le tissu pulmonaire et les LN TrBr.

2.7. Analyses statistiques

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Graphpad Prism 8 (Graphpad Software, San Diego, CA, USA). Les données avec un ensemble complet de données ont été analysées par des ANOVA bidirectionnelles (tout au long de l'étude) ou unidirectionnelles (à l'autopsie). Les données avec des points de données manquants (principalement en raison de l'autopsie de 50 pour cent des porcs à 2 dpi) ont été analysées par un modèle à effets mixtes (Vraisemblance maximale restreinte, REML). Toutes les comparaisons multiples ont été réalisées avec le test de comparaison multiple de Dunnett. L'illustration des données a été réalisée à l'aide de tracés de violon montrant la distribution, les points individuels, la médiane (le cas échéant, ligne noire en pointillés) et les intervalles 25/75 (le cas échéant, ligne colorée). Des analyses de corrélation entre les niveaux de nAb chez les cochettes et les porcelets ont été effectuées à l'aide des coefficients de corrélation de Pearson et d'un intervalle de confiance bilatéral à 95 %.

3. Résultats

3.1. Conception de l'étude et efficacité du vaccin - Signes cliniques, virémie, prise de poids et pathologie pulmonaire

L'étude a été menée comme illustré à la figure 1. Lors de l'inoculation du PRRSV, les porcs ont présenté de légers symptômes de PRRSV commençant dans les 3 à 4 jours suivant l'infection - fièvre [principalement à 1 wpi, dns], léthargie, réduction de la consommation alimentaire, toux/éternuements légers. Aucune différence significative n'a été observée pour ces symptômes et ils ont persisté à des degrés divers jusqu'à l'autopsie. La figure 2 illustre la virémie, les gains de poids corporel hebdomadaires ainsi que les scores bruts et histopathologiques.

Comme le montre la figure 2A, tous les porcs étaient PRRSV -2 négatifs au sevrage et l'inoculation intranasale avec PRRSV -2 a induit une virémie qui a culminé à 2 wpi. Bien qu'il n'y ait pas de différence de virémie entre TRT 0 et TRT 2, TRT 1 avait une virémie significativement plus faible au cours des deux premières semaines que le groupe témoin TRT 0. Les gains de poids des porcs dans tous les groupes étaient très similaires pendant les trois premières semaines ; pourtant, à la fin de l'étude - et par rapport à TRT 0 - TRT 2 et TRT 1 avaient des gains de poids hebdomadaires significativement plus élevés - Figure 2B. Plus particulièrement, alors que la pathologie pulmonaire est généralement résolue dans l'infection par le PRRSV et était donc similaire entre les groupes à 4 dpi (dns), les deux vaccinations maternelles contre le VAI, donc TRT 1 plus 2, ont significativement réduit la pathologie pulmonaire à 2 wpi : les deux ont diminué les niveaux de pourcentage de lésions macroscopiques et/ou de pneumonie interstitielle (Figure 2C, D). La prévalence des lésions pulmonaires macroscopiques dans les poumons du TRT 0 était comprise entre 20 et 70 % ; en revanche, la plupart des porcs du TRT 1 plus 2 présentaient une prévalence de lésions pulmonaires inférieure à 20 % — Figure 2C. De même, alors que le score histopathologique médian pour la pneumonie interstitielle dans les poumons des porcs TRT 0 était de trois, il était de 1,8 pour le TRT 1 et de 1,2 pour le TRT 2, respectivement. Comparé à TRT 0, cela démontre une tendance à la signification (p=0.07) et une diminution significative de l'histopathologie pulmonaire chez les porcs issus de cochettes vaccinées contre l'AIV - Figure 2D. Ces données démontrent que la vaccination AIV peut réduire considérablement la virémie et la pathologie pulmonaire. En outre, elles montrent également que la vaccination maternelle AIV contre le PRRSV-2 peut renforcer l'immunité des porcelets âgés de 2-semaines.

3.2. Induction d'anticorps neutralisants maternels et leur transfert aux porcelets

L'induction de la réponse immunitaire humorale chez les cochettes et leur progéniture a été analysée en déterminant les titres NA FFN (figure 3).

La vaccination de tous les groupes avec les titres de NA induits par le MLV chez les cochettes entre quatre et 64 ans sans différences significatives entre les trois groupes (dns). En revanche, alors que la vaccination MLV seule (TRT 0) n'incluait pas d'AN contre la souche hétérologue 1-7-4, les deux vaccinations de rappel AIV induisaient des titres d'AN allant jusqu'à 1:16 (pour TRT 2) et même 1 :128 (pour TRT 1)—Figure 3A.

Ces NA sériques ont été transférés par la mère aux porcelets (Figure 3B) : alors que les porcelets TRT 0 n'ont montré aucun titre de NA à 0 wpi, les porcelets TRT 1 et TRT 2 possédaient des NA sériques à la souche 1-7-4 avant infection directement corrélée aux niveaux maternels de NA (Figure 3C, r=0.886, p <0.0001). Ces titres NA ont diminué au cours des deux premières semaines, avant de se stabiliser de 4 wpi. Pourtant, par rapport au TRT 0, les porcelets issus de cochettes vaccinées contre l'AIV (TRT 1 plus 2) avaient des titres sériques de NA significativement plus élevés déjà avant l'épreuve et ces titres accrus ont duré jusqu'à 2–3 wpi, donc jusqu'à 4–5 semaines d'âge—Figure 3B.

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