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Effets anti-âge médiatisés de l'extrait de Cistanche

Mar 29, 2023

ABSTRAIT:Cistancheest une herbe largement utilisée dans la médecine traditionnelle asiatique comme ingrédient dans des prescriptions complexes.Cistancheest connue pour saanti-leucémique,anti-oxydant, etpropriétés anti-inflammatoires. Cependant, sonanti-vasculairel'efficacité du vieillissement endothélial et les mécanismes sous-jacents ne sont pas entièrement compris. Dans cette étude, nous avons étudié les effets anti-vieillissement de Cistanche dans le modèle de vieillissement des cellules endothéliales (CE) induit par le glucose élevé (HG). Traitement avecCistanche(40 g/mL) ont augmenté la migration des CE et augmenté la phosphorylation des kinases extracellulaires régulées par le signal et de p38 de manière dose-dépendante. Suite au traitement HG (30 mM),Cistanche diminution significative du nombre de cellules positives à la galactosidase associées à la sénescence, qui sont les biomarqueurs du vieillissement, de manière dose-dépendante. Basé sur les niveaux de phosphorylation, Cistanche (40 ug/mL) a augmenté l'expression de la sirtuine1 (Sirt1) et de la monoxyde d'azote synthétase endothéliale (eNOS) de 74,4 % et 328,2 %, respectivement. De plus, le traitement des CE sénescentes induites par HG avec Cistanche (40 g/mL) a considérablement augmenté la production d'oxyde nitrique (P<0.05). Ces résultats démontrent que Cistanche augmente à la fois la migration des EC et régule la voie Sirt1/eNOS, suggérant que Cistanche a le potentiel de protéger les EC contre le vieillissement induit par HG.


Mots clés: anti-âge, des cellules endothéliales,Cistanche, Sirt1/eNOS

Cistanche anti-aing

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INTRODUCTION
La sénescence des cellules endothéliales vasculaires (CE) peut contribuer au développement de l'athérosclérose chez l'homme (Minamino et Komuro, 2007 ; Wu et al., 2019). Beaucoup
des études ont montré qu'une glycémie élevée (HG) peut induire le vieillissement de la CE (Matsui-Hirai et al., 2011 ; Hayashi et al., 2014 ; Lin et al., 2019). De plus, les dysfonctionnements de la CE peuvent conduire à
carence en oxyde nitrique (NO) (Thoonen et al., 2015). Le NO est synthétisé à partir de la L-arginine par la NO synthase, dont il existe trois isoformes importantes : nitrique endothéliale

oxyde synthase (eNOS), NOS neuronale et NOS inductible (iNOS). Par exemple, il a été démontré que eNOS joue un rôle vital dans le développement de complications cardiovasculaires diabétiques en exacerbant le stress oxydatif (Kayama et al., 2015). De plus, la sirtuine1 (Sirt1), une histone désacétylase dépendante de la nicotinamide adénine dinucléotide (NAD plus), est impliquée dans la régulation du métabolisme, de la survie cellulaire, de la différenciation et du vieillissement. Sirt1 est un régulateur clé du vieillissement EC vasculaire. Des études antérieures ont montré que l'activation de Sirt1 peut protéger contre les dysfonctionnements endothéliaux vasculaires, tout en contrôlant la génération d'eNOS (Hu et al., 2017).


CistancheThunberg, membre de la famille des Saururaceae, est une herbe utilisée pour la guérison traditionnelle en Asie du Sud-Est. Récemment, Cistanche s'est avéré être une riche source de polysaccharides et de flavonoïdes naturels (Lu et al., 2006a). Par conséquent, Cistanche est utilisé pour la stimulation immunitaire et la chimiothérapie en médecine alternative. De plus, Cistanche présente diverses propriétés pharmacologiques, telles que des propriétés anti-leucémiques (Chang et al., 2001), antioxydantes (Hsu et al., 2016) et anti-inflammatoires (Luet al., 2006b). Plusieurs études ont étudié Cistanche, cependant, seules quelques-unes ont évalué le rôle de Cistanche dans la prévention du vieillissement EC. À notre connaissance, il s'agit de la première étude à montrer les effets suppresseurs de Cistanche sur le vieillissement dans un modèle de vieillissement induit par HG. Ceci a été réalisé en utilisant des CE de veine ombilicale humaine et en évaluant les mécanismes sous-jacents.

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MATÉRIELS ET MÉTHODES
Réactifs
Cistanchea été obtenu auprès du Dr Park de l'Université de Kyungnam, où il a été extrait, séparé et soumis à un contrôle qualité, comme décrit précédemment (Shon et al., 2014).3-(4,5-Diméthylthiazol{ Le {4}}yl)-2, le 5-bromure de diphényltétrazolium (MTT) et la gélatine ont été achetés auprès de Sigma Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Le kit de -galactosidase associée à la sénescence (SA--gal) a été acheté chez Abcam (Cambridge, Royaume-Uni) et le kit de dosage du NO a été acheté chez Thermo Fisher Scientific (Vienne, Autriche). Les anticorps p-p38, p-Sirt1 et p-eNOS ont été achetés auprès de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, États-Unis), et les anticorps -actine et p-extracellular signal-regulated kinases (p-ERK) ont été achetés auprès de Santa CruzBiotechnology (Dallas, Texas, États-Unis). Les anticorps anti-souris et anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) ont été achetés auprès de GeneTex Inc. (Irvine, CA, USA).


Culture CE

Des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine ont été obtenues auprès de l'American Type Culture Collection (Manassas VA, USA). Les cellules ont été cultivées à 37 °C avec un milieu de croissance endothélial à 5 % de CO2-2 (EGM-2 ; Lonza, Walkerville, MD, États-Unis) complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS). Les CE ont été cultivées pendant 48 h à 37 °C avec 5 % de CO, dans un milieu EGM-2 (témoin) ou HG 30 mM, avec ou sans l'ajout de différentes concentrations de Cistanche (1 040 ug/mL).


Essai de viabilité cellulaire

Les cellules ont été cultivées à 37 °C pendant 72 h dans un milieu EGM-2 additionné de 2 % de FBS et de diverses concentrations de Cistanche, et ont été traitées avec une solution de MTT pendant 4 h. Les dépôts de formazan résultants ont été dissous avec du diméthylsulfoxyde, où l'absorbance a été mesurée à 570 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques VersaMax ELISA (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA).


Test de migration par grattage

Les cellules ont été blessées, puis le milieu de culture a été remplacé par du milieu frais contenant diverses concentrations de Cistanche. Les cellules ont été maintenues pendant 24 à 48 h. En pleine migration, les cellules ont été imagées à l'aide d'un microscope (Olympus Optical Co, Ltd., Tokyo, Japon). Les cellules migrées ont été comptées à l'aide d'un microscope optique à un grossissement de 200x et quantifiées manuellement


Coloration SA-P-gal

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 cellules comptées à l'aide de trois champs indépendants.


Analyse Western blot

Les cellules ont été récoltées et lysées dans une solution d'extraction de protéines (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Corée) contenant des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (10 min à 4'C). Les concentrations de protéines totales dans les surnageants ont été mesurées en utilisant des dosages de Bradford. Après chauffage à 95 degrés pendant 5 min, les échantillons de protéines (30 ug) ont été séparés par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 8 ~ 12%. Les protéines ont ensuite été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (MilliporeBedford, MA, USA) à 100 V pendant 60 min. Les membranes ont été incubées dans de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) complétée par du TBS à 0,05 % avec du Tween-20 (TBST) (30 min à température ambiante), puis incubées dans de la BSA à 5 % dans TBST additionné d'anticorps primaires (1:200 à l,000) (une nuit à 4'C). Ensuite, les membranes ont été inoculées avec des anticorps anti-lapin ou anti-souris de chèvre conjugués à la HRP (1: 5, 000) pour h, et les bandes de protéines ont été détectées à l'aide d'un kit de détection de chimiluminescence amélioré (Intron Biotechnology, Inc. ) et un imageur LAS-1000 (Fuji Film Corp., Tokyo, Japon). L'analyse semi-quantitative des résultats de densitométrie a été réalisée à l'aide de l'image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD USA).

Mesure de la production de NO Les concentrations de NO ont été déterminées en détectant la concentration de nitrite à l'aide de kits de dosage de NO, conformément aux instructions du fabricant. Les densités optiques ont été déterminées à 560 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques et les concentrations ont été calculées à l'aide d'une courbe d'étalonnage


analyses statistiques

Les résultats sont exprimés sous forme de moyenne plus écart type (SD). La signification statistique a été déterminée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Des comparaisons post hoc entre les groupes ont été effectuées à l'aide de tests de comparaisons multiples de Bonferroni. Tous les calculs ont été effectués à l'aide de SPSS sous Windows (v.23.0 ; IBM Corp, Armonk, NYUSA) et les valeurs P<0.05 were considered statistically significant.

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RÉSULTATS ET DISCUSSION

Cytotoxicité des cistanches

Pour déterminer la cytotoxicité de Cistanche sur les CE, les cellules ont été incubées avec différentes concentrations de Cistanche (0 à 100 ug/ml) pendant 72 h. Cistanche a montré une cytotoxicité significative (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml à tous les points de traitement (Fig. 1). Par conséquent, les concentrations de Cistanche de<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.



Cistanche augmente la migration cellulaire.

La voie de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) régule les processus clés impliqués dans le développement des CE vasculaires, tels que la prolifération cellulaire, l'invasion, les métastases et la survie, et l'angiogenèse (Pišlar et al., 2015). Le MAPK implique ERK, la kinase N-terminale c-Jun et p38 (Kim et Choi, 2010). ERK et p38 sont des protéines de signalisation importantes impliquées dans la cicatrisation des plaies, tandis que ERK joue un rôle important dans le contrôle de la migration, de la prolifération, de la différenciation et de la survie des cellules (Roskoski, 2012). Dans une étude récente, il a été suggéré que la voie de signalisation p38 MAPK était impliquée dans la cicatrisation des plaies (Loughlin et Artlett, 2011 ; Kim et al., 2019 ; Wang et al., 2019). Dans la présente étude, nous avons examiné l'expression protéique de ERK et p38 pour identifier les voies de signalisation impliquées dans la migration CE régulée par Cistanche. Le traitement Cistanche (40 g/mL) a augmenté la migration des CE de 1,5- fois par rapport au témoin (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5- fois plus élevé que le contrôle (P<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

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Fig. 1.Les effets deCistanche(Cistanche) sur la viabilité cellulaire. Les cellules ont été traitées avec Cistanche (0 à 100g/ml) pendant 72h. Viabilité cellulairea été calculé comme le pourcentage de cellules viables cultivées dans leabsence de Cistanche. Les résultats montrent la moyenne ± SD. *P<0.05.


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Fig. 2.Les effets deCistanche(Cistanche) sur la migration cellulaire. (A) Des images représentatives montrent la migration du contrôle et du traitement Cistanchecellules. La migration cellulaire a été exprimée en pourcentage de migration observée pour les cellules témoins. (B) Taches représentatives des niveauxdes kinases régulées par le signal p-extracellulaire (p-ERK) et la phosphorylation de p-p38. Analyse quantitative de p-ERK/-actine et p-p38/-actine. Les résultats montrent la moyenne ± SD. *P<0.05 and **P<0.01.


Cistanche régule la phosphorylation de ERK et p38 d'une manière dépendante de la concentration. À partir de ces résultats d'activation de ERK et de p38 MAPK, nous avons conclu que Cistanche induit la migration des CE et améliore sa fonction dans la fermeture des plaies.

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Cistanche supprime le vieillissement dans les EC induits par HG.

Pour étudier les effets inhibiteurs de Cistanche sur le vieillissement EC, les cellules ont été traitées avec du glucose (30 mM) et diverses concentrations de Cistanche (10 à 40 g/mL). Une tendance au vieillissement retardé a été notée après un traitement avec des concentrations croissantes de Cistanche. En particulier, le traitement avec 40 g/mL de Cistanche a considérablement réduit l'abondance du biomarqueur de vieillissement (cellules positives SA--gal) de 10,2 % par rapport aux cellules du groupe témoin (31,5 %) (P<0.01) (Fig.3A). To determine if Cistanche regulates expression of Sirt1, a protein that regulates aging, phosphorylation of Sirt1 and eNOS was investigated following treatment with Cistanche. We showed Cistanche (20 and 40 g/mL) significantly increased the expression of Sirt1 by 58.5% and 74.4%, respectively, compared with cells in the control group (P<0.05). Following treatment with 40 g/mL Cistanche, expression of eNOS was also significantly increased by over 3-fold Cistanche compared with the control group (P<0.01) (Fig. 3B). Moreover, treatment with 40 g/mL Cistanche significantly increased NO production (P<0.05) in HG-induced aged ECs (Fig.3C).

Suite à un traitement avec des concentrations élevées de glucose, nous avons observé un grand nombre d'EC exprimant le biomarqueur de vieillissement SA--gal, un régulateur majeur de HG-in
vieillissement réduit (Sun et al., 2015). Dans des études antérieures, il a été rapporté que l'activation d'eNOS contrôlait les retards du vieillissement cellulaire induits par le NO dans les CE humaines (Hayashi et al., 2008 ; Lee et al., 2017). Par conséquent, la stimulation de la production de NO peut protéger les cellules contre le stress oxydatif et réduire le temps de récupération. Dans cette étude, le traitement des EC traités par HG avec 40 g/mL de Cistanche a augmenté de manière significative les niveaux de NO, ce qui suggère que Cistanche améliore la cicatrisation des plaies médiée par les EC, et pourrait donc être utilisé pour traiter le vieillissement des EC induits par HG en médiant le Voie Sirt1/eNOS.


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Fig. 3.Les effets deCistanche(Cistanche) sur le vieillissement des cellulescultivées dans un milieu riche en glucose (HG) (30 mM). (UN)Images représentatives de la sénescence associée-galactosidase
(SA--gal) cellules positives (bleues) après culture dans des milieux contenant HG, ou HG et Cistanche (10 à 40g/ml) pendant 48h. Le nombre de SA--gal cellules positives sont exprimées en pourcentage de celles du groupe témoin. (B) Transferts représentatifs montrantniveaux de phosphorylation de p-Sirt1 et p-eNOS. Phosphorylationa été quantifié par rapport à-actine. (C) Production de NO dans les celluleschaque groupe de traitement. Les résultats montrent la moyenne ± ET de cinq dansexpériences dépendantes. *P<0.05 and **P<0.01.

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REMERCIEMENTS

Cette étude a été financée par la subvention de la Kyungnam University Foundation, n° 20170139.


DÉCLARATION DE DIVULGATION DE L'AUTEUR

L'auteur ne déclare aucun conflit d'intérêt.


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