La metformine améliore la souche des cellules souches humaines dérivées du tissu adipeux par modulation à la baisse

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Résumé:Le tissu adipeux joue un rôle important dans la régulation de l'homéostasie métabolique en stockant l'excès de graisse et en protégeant les autres organes de la lipotoxicité. Le vieillissement est associé à une redistribution centrale des graisses, aboutissant à une diminution des sous-cutanés sensibles à l'insuline et à une augmentation des dépôts adipeux viscéraux insulino-résistants. Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) jouent un rôle important dans la régénération du tissu adipeux. Les ASC âgés présentent une diminution de la souche et du potentiel de régénération en raison de l'accumulation de stress oxydatif et des dommages cellulaires liés au dysfonctionnement mitochondrial. La metformine est un médicament antidiabétique bien établi qui a montré des effets anti-vieillissement dans différents organismes et modèles animaux. Dans cette étude, nous avons analysé l'effet du traitement à la metformine sur la souche des ASC humains dans des modèles de culture cellulaire et de culture de tissu adipeux entier. Nos résultats démontrent que la metformine améliore la souche des ASC, réduisant leur taux de prolifération et de différenciation des adipocytes. En étudiant le mécanisme sous-jacent possible, nous avons observé une diminution de l'activité mTOR et ERK dans les ASC traités à la metformine. De plus, nous avons observé une augmentation de l'activité d'autophagie lors du traitement par la metformine. Nous concluons que le traitement à la metformine améliore la souche des ASC en réduisant la signalisation mTOR et ERK et en améliorant l'autophagie. Les futures évaluations in vivo dans des modèles animaux et humains ouvriront la voie à l'adaptation clinique de ce médicament bien établi pour raviver le caractère souche des cellules souches âgées.

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Mots clés:cellules souches adipeuses; tissu adipeux; tige; différenciation; prolifération; metformine ; mTOR ; ERK ; autophagie

1. Introduction

Le tissu adipeux est un organe dynamique qui joue un rôle homéostatique important dans la régulation de l'équilibre des nutriments, de la sensibilité à l'insuline et de la modulation immunitaire. Le tissu adipeux remplit ce rôle en stockant et en oxydant les acides gras en excès, prévenant ainsi la stéatose et la lipotoxicité dans d'autres organes [1]. La résistance à l'insuline associée à l'âge est la maladie métabolique la plus répandue. Environ 25 % de la population américaine de plus de 65 ans souffre de diabète, ce qui entraîne des taux de mortalité plus élevés, un état fonctionnel réduit, un risque accru d'hospitalisation et un fardeau excessif pour l'économie de la santé [2]. Bien que l'association entre diabète et obésité soit reconnue depuis longtemps, le lien entre le vieillissement et le diabète de type 2 reste insaisissable [3]. La première observation reliant la baisse de la tolérance au glucose au vieillissement date de 1921 [4]. Plusieurs études ont depuis identifié une sensibilité réduite à l'insuline comme la principale cause de l'altération du métabolisme du glucose liée à l'âge [5,6]. Sur la base de la localisation anatomique, le tissu adipeux peut être largement subdivisé en deux dépôts : les dépôts adipeux sous-cutanés et viscéraux. L'emplacement et la fonction du dépôt de tissu adipeux sont importants en termes de sensibilité à l'insuline ; par exemple, le dépôt viscéral est plus résistant alors que le dépôt sous-cutané est plus sensible à l'insuline [7]. Une perte progressive liée à l'âge du volume de tissu adipeux sous-cutané entraîne une réduction de l'absorption de glucose et de lipides, entraînant un débordement lipidique et un dépôt ectopique de lipides dans le muscle et le foie, contribuant au développement de la résistance à l'insuline [8].

Le tissu adipeux est composé de différents types de cellules. La digestion enzymatique du tissu adipeux par la collagénase produit deux fractions principales : la fraction adipocytaire et la fraction stromale vasculaire (FSV)[9]. La SVF comprend les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC), les lymphocytes, les cellules endothéliales, les péricytes et les fibroblastes [10]. Les ASC sont définis de manière immuno-phénotypique comme des cellules CD34 plus CD90 plus CD29 plus CD45-CD31 d'origine mésenchymateuse, présentant des capacités de différenciation tri-lignée en os, cartilage ou graisse [11,12]. Dans les tissus adipeux blancs, ces cellules résident principalement dans le stroma vasculaire autour des petits vaisseaux sanguins et peuvent proliférer et se différencier en adipocytes [11]. Les cellules souches dérivées du tissu adipeux (ASC) jouent un rôle important dans la régénération du tissu adipeux en subissant la prolifération, l'auto-renouvellement et la différenciation. Le vieillissement est associé à la perte de ces propriétés de souche dans les ASC [13,14]. On pense qu'une diminution liée à l'âge de la taille du dépôt de graisse sous-cutanée est due à une réplication et à une différenciation altérées des ASC [15-17]. Findisen et al. suggèrent une accumulation de stress oxydatif dans le tissu adipeux au cours du vieillissement, ce qui a un impact négatif sur la capacité de différenciation ; [15] cependant, le ou les mécanismes exacts sous-jacents à la perte de la souche dans les ASC ne sont pas compris. Des études récentes ont montré qu'une autophagie réduite, une cible mécaniste plus élevée de l'activité de la voie de la rapamycine (mTOR) et l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont liées à la perte de tige dans les ASC et à l'induction prématurée de la sénescence dans les ASC [18-20].

Cistanche peut anti-âge

La metformine est un médicament antidiabétique couramment utilisé pour abaisser la glycémie et améliorer la sensibilité à l'insuline. Il peut être utilisé pour traiter une variété de troubles métaboliques liés au vieillissement, comme les maladies cardiovasculaires, les cancers et le déclin cognitif [21,22]. Les effets d'amélioration de la longévité de la metformine ont été démontrés chez les vers, les souris et les rats par une restriction alimentaire, qui imite l'effet de la stimulation de l'activité de la protéine kinase activée par l'adénosine monophosphate (AMPK) [23]. Diverses études ont montré que la metformine inhibe la cible mammifère de la rapamycine (mTOR) [24,25]. Les voies de signalisation AMPK-mTOR régulent spécifiquement les caractéristiques des homéostases cellulaires, telles que l'autophagie, la prolifération, le métabolisme énergétique et la synthèse des protéines [26]. Il a été démontré que la metformine inhibe la prolifération, la différenciation et l'inflammation, réduit le stress oxydatif et le potentiel mitochondrial et améliore la souche globale dans différents types de cellules souches adultes [27,28]. L'effet de la metformine sur le métabolisme et la souche des ASC in vitro et in vivo n'est pas clair.

Dans cette étude, nous avons utilisé la culture 2D d'ASC humains et l'ensemble des techniques de culture de tissu adipeux humain pour simuler l'organisation cellulaire in vivo et le microenvironnement tissulaire. À l'aide de ces modèles expérimentaux, nous avons étudié l'effet du traitement à la metformine sur la différenciation, la prolifération et la souche des ASC et étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans ces processus cellulaires.

2. Matériels et méthodes

2.1.Spécifications du donneur

Du tissu adipeux a été prélevé sur cinq donneuses non diabétiques âgées de 39 ± 13 ans et ayant un IMC de 27 ± 4 subissant des interventions de chirurgie plastique électives au centre médical de l'Université de Pittsburgh (UPMC). La procédure de collecte de tissus a été approuvée par le comité d'examen institutionnel de l'Université de Pittsburgh (IRB No.0511186).

2.2. Isolement et culture des ASC humains

Les cellules précurseurs adipeuses ont été isolées comme suit [19, 29]. Les biopsies de tissu adipeux après les interventions chirurgicales ont été transférées au laboratoire dans un récipient scellé stérile. Le tissu a été rincé avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), suivi de l'élimination du matériel fibreux et des vaisseaux sanguins par dissection. Le tissu a été coupé en morceaux (1-2 mg) et digéré dans un tampon de digestion (HBSS contenant 200 collagénases U/mL (CLS Type II, Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NI , États-Unis) et 2 % sans BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis)) sous agitation pendant 60 min à 37 degrés ; 1 mg de tissu adipeux/3 mL de tampon de digestion. Le tissu dispersé a été centrifugé pendant 10 min à 200 x g à température ambiante. Les adipocytes flottants ont été aspirés et les cellules granulées de la fraction vasculaire stromale (SVF) ont été mises en suspension dans un tampon de lyse des érythrocytes (0,155 M NH4CI, 5,7 mM K2HPO4, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) et incubées pendant 10 min à température ambiante. Pour éliminer les débris tissulaires, la suspension cellulaire a été filtrée à travers un filet en nylon (taille des pores 100 um; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Après une autre étape de centrifugation (10 min à 200 x g), le culot de SVF a été mis en suspension dans du milieu ASC (milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM)/milieu F-12 (1:1) avec HEPES et L-glutamine (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）, complété avec 33 μM de biotine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 17 μM de pantothénate (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), 10 ng/mL d'EGF, 1 ng/mL de bFGF, 500 ng/mL d'insuline, 2,5 % de sérum bovin fœtal et 12,5 μM/mL de gentamicine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) et ensemencés à une densité de 50 000 cellules /cm2 en flacons T175.

Après avoir atteint 70 % de confluence, les cellules ont été lavées avec du PBS et trypsinisées à l'aide d'une solution à 0,05 % de trypsine-EDTA 1x (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). La trypsine a été inactivée par addition de milieu ASC plus 10 % de FBS et éliminée par centrifugation à 300 x g pendant 5 min avant que les cellules ne soient ensemencées à une densité de 5 000 cellules/cm². Les ASC ont de nouveau augmenté jusqu'à 70 % de confluence avant de se diviser. Les ASC dans les passages 3-4 ont été utilisés dans cette étude. Les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de metformine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), de rapamycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ou d'inhibiteur U0126 selon le schéma expérimental.

2.3. Différenciation adipogénique

Pour l'induction de l'adipogenèse, les ASC ont été ensemencées à une densité de 50,000 cellules/cm² dans des 6-plaques de culture cellulaire à puits. L'adipogenèse a été induite à l'aide d'un milieu de différenciation, composé de 0.2 uM d'insuline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA),0.5 mM de 1-méthyl{{9 }} isobutylxanthine （IBMX） （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）, 0,25 μM dexaméthasone （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA） et 10 ug/mL de transferrine （Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) dans ASCmedium. Après 3 jours de différenciation, le milieu a été changé, et les cellules ont été cultivées dans le milieu de différenciation sans IBMX pendant 14 jours.

2.4.Culture de tissu adipeux

La culture de tissu adipeux a été réalisée dans des plaques de culture cellulaire 6-puits, avec quelques modifications, comme publié par Harms et al. [30]. Le tissu adipeux entier a été coupé en morceaux plus petits 3-5 mm et cultivé dans un milieu de culture cellulaire de 5 ml. Des passoires cellulaires avec une taille de pores de 70 μM ont été conservées sur les fragments de tissu pour maintenir le tissu immergé dans le milieu. Les fragments de tissu ont été digérés avec de la collagénase, comme expliqué ci-dessus pour la procédure d'isolement des ASC, et le SVF a été analysé pour l'expression des gènes de souche associés aux ASC.

2.5. Coloration au rouge d'huile O

Pour la visualisation des gouttelettes lipidiques, les cellules ont été fixées avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 1 h et colorées avec 0.3 % Oil Red O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) dans de l'isopropanol/eau ( 60:40) pendant 1h. Le lavage final a été effectué deux fois avec de l'eau distillée. Pour la quantification de l'Oil Red O absorbé, la tache a été éluée avec de l'isopropanol (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) et la densité optique a été mesurée à 518 nm.

2.6. Coloration corporelle

Au jour 14 après l'induction de l'adipogenèse, les cellules ont été colorées avec Bodipy (Invitrogen, Waltham, MA, USA) et Hoechst (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) pendant 30 min à 37 degrés. Les images ont été acquises au microscope à fluorescence et analysées avec le logiciel ImageJ.

2.7. FlouCytométrie

Les ASC du troisième passage ont été utilisés pour des analyses de cytométrie en flux pour l'expression de surface de CD29 (Biolegend, San Diego, CA, USA), CD90 (Biolegend, San Diego, CA, USA), CD45 (BD, Franklin Lakes, NJ, USA) , CD24 (Biolegend, San Diego, Californie, États-Unis) et CD31 (BD, NJ, États-Unis). Les cellules ont été trypsinisées, lavées avec du PBS et colorées avec des anticorps dans un tampon de coloration FACS (1 % de BSA dans du PBS). Des ASC non colorées ont été utilisées comme contrôle. Le signal fluorescent a été mesuré à l'aide d'un cytomètre en flux (Fortessa, BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis) et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo (BD, Franklin Lakes, NJ, États-Unis).

2.8. Différenciation ostéogénique

Les ASC ont été cultivés jusqu'à confluence dans des plaques {{0}}puits et la différenciation ostéogénique a été induite à l'aide d'un milieu ostéogénique (DMEM 10 % FBS, 0,1 uM de dexaméthasone, 10 mM de phosphate de glycérol et 50 μM d'acide ascorbique). Au jour 21 après la différenciation, les cellules ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et colorées avec du colorant rouge alizarine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). a été réalisée à l'aide du logiciel Image J.

2.9.Détection de l'apoptose par coloration à l'annexine V-APC/PI

La mort cellulaire apoptotique a été mesurée à l'aide d'un kit Annexin V-APC/PI (Biolegend, San Diego, CA, USA). Un total de 10,000(cellules/puits) ASC ont été ensemencés sur des plaques 6-puits et incubés à 37 degrés avec 5 % de CO2. Les cellules ont été traitées avec de la metformine (0.25 mM, 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM et 5 mM)(Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA). Après 72 h de traitement, les cellules ont été collectés par trypsinisation et colorés avec 2,5 μL d'AnnexinV-APC et 2,5 μL de tampon de liaison PIin, incubés dans l'obscurité à température ambiante pendant 15 à 20 min et analysés par cytométrie en flux (Fortessa, BD, NJ, USA).

2.10.Détection des espèces réactives de l'oxygène

Les niveaux de ROS ont été déterminés à l'aide d'une sonde de colorant fluorescent 2',7'-dichlorofluorescéine diacétate (DCFH2-DA) (Invitrogen, Waltham, MA, USA). Les ASC (10, 000 cellules/puits) ont été cultivées dans une plaque à puits 6- et incubées avec de la metformine (5 mM) à 37 degrés, 5 % de CO, pendant 72 h. Après incubation, les ASC ont été trypsinisées et colorées avec un colorant DCFH2-DA 50 μM pendant 30 min à 37 degrés et analysées à l'aide d'un microscope à fluorescence.

2.11. Coloration TMRM

Les ASC (10, 000 cellules/puits) ont été cultivées dans une plaque à puits 6-, traitées avec différentes doses de metformine (5 mM) pendant 72 h et incubées à 37 degrés avec 100 nM de TMRM (Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, USA) pendant 30 min à 37C. Après incubation, les cellules ont été observées au microscope à fluorescence. Image] a été utilisé pour quantifier la fluorescence des images microscopiques.

2.12. Expression quantitative des gènes par RT-PCR

L'ARN total a été isolé avec le kit RNeasy Micro (Qiagen, Hilden, Allemagne) et la synthèse d'ADNc a été réalisée avec le kit de synthèse d'ADNc RevertAid First Strand (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les amorces spécifiques au gène ont été achetées chez Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA. L'analyse quantitative de l'expression a été réalisée à l'aide de Quantstudio 3 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). La quantification de l'ARNm a été réalisée en utilisant -actine pour la normalisation. Les données pour chaque transcrit de gène ont été normalisées en calculant la différence (ACt) entre les gènes Ct-housekeeping et Ct-Target. L'augmentation ou la diminution relative de l'expression a été calculée en comparant le gène de référence au gène cible (AACT) à l'aide de la formule d'expression relative (=24ACt).

2.13. Western Blot

L'analyse Western blot a été réalisée essentiellement comme décrit [19]. La méthode utilisée pour normaliser les taux de protéines était le "Pierce BCA Protein Assay Kit" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les lysats cellulaires (15 ug de protéines totales par piste) ont été préparés dans un tampon d'échantillon de dodécylsulfate de sodium (SDS), séparés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Les anticorps suivants ont été utilisés : souris anti-human -actin (Proteintech, IL, USA), périlipine (Cell Signaling, MA, USA), phosphore-P70S6K(Cell Signaling, MA, USA), total P70S6K(Cell Signaling, MA, USA), pERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), total ERK1/2 (Cell Signaling, MA, USA), conjugué anti-souris IgG HRP (Proteintech, IL, USA) et lapin anti-rat IgG HRP( Proteintech, Illinois, États-Unis). Le logiciel Image J a été utilisé pour les analyses densitométriques. 2.14.Analyse statistique

Des analyses statistiques ont été effectuées dans GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., La Jolla, Californie, États-Unis). FlowJo a été utilisé pour l'analyse FACS. La signification de la différence entre les moyennes a été évaluée par le test t de Student ou l'analyse de la variance. L'erreur nue est représentée par la moyenne ± SEM. Les valeurs étaient significatives aux valeurs p de<><0.01 and=""><>

3. Résultats

La metformine est un médicament antidiabétique bien établi qui joue un rôle important dans l'allongement de la longévité [31]. Pour étudier l'effet du traitement à la metformine sur la souche des cellules souches dérivées du tissu adipeux, nous avons isolé les ASC du tissu adipeux de donneurs humains par digestion à la collagénase. Les CSA isolés étaient adhérents au plastique et présentaient une morphologie fibroblastique ou en forme de fuseau. L'analyse par cytométrie en flux a montré que les ASC étaient positifs pour les marqueurs de cellules souches mésenchymateuses, tels que CD29, CD90 et CD24, mais négatifs pour le marqueur de lignée hématopoïétique CD45 et le marqueur de lignée endothéliale CD31 (Figure 1A). En plus d'afficher le phénotype ASC typique, les ASC ont montré un potentiel de différenciation adipogénique et ostéogénique robuste, identifié par la coloration Bodipy et Alizarin Red S, respectivement (figure 1B).cistanche แอ ม เว ย์Les ASC caractérisées ont été utilisées pour d'autres expériences dans notre étude.

Il a été rapporté dans la littérature que la metformine réduit la différenciation adipogénique des cellules souches. Notre objectif est d'explorer la régulation de la différenciation adipocytaire des ASC lors d'un traitement à la metformine. Les ASC ont été traités avec 1, 2, 5 et 5 metformine à partir de 2 jours avant l'induction adipogénique et tout au long du processus de différenciation. Bodipy et Oil Red Ostains ont été utilisés pour visualiser les gouttelettes d'huile au jour 14 après l'induction de la différenciation. Les résultats de la coloration Oil Red O (Figure 1C) et Bodipy (Figure 1D) révèlent que le traitement à la metformine inhibe de manière significative la différenciation adipogénique de manière dose-dépendante par rapport aux cellules témoins. L'inhibition de la différenciation adipogénique a été en outre confirmée à l'aide d'une analyse Western blot de la périlipine, protéine marqueur de la différenciation adipocytaire. Pour cela, des lysats cellulaires ont été collectés à partir de cellules différenciées au jour 14 de la différenciation adipogénique, et l'expression de la périlipine a été analysée. Nos résultats de Western blot montrent une régulation à la baisse significative de l'expression de la périlipine lors du traitement à la metformine au cours de la différenciation adipogénique (Figure 1E), qui est corrélée à la diminution des taches Bodipy et Oil Red O. Nous concluons que le traitement à la metformine inhibe la différenciation adipogénique des ASC humains, l'ampleur de l'inhibition étant positivement corrélée à la dose de traitement à la metformine.

Des taux de différenciation et de prolifération plus élevés entraînent une perte de souche. Puisque nous avons observé que la metformine réduit la différenciation adipogénique, nous nous sommes intéressés à étudier l'effet du traitement à la metformine sur la prolifération des ASC in vitro. Les ASC ont été traités avec de la metformine et les cellules ont été comptées au jour 4 après la culture en présence ou en l'absence de metformine. D'après nos résultats, nous avons observé que la metformine diminue significativement le taux de prolifération cellulaire par rapport aux ASC témoins (figure 2A). Les cellules souches jouent un rôle important dans la régénération et l'entretien des tissus.combien de cistanche prendrePour remplir efficacement leur rôle régénérateur, les cellules souches doivent conserver leur caractère souche. Nous avons analysé l'effet du traitement à la metformine sur l'expression des gènes de souche dans les ASC. À cette fin, nous avons utilisé la PCR quantitative en temps réel pour analyser les gènes liés au maintien de la tige dans les ASC. Nous avons observé que la metformine régulait significativement à la hausse l'expression des marqueurs de cellules souches adipeuses, tels que BMP7, DPP4, Sox2, Oct3/4, Wnt2, ICAM1, CD90 et DLK1, par rapport aux ASC témoins (figure 2B). Nos résultats démontrent que le traitement à la metformine ralentit efficacement la prolifération des ASC, empêchant ainsi les cellules de l'épuisement de la prolifération en améliorant l'expression des gènes de signature de la souche.

Figure 1. Le traitement à la metformine inhibe la différenciation adipogénique des ASC de manière dose-dépendante. (A) Les ASC ont été testés pour l'expression de CD29, CD90, CD24, CD31 et CD45 par cytométrie en flux. Le pourcentage de positivité indiqué dans les histogrammes et l'intensité de fluorescence moyenne (MFI) indiquée dans le tableau des témoins (ASC non colorés) et colorés (ASC traités avec des anticorps respectifs) sont présentés. (B) Les ASC ont été soumis à une différenciation adipogénique ou ostéogénique à l'aide de cocktails de différenciation spécifiques à la lignée. La différenciation en lignée adipocytaire a été confirmée par la coloration Bodipy et l'ostéogenèse a été confirmée par la coloration au rouge alizarine. Le pourcentage de la zone colorée au rouge d'alizarine a été calculé à l'aide de l'image J. (C) Les ASC ont été traités avec un cocktail de différenciation adipocytaire en présence ou en l'absence de différentes doses de metformine pendant 14 jours. Le développement des adipocytes au jour 14 après l'induction a été évalué en colorant les gouttelettes lipidiques à l'aide de la coloration Oil Red O. La coloration Absorbed Oil Red O a été extraite et la densité optique a été mesurée. La densité optique des ASC témoins a été prise à 100 %, et le changement relatif lors du traitement à la metformine a été tracé (n =3). (D) La teneur en lipides au jour 14 a été déterminée à l'aide de la coloration Bodipy (verte). Hoechst (bleu) a été utilisé pour colorer les noyaux.qu'est-ce qu'un cistanche(E) Analyse Western blot de l'expression de la protéine périlipine. -L'actine a été utilisée comme contrôle de charge. La quantification des densités de bandes de protéines périlipine normalisées à -Actin a utilisé l'image J. Les images et les graphiques sont représentatifs de trois répliques indépendantes (n=3). *p<0.05,**><0.01,***p><0.001 and="" ***=""><0.0001 as="" compared="" with="">

Pour exclure que la diminution de la différenciation et de la prolifération ne soit due à aucun effet cytotoxique de la metformine sur les ASC, nous avons analysé la viabilité des cellules traitées à la metformine. Les analyses de la coloration d'AnnexinV/PI par cytométrie en flux n'ont démontré aucune augmentation significative des cellules apoptotiques ou nécrotiques lors du traitement avec des concentrations croissantes de metformine jusqu'à 5 par rapport au contrôle du milieu de culture cellulaire (Figure 3A). L'activité mitochondriale et la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont importantes pour la différenciation cellulaire, et des niveaux accrus de métabolisme mitochondrial et de génération de ROS ont été observés au cours de la différenciation adipogénique [32]. D'après nos résultats, nous avons observé que le traitement à la metformine réduit la différenciation adipogénique des ASC. Nous avons ensuite étudié les effets sur l'activité mitochondriale et la production de ROS. Les ASC ont été traités avec de la metformine et colorés avec du TMRM pour évaluer l'activité de la membrane mitochondriale et avec du DCF2DA pour estimer la concentration de ROS. Les images au microscope fluorescent et la quantification du signal fluorescent ont révélé que le traitement à la metformine réduit considérablement l'activité mitochondriale (figure 3B, C) et la production de ROS (figure 3D, E). Nous concluons qu'une diminution médiée par la metformine de l'activité mitochondriale et de la production de ROS contribue à une augmentation de la souche des ASC.

Pour comprendre la possible cascade de signalisation responsable de la différenciation réduite des adipocytes, de la prolifération et de la régulation à la hausse des gènes de la souche dans les ASC lors du traitement par la metformine, nous nous sommes concentrés sur les cascades de signalisation mTOR, autophagie et ERK (extracellular signal-regulated kinase). Des études antérieures ont montré le rôle important de ces voies dans le maintien de la souche dans les ASC [19, 33]. La signalisation ERK et mTOR joue un rôle important dans la promotion de la prolifération et de la différenciation cellulaire. Après que les ASC aient été traités avec différentes doses de metformine, des lysats cellulaires ont été collectés et soumis à un transfert Western pour les anticorps LC3, phosphorylé-p70S6 kinase, total p70S6 kinase, phosphorylé-ERK42/44 et total ERKp42/44. La bêta-actine a été employée comme gène de ménage. L'analyse Western blot a montré que, par rapport aux ASC témoins, le traitement à la metformine réduisait l'expression de la p70S6K phosphorylée et de la kinase phosphorylée-ERK42/44 (Figure 4A, B, D). La signalisation ERK et mTOR joue un rôle important dans la régulation de la voie de l'autophagie.bioflavonoïdesLes résultats de Western blot ont révélé que le traitement à la metformine améliore l'activité d'autophagie dans les ASC (Figure 4A, C). Nous avons en outre analysé l'expression des gènes de la voie de l'autophagie lors du traitement à la metformine au niveau de l'ARNm en utilisant une PCR quantitative en temps réel. Avec l'analyse qPCR, nous avons observé une augmentation significative des gènes de la voie d'autophagie VMP1, P62, ATG5 et ATG7 lors du traitement à la metformine (figure 4E), ce qui est cohérent avec l'augmentation de l'activité d'autophagie montrée dans nos résultats de Western blot. Une augmentation non significative de l'expression de l'ATG 9 a également été observée dans nos analyses. Nous concluons que le traitement à la metformine réduit l'activité ERK et mTOR et améliore l'autophagie dans les ASC en tant que mécanisme sous-jacent possible pour une prolifération et une différenciation réduites et une souche accrue.

Pour souligner le rôle direct de la signalisation ERK et mTOR dans l'inhibition de la différenciation médiée par le traitement par la metformine et l'augmentation de la souche dans les ASC, nous avons inhibé séparément la signalisation ERK et la voie mTOR en utilisant l'inhibiteur ERK U0126 et la rapamycine, respectivement, et analysé les effets sur l'ASC. différenciation et souche [19,33]. L'ajout de l'inhibiteur ERK U0126 au cours de la différenciation adipocytaire des ASC a entraîné une différenciation significativement réduite, comme l'ont révélé les images colorées de Bodipy et la quantification de la fluorescence (Figure 5A, B). Résultats quantitatifs de PCR en temps réel montrant une régulation positive des gènes de la souche lors d'une inhibition spécifique médiée par l'inhibiteur de la signalisation ERK (figure 5C) a également confirmé notre découverte selon laquelle la régulation à la baisse de la voie ERK par le traitement à la metformine contribue à augmenter la souche.

Nous avons ensuite utilisé la rapamycine, un inhibiteur bien connu de la voie mTOR qui peut activer l'autophagie, et évalué les effets sur l'adipogenèse et l'expression des gènes de la souche [19]. Des lysats cellulaires d'ASC traités avec de la rapamycine ont été collectés et sondés avec de la kinase p70S6 phosphorylée, de la kinase p70S6 totale et des anticorps anti-actine. Nous avons observé que la rapamycine réduisait l'expression de la kinase p70S6 phosphorylée (figure 6A). Pour déterminer le rôle fonctionnel dans la différenciation adipogénique, les ASC ont été traités avec de la rapamycine et induits avec le milieu adipogénique. Après 14 jours, les cellules ont été colorées avec une coloration Bodipy pour évaluer l'adipogenèse. Nous avons observé que le traitement à la rapamycine réduisait significativement la différenciation adipogénique (figure 6B, C). Ensuite, nous avons analysé l'effet du blocage de la transduction du signal mTOR sur la tige des ASC. À cette fin, les ASC ont été traités avec de la rapamycine et une PCR en temps réel a été utilisée pour mesurer l'expression des transcrits liés à la souche. Nous avons observé que la rapamycine augmentait significativement l'expression des marqueurs liés à la souche (Figure 6D). Nous concluons que l'inhibition des voies ERK et mTOR contribue à une diminution de la différenciation des adipocytes et à une augmentation de la souche chez les ASC humains.

Ensuite, nous avons testé si nous pouvions reproduire les effets d'amélioration de la tige du traitement à la metformine sur les ASC cultivées en 2D dans un modèle de culture de tissu adipeux entier plus complexe et traduisible in vivo. Pour cela, nous avons modifié le protocole de culture de tissu adipeux publié par Harms et al.30] en utilisant des passoires cellulaires au lieu d'inserts transwell pour maintenir les fragments de tissu adipeux immergés dans les médias (figure 7A). Après avoir cultivé des fragments de 3-5 mm de tissu adipeux humain avec ou sans metformine pendant 5 jours, nous avons isolé la fraction vasculaire stromale (SVF) par digestion à la collagénase de fragments de tissu adipeux et analysé l'expression des gènes liés à la souche. Les données de PCR en temps réel ont montré que le SVF du tissu adipeux traité avec de la metformine a démontré une régulation à la hausse significative de l'expression de marqueurs de souche comme BMP7, DLK1, MYC1, DPP4, OCT3/4, Sox2, Nanog, KLF4, PDGFR et Wnt2 (Figure 7B ).

4. Discussion

Les cellules souches adipeuses (ASC) régénèrent le tissu adipeux par auto-renouvellement et différenciation, maintenant ainsi le pool de cellules souches du tissu. Cependant, le vieillissement et l'obésité sont associés à la perte des propriétés de souche chez les ASC. La metformine est un médicament antidiabétique et a montré des résultats prometteurs en tant qu'agent anti-vieillissement. Nous nous sommes concentrés sur l'analyse de l'effet de la metformine sur la souche des ASC et sur la compréhension du mécanisme sous-jacent, dans le but d'établir la metformine en tant qu'agent potentiel pour maintenir la souche chez les ASC avec l'âge. Pour faciliter la traduction de nos résultats sur des sujets humains, nous avons utilisé un modèle de culture cellulaire 2D d'ASC humains et utilisé la méthode de culture de tissu adipeux humain pour simuler l'environnement tissulaire plus complexe. Nous avons utilisé le tissu adipeux sous-cutané comme source de tissu pour nos études. En utilisant ces diverses méthodes de culture de cellules et de tissus, nous avons étudié l'effet du traitement à la metformine sur le caractère souche des ASC.

L'obésité provoque une altération de la cinétique de différenciation des ASC, ce qui diminue le pool de cellules souches. Nos résultats suggèrent que, par rapport aux ASC non traités, le traitement à la metformine réduit le taux d'adipogenèse de manière dose-dépendante. Cette observation est cohérente avec des rapports antérieurs qui ont montré que la metformine inhibe l'adipogenèse dans les cellules souches adipeuses, les cellules stromales de la moelle osseuse, les cellules souches du ligament parodontal et les lignées cellulaires 3T3 [34-37]. Le taux de prolifération des cellules souches joue un rôle important dans le maintien du pool de cellules souches, de la souche et de la capacité d'auto-renouvellement. Nous avons observé que la metformine inhibait la prolifération des ASC sans induire d'effet cytotoxique sur les ASC, ce qui concorde avec d'autres études publiées sur des cellules souches adipeuses de souris [28], des cellules stromales et des fibroblastes [38,39].acheter cistancheUne étude récente utilisant des cellules souches dérivées du tissu adipeux de chevaux a montré un effet pro-prolifératif de la metformine [27]. L'explication la plus probable de ces observations contradictoires est la différence entre les espèces donneuses et le site anatomique de la récolte de cellules, car les ASC de cheval ont été récoltées à partir de la queue. Agnieszka Smieszek et al. ont observé que la metformine inhibe la prolifération cellulaire et favorise la mort cellulaire avec des doses croissantes (5 et 10 mM) dans les cellules stromales dérivées de la moelle osseuse de souris et la lignée cellulaire de fibroblastes embryonnaires Balb/3T3 [40]. De plus, la metformine inhibe la prolifération des cellules satellites isolées des muscles de souris |41. À l'appui de notre observation, Min-lung Park et al. ont rapporté que la metformine améliore la propriété anti-inflammatoire des ASC humains en diminuant les niveaux d'expression de IL-1, IL-6 et TGF- ; la metformine augmente également la survie des ASC greffés et protège contre la mort cellulaire apoptotique [42]. Ces résultats indiquent des effets variables du traitement à la metformine sur la viabilité des cellules dérivées de différentes espèces et que les ASC humains sont résistants aux effets cytotoxiques potentiels du traitement à la metformine.

La différenciation des ASC en adipocytes est associée à des besoins énergétiques et à des taux métaboliques plus élevés, entraînant une activité mitochondriale et une production de ROS plus élevées. Les ROS jouent un rôle essentiel dans le maintien de la quiescence et de la souche dans les cellules souches adultes, car des niveaux plus élevés de ROS poussent les cellules vers la différenciation et finalement la sénescence des cellules souches et la mort cellulaire [43]. Nous avons observé que la metformine diminue significativement le potentiel de membrane mitochondriale et la génération d'espèces réactives de l'oxygène. Conformément à nos données, des études antérieures ont également rapporté que la metformine diminue le stress oxydatif et améliore l'expression antioxydante dans les fibroblastes embryonnaires de souris [44], les ASC de souris [38] et les cellules endothéliales aortiques humaines [45]. De plus, en accord avec notre étude, Chien-Hung Lin et al, ont rapporté que la metformine agit comme un agent neuroprotecteur en réduisant le stress oxydatif dans les cellules souches neurales humaines [46]. Plusieurs autres études confirment que la metformine agit comme un antioxydant en réduisant le stress oxydatif et en augmentant l'expression des enzymes antioxydantes, telles que la superoxyde dismutase dans les ASC de souris, les myoblastes C2C12 murins et les cellules progénitrices endothéliales humaines en circulation [38, 47, 48]. De plus, l'étude d'Alejandro Martin-Montalvo et al. soutient notre observation, démontrant que la metformine inhibe de manière significative le complexe mitochondrial, inhibant la respiration mitochondriale chez la souris [49] Les effets de la metformine sur la génération réduite d'espèces réactives de l'oxygène sont peut-être médiés par l'augmentation du glutathion réduit [50] dans un mécanisme impliquant le redox- facteur de transcription sensible Nrf2 [51].

Il a été démontré que la metformine favorise l'état de quiescence des cellules satellites en abaissant le métabolisme nécessaire à la prolifération et à la différenciation. Diverses études confirment également que la metformine favorise fortement la souche et le rajeunissement des cellules souches [23,39,41,49,52,53]. Il est également connu pour améliorer de manière significative et réguler positivement les niveaux d'expression des marqueurs de cellules souches. Puisque nous avons observé que la metformine inhibe la prolifération et l'adipogenèse en inhibant le stress oxydatif et l'activité mitochondriale, nous avons cherché à confirmer si la metformine améliore la tige dans les ASC ou dans un modèle de culture de tissu adipeux in vitro. En conséquence, nous avons observé que la metformine améliorait de manière significative l'expression des marqueurs liés à la souche de DPP4, Wnt2, THP1, DLK1, PDGFR, ICAM1 et Annexin3, Oct3/4, Nanog, BMP4, SOX2 et Mycl dans des modèles de culture ASCculture 2D et de tissu adipeux. . L'utilisation de la culture de tissu adipeux entier offre une occasion unique de simuler le microenvironnement tissulaire humain in vivo, où les cellules sont orientées comme dans leur architecture naturelle et ont un support interactif de différents types de cellules tissées dans la matrice tissulaire. Au meilleur de notre connaissance, notre étude démontre pour la première fois un effet d'amélioration de la souche du traitement à la metformine sur les ASC humains, à la fois dans les cultures de tissus adipeux 2D et entiers. Nous considérons nos résultats montrant une régulation à la hausse de la signature des gènes de la souche dans les ASC isolés à partir de fragments de tissu adipeux traités à la metformine comme plaidant pour une enquête plus approfondie sur l'utilisation de la metformine comme thérapie pour ralentir le processus de vieillissement et rajeunir les tissus adipeux âgés.

La cible mécaniste de la rapamycine (mTOR) joue un rôle clé dans la prolifération et la différenciation des cellules souches. La modulation à la baisse de l'activité de mTOR par manipulation génétique, intervention thérapeutique ou changements liés au mode de vie augmente la souche et la longévité [19,20]. Puisque nous avons observé que la metformine inhibe l'adipogenèse, nous avons testé l'effet de la metformine sur la signalisation mTOR. Fait intéressant, les résultats ont montré que la metformine régule à la baisse les niveaux de phosphorylation de la kinase PS70S6 de manière significative, qui est une molécule de signalisation clé en aval de mTOR et un rapporteur de l'activité de la voie mTOR. Des études antérieures suggèrent également que la metformine supprime l'adipogenèse en inhibant la voie de signalisation mTOR dans les fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), les cellules souches mésenchymateuses de souris C3H10T1/2 et les préadipocytes 3T3-L1 [34]. La cible mécaniste de la rapamycine est composée de deux complexes, mTORCl et mTORC2, et la signalisation joue un rôle important dans l'adipogenèse. Il a été démontré que l'inhibition de la signalisation mTORC1 avec la rapamycine altère l'adipogenèse via une diminution de la phosphorylation de la PS6kinase dans les préadipocytes 3T3-L1. Ces études ont également démontré que l'inhibition de la signalisation mTOR inhibe l'adipogenèse en régulant à la baisse les niveaux d'expression des marqueurs de la lignée adipocytaire tels que PPARgamma, CEBPI, CEBP1 et l'adiponectine [54-56]. De plus, la signalisation mTOR est médiée par la phosphorylation de la kinase S6. L'inactivation de la kinase S6 s'est avérée résistante à l'obésité et à la prise de poids dans des conditions de régime riche en graisses en raison d'une altération de l'adipogenèse [57]. Nous avons confirmé notre observation de la régulation à la baisse médiée par la metformine de l'activité mTOR en tant que médiateur possible de l'augmentation de la souche et de la différenciation réduite des ASC en utilisant la rapamycine, qui bloque spécifiquement l'activité de la voie m TOR.

En plus de mTOR, la voie de signalisation ERK joue un rôle crucial dans la prolifération et l'adipogenèse. Xiaomin Ning et al., dans leur publication, postulent que l'adipogenèse est activée par la signalisation ERK [58]. Puisque nous avons observé que la metformine inhibait l'adipogenèse et la prolifération, nous avons décidé d'étudier l'effet de la metformine sur la signalisation ERK. Conformément aux rapports antérieurs, nos résultats suggèrent également que la metformine pourrait inhiber l'adipogenèse via la suppression de la signalisation ERK avec une augmentation de l'expression génique liée à la souche. La signalisation mTOR est nécessaire à la prolifération et à la différenciation cellulaire et est un régulateur négatif de l'autophagie [{{2 }}]. Cependant, la perte d'autophagie est liée à la perte de la souche, bien que le traitement à la metformine ait amélioré l'expression des gènes liés à la souche via l'activation de l'expression de marqueurs liés à l'autophagie tels que LC3Il. Ainsi, nos résultats suggèrent que la metformine altère l'adipogenèse en améliorant la souche dans l'ASC humain ou les modèles de culture de tissu adipeux humain via l'activation de l'autophagie et l'inhibition des voies de signalisation mTOR. Les futures études expérimentales in vivo sur les animaux et les humains axées sur l'évaluation des effets de la metformine sur la biologie des ASC guideront l'adaptation de l'utilisation de la metformine en tant qu'agent anti-vieillissement des cellules souches.

Cet article est extrait de Biomedicines 2021, 9, 1782. https://doi.org/10.3390/biomedicines9121782 https://www.mdpi.com/journal/biomedicines