MiR-214 améliore les lésions rénales aiguës induites par le sepsis via l'autophagie régulée par PTEN/AKT/mTOR
Feb 28, 2022
Résumé. Des études antérieures ont suggéré que le stress oxydatif et l'autophagie entraînent deslésion rénale (AKI) pendant la septicémie et le microARN (miR)‑214 joue un rôle vital dans la protection dereinssoumis à un stress oxydatif. La présente étude visait à tester si la rénoprotection de miR-214 est liée à l'autophagie dans le sepsis. Le rôle de l'autophagie a été étudié dans un modèle murin de ligature et ponction cæcales (CLP). L'amplification en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR) a été utilisée pour analyser l'expression de miR-214. La structure et la fonction dereinsrécoltés sur les souris ont été évalués.Un reinles niveaux d'autophagie ont été détectés par immunohistochimie, immunofluorescence et western blot. Il a été constaté que miR-214 pouvait atténuer l'IRA chez les souris septiques en inhibant le niveau deun reinautophagie. De plus, miR-214 a inhibé l'autophagie en faisant taire l'expression de PTEN dans leun reintissus de souris septiques. Ces découvertes ont indiqué que miR‑214 améliorait l'IRA induite par le CLP en réduisant le stress oxydatif et en inhibant l'autophagie par la régulation de la voie PTEN/AKT/mTOR.
Mots clés:microARN‑214, septicémie, insuffisance rénale aiguë, autophagie, néphrétique
Introduction Aigulésion rénale(IRA) est l'une des complications les plus courantes de la septicémie et survient chez 40 à 50 % des patients septiques, avec un taux de mortalité pouvant atteindre 60 % (1). Cependant, la pathogenèse de l'IRA induite par le sepsis reste incertaine. Il a été rapporté que l'autophagie joue un rôle clé dans l'IRA induite par la septicémie et l'inhibition de l'autophagie entraîne le développement de l'IRA pendant la septicémie (2,3). Des études antérieures (4,5) ont confirmé que la septicémie déclenche l'autophagie dans plusieurs organes, y compris leun rein(6) et les processus autophagiques sont impliqués dans l'élimination des mitochondries endommagées et du stress oxydatif (7). Cependant, une autophagie excessive peut provoquer une mort cellulaire indésirable et délétère (8). Par conséquent, un niveau modéré d'autophagie est la clé pour réduire l'IRA induite par le sepsis. Des études antérieures ont rapporté que miR-214 améliore l'IRA induite par l'ischémie-reperfusion en inhibant l'apoptose (9) et miR-214 supprime le stress oxydatif dans la néphropathie diabétique via la voie de signalisation des espèces réactives de l'oxygène (ROS)/AKT/mTOR (10). La présente étude a révélé que miR-214 peut atténuer le dysfonctionnement myocardique induit par la septicémie chez la souris en inhibant l'autophagie (11). Cependant, il reste à déterminer si miR‑214 peut améliorer l'IRA induite par le sepsis. Dans la présente étude, on a émis l'hypothèse que miR‑214 atténue l'IRA induite par le CLP en réduisant le stress oxydatif et en inhibant l'autophagie par la régulation de la voie PTEN/AKT/mTOR.
CISTANCHE AMÉLIORERA LES MALADIES RÉNALES/RÉNALES
matériaux et méthodes
Animaux.Un total de 100 souris mâles Kunming (poids, 20, 40 ± 2, 92 g; âge, 6 à 8 semaines) fournies par le Medical Laboratory Animal Center de l'Université médicale de Hebei (Shijiazhuang, Chine) ont été utilisées dans la présente étude. Toutes les souris ont été acclimatées à un cycle lumière/obscurité de 12 h à 24 °C avec 50 % d'humidité et ont eu libre accès à de la nourriture et de l'eau à une semaine supérieure ou égale à 1 semaine avant les expériences. Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées en stricte conformité avec les directives de l'Institut national de la santé (publication NIH n° 85‑23, révisée en 1996) et approuvées par les comités institutionnels de protection et d'utilisation des animaux de l'hôpital central de Cangzhou (n° d'approbation 2017‑020‑ 01). Toutes les chirurgies ont été réalisées sous anesthésie et tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance.
Ligature et ponction caecale (CLP).Le CLP a été réalisé sur des souris pour créer un modèle de septicémie murine, comme décrit précédemment (12). Suite à l'anesthésie par inhalation d'isoflurane (induite à 3 % et maintenue à 0,5 %), une incision médiane de 1 cm a été pratiquée. Le caecum exposé (à 1 cm de l'extrémité) a été ligaturé avec deux ponctions à l'aide d'une aiguille de calibre 23. Le caecum a doucement extrudé une petite quantité de matières fécales et a été replacé dans sa position anatomique. La paroi abdominale a été suturée en couches avec une tresse de soie 3‑0. Après la procédure, 1 ml de solution saline 0,9 % a été injecté par voie sous-cutanée. Les souris ont eu accès gratuitement à de l'eau uniquement. Les souris modèles Sham ont été opérées de la même manière que le modèle CLP sans CLP.
Conception expérimentale. Les souris (n=6 pour la chirurgie fictive et le CLP) ont été réparties au hasard en sept groupes : groupe fictif, groupe CLP, adénovirus (Ad)-protéine fluorescente verte (GFP) plus groupe CLP, groupe Ad-miR-214 plus CLP , anti‑miR‑214 plus groupe CLP, inhibiteur de PTEN plus groupe CLP et Ad‑miR‑214 plus inhibiteur de PTEN plus groupe CLP. Les souris du groupe Sham ont été exposées à la même procédure mais sans ligature ni ponction du caecum. Les souris des autres groupes ont reçu une ligature caecale et une perforation. Toutes les souris ont été rapidement anesthésiées par inhalation d'isoflurane pour recueillir le sang, l'urine etun reinéchantillons 24 h après le dernier traitement.
Adénovirus médié Ad‑miR‑214, anti‑miR‑214 ou Ad‑GFPtransfert de gène in vivo et injection d'inhibiteur de PTEN. Ad‑miR‑214, anti‑miR‑214 ou Ad‑GFP (Shanghai GenePharma Co., Ltd.) a été administré dans la cavité abdominale de souris 4 jours avant le CLP. Brièvement, des souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane. Un cathéter contenant 200 µl d'adénovirus (2x1011 pfu, exprimant miR‑214, anti‑miR‑214 ou Ad‑GFP) a été administré à des souris normales par injection intrapéritonéale. L'inhibiteur de PTEN (VO‑OHpic, intrapéritonéal, Sigma‑Aldrich ; Merck KGaA) a été administré à des souris CLP ayant reçu de l'anti‑miR‑214 par injection intrapéritonéale à une dose unique de 10 µg/kg 30 min avant l'administration d'adénovirus .
Évaluation de la fonction rénale. Des échantillons de sang ont été prélevés sur le cœur des souris, suivis d'une centrifugation (à température ambiante pendant 15 min à 3,000 xg) pour recueillir le sérum. Les taux sériques d'azote uréique sanguin (BUN) et de créatinine sérique (Cr) ont été déterminés à l'aide d'un analyseur automatique Hitachi 7600 (Hitachi, Ltd.). ELISA a été utilisé pour analyser les niveaux delésion rénalemolécule-1 (KIM-1 ; n° cat. RKM100 ; R&D Systems, Inc.) et la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL ; n° cat. DY3508 ; R&D Systems, Inc.) dans des échantillons d'urine.
Dosage de la cytokine d'inflammation sérique.Le sérum TNF‑ (cat. no. H052) et IL‑6 (cat. no. H007) ont été examinés à l'aide de kits ELISA commerciaux (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) conformément aux instructions du fabricant.Mesure des marqueurs du stress oxydatif. Le kit de dosage correspondant (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine) a été utilisé pour mesurer les niveaux de malondialdéhyde (MDA) et tester l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) conformément aux instructions du fabricant.
Histologie et score de lésion tubulaire. Toutes les souris ont été soumises àun reinperfusion sous anesthésie 24h après CLP. Laun reinles échantillons ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 72 h à 4 °C. Les échantillons de tissus ont ensuite été déshydratés dans une série graduée de solutions d'éthanol, inclus dans de la paraffine et coupés en sections de 4 µm. Des coupes (4 µm) ont été coupées à l'aide d'un microtome et les coupes de tissu ont été colorées avec de l'hématoxyline (5 min) et de l'éosine (1 min) à température ambiante pour un examen histologique. Les lames ont été évaluées et classées à l'aide d'un microscope (BX51, Olympus Corporation).Rénaltissues with the following histopathological changes were judged injured: Loss of brush border, vacuolization, cast formation, tubular dilation and disruption, cell lysis and cellular necrosis. Tissue damage was checked in a blinded manner and scored by the percentage of damaged tubules: 0, no damage; 1, 0‑25; 2, 25‑50; 3, 50‑75; 4, >75 % (13).
Microscopie électronique à transmission (MET).Fraisreinsont été lavés dans une solution saline tamponnée au phosphate et coupés en cubes de 1 mm et fixés séquentiellement dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pendant 24 h à 4 °C. Les coupes ont été immergées dans du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 2 h à 4 °C, déshydratées dans de l'éthanol gradué et noyées dans de la résine époxy. Enfin, les coupes ultrafines (60 nm) ont été doublement colorées avec de l'acétate d'uranyle et du citrate de plomb à 20 °C pendant 60 min. L'observation a été effectuée sur un microscope électronique à transmission (Tecnai; Hitachi, Ltd.) à 80 kV en utilisant le film de microscopie électronique 4489 (base épaisse ESTAR; Kodak).
Immunohistochimie (IHC).Fraisun reinles tissus ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (pendant 72 h à 4 °C) et inclus dans de la paraffine. Les échantillons ont été coupés en sections de 4 µm d'épaisseur et déparaffinés dans du xylène. Une fois les coupes de tissus lavées avec du PBS, elles ont été bouillies dans un tampon citrate 10 mM (pH 6.0) pendant 4 min pour la récupération de l'antigène, puis bloquées avec du sérum de chèvre à 10 % dans du PBS à température ambiante. pendant 1h. L'anticorps primaire (anti-LC3B ; 1:400 ; n° cat. 4412 ; Cell Signaling Technology, Inc.) a été ajouté conformément aux instructions et incubé à 4 °C pendant 12 h. L'anticorps secondaire (chèvre antilapin HRP ; 1:2, 000 ; n° de catalogue BS13278 ; Bioworld Technology, Inc.) a été ajouté et incubé à température ambiante pendant 10 min. Du DAB (100 µl) a été ajouté et contre-coloré pendant 5 min avec la coloration observée au microscope optique (modèle CX31-P ; Olympus Corporation). L'intensité de la coloration positive, qui apparaissait brune, a été déterminée à l'aide du logiciel d'analyse d'images Image‑Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc.). La densité optique intégrale (IOD) a été calculée pour représenter l'intensité. Les valeurs d'IOD ont augmenté à mesure que l'expression de la protéine augmentait.
Transcription inverse‑quantitative(RT‑q) PCR. L'ARN total a été extrait detissu rénalsuite à l'induction du modèle à l'aide du réactif TRIzol (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Selon les instructions du kit de transcription inverse TaqMan (n° de catalogue N8080234 ; Invitrogen ; Thermo Fisher Scientific, Inc.), l'ARN a été transcrit de manière inverse en ADNc. Les conditions de thermocyclage suivantes ont été utilisées (miR‑214) : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 min ; suivi de 40 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 secondes, d'annelage à 60 °C pendant 30 secondes et d'élongation à 72 °C pendant 30 secondes. La RT-qPCR a été réalisée à l'aide d'un système de détection de séquence ABI Prism 7500 (PerkinElmer, Inc.) et d'un kit standard SYBR Green PCR (Toyobo Life Science). U6 a été utilisé comme contrôle interne pour miR‑214. Les séquences d'amorce étaient les suivantes : miR‑214, avant, 5'‑AGCATAATACAGCAGGCACAGAC‑3' et inverse, 5'‑AAAGGTTGTTCTCCACTCTCTCAC‑3' ; U6, avant, 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3' et arrière, 5'-GGAACGCTTCACGAATTTG-3'. Ces expériences ont été répétées six fois. Les résultats ont été analysés à l'aide de la méthode 2‑ΔΔCq (14). Les niveaux d'expression de l'ARNm de LC3, p62, PTEN, AKT et mTOR ont été évalués par RT‑qPCR. Avec l'actine comme référence interne de ces gènes, le 2-ΔΔCq a été utilisé pour mesurer l'expression relative des gènes cibles. Les séquences d'amorce présentées dans le tableau I ont été synthétisées par Sangon Biotech Co., Ltd.
Western blot. Un reinle tissu a été mélangé avec du lysat RIPA (Beyotime Institute of Biotechnology) pour fabriquer l'homogénat et la lyse a été arrêtée lorsqu'aucun tissu visible n'a été observé. Les échantillons ont été centrifugés à 13,000 xg pendant 10 min à -4˚C et le surnageant a été récupéré pour l'analyse par Western blot. En bref, les concentrations de protéines ont été déterminées à l'aide du kit de dosage de protéines micro BCA (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Des échantillons de protéines (80 µg par échantillon) ont été soumis à une séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 12 %, puis transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène à 4 °C pendant une nuit. Les protéines séparées ont été transférées sur des membranes en PVDF. Après blocage dans du lait écrémé à 5 % à température ambiante pendant 2 h, les membranes ont été incubées pendant une nuit (à 4 °C) avec des anticorps primaires. Les anticorps primaires suivants (tous Cell Signaling Technology, Inc.) ont été utilisés : chaîne légère 3B (1:1,000 ; cat. no. 4412), p62 (1:1,000 ; cat . n° 4412), Anti‑PTEN (1:1,000 ; cat. n° 9188), anti‑phosphorylé (p)‑AKT (Ser473) (1:1,000 ; cat. 4060), anti-AKT (1:1,000 ; n° cat. 9272), anti‑p‑mTOR (Ser 2448) (1:1,000 ; n° cat. 5536), anti-mTOR (1:1,000 ; cat. n° 2972) et ‑actine (1:2,000 ; cat. n° 4970). Après lavage, les membranes ont été incubées (à température ambiante pendant 2 h) avec les anticorps secondaires anti-lapin conjugués à la HRP (1:3,000 ; cat. no. A0208 ; Beyotime Institute of Biotechnology). Les bandes de protéines ont été détectées avec Immobilon Western (MilliporeSigma) et analysées à l'aide du logiciel Total‑Lab TL120 (Nonlinear Dynamics, 2.01). L'expression de la protéine a été normalisée à l'actine.
Analyses statistiques. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du GraphPad Prism 9.0 (GraphPad Software, Inc.). Toutes les données ont été présentées sous forme de moyennes ± écart type ou médianes (intervalles interquartiles) pour les variables continues, selon leurs distributions. Les caractéristiques de base et les résultats ont été comparés à l'aide d'une ANOVA à un facteur suivie du test posthoc de Tukey ou du test de Kruskal-Wallis suivi du test de Dunn, selon le cas. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Résultats
Heure 24 h après CLP. Des études antérieures ont rapporté (6, 15, 16) que l'analyse biochimique (c'est-à-dire LC3 et p62) révèle que le flux d'autophagie est supprimé avec la progression de la septicémie après 6 à 8 h de CLP. Dans la présente étude, le nombre d'autolysosomes dans leun reindes souris traitées au CLP a augmenté dans les 24 heures suivant la chirurgie. De plus, l'analyse des marqueurs delésion rénaleont montré quefonction rénalea été le plus gravement endommagé 24 h après CLP. Par conséquent, le point temporel 24 h après CLP a été choisi pour les expériences suivantes.
Effet régulateur sur miR‑214 dans les tissus rénaux. L'analyse RT‑qPCR a été utilisée pour détecter l'expression de miR‑214 chez les souris traitées au CLP. Il a été constaté que l'expression de miR‑214 était légèrement régulée à la hausse dans leun reintissus après chirurgie CLP 24 h, par rapport au groupe fictif (1,47 fois, P<0.01, fig.="" 1a).="" the="" present="" study="" examined="" the="" reactive="" increase="" in="" mir‑214="" expression="" during="" sepsis="" as="" a="" compensatory="" protective="" mechanism.="" therefore,="" it="" evaluated="" the="" role="" of="" mir‑214="" in="" aki="" during="" sepsis="" by="" regulating="" its="" expression.="" as="" shown="" in="" fig.="" 1b,="" ad‑mir‑214="" increased="" mir‑214="" expression="" by="" 4.13‑fold="" 4="" days="" after="" intraperitoneally="" injecting="" 2x1011="" pfu/mice="" adenovirus,="" whereas="" anti‑mir‑214="" decreased="" mir‑214="" expression="" by="" 81.16%="" in="" the="">un reintissu, par rapport au groupe fictif (les deux P<0.01). by="" contrast,="" ad‑gfp="" as="" a="" control="" group="" did="" not="" affect="" mir‑214‑3p="" expression,="" compared="" with="" the="" sham="" group="" (both="" p="">0.05).
CISTANCHE AMÉLIORE L'INSUFFISANCE RÉNALE/RÉNALE
Effet de miR‑214 sur le dysfonctionnement rénal chez des souris septiques.Toutes les souris ont été sacrifiées pour recueillir le sang, l'urine etun reinéchantillons 24 h après la chirurgie CLP. BUN et Cr sont des indicateurs importants de la sévérité derénaldéficience (17). De plus, NGAL et KIM‑1 ont été identifiés comme des biomarqueurs spécifiques delésion rénaleet leur expression accrue est associée à desrénallésion tubulaire dans l'IRA (17). Comme le montre la Fig. 2A‑D, les niveaux de BUN, Cr, KIM‑1 et NGAL ont été significativement augmentés après la chirurgie CLP par rapport au groupe fictif. Cependant, Ad-miR-214 a significativement diminué les niveaux de BUN, Cr, KIM-1 et NGAL par rapport au groupe CLP (tous P<0.01), whereas="" anti‑mir‑214="" exhibited="" opposite="" effects="" in="" these="">fonction rénaleparamètres. Cependant, après un prétraitement avec un inhibiteur de PTEN, les effets protecteurs de l'Ad‑miR‑214 ont été renforcés. Les résultats montrent que miR-214 atténue le dysfonctionnement rénal chez les souris septiques.
Effet de miR‑214 sur l'inflammation rénale et le stress oxydatif.Comme le montrent les figures 3A et B, le CLP a augmenté de manière significative les niveaux de TNF‑ et d'IL‑6, tandis que l'Ad‑miR‑214 a considérablement réduit les niveaux de ces marqueurs. Par rapport à la
Effet de miR‑214 sur l'autophagie rénale chez des souris septiques.La présente étude a examiné les changements de LC3 dansun reintissus par coloration IHC. Comme le montre la figure 6, l'intensité LC3 de la coloration positive a augmenté de manière significative dans le groupe CLP par rapport au groupe fictif (P<0.01) due="" to="" the="" activated="" autophagy.="" the="" expression="" level="" of="" lc3="" was="" lower="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group="" and="" higher="" in="" the="" anti‑mir‑214="" group="" in="" comparison="" with="" the="" clp="" group=""><0.01). however,="" the="" administration="" of="" pten="" inhibitor="" enhanced="" the="" inhibition="" of="" autophagy="" effect="" of="">
miR‑214 active la voie AKT/mTOR pour inhiberautophagie en faisant taire PTEN dans les tissus rénaux.L'effet du CLP sur l'autophagie chezun reintissus a été étudiée en évaluant les niveaux de LC3‑II/I et de p62. La voie de signalisation PTEN/AKT/mTOR joue un rôle important dans l'autophagie (18). Pour étudier l'effet de miR‑214 sur la voie PTEN‑AKT/mTOR, les taux de protéines de LC3‑II/I, p62, AKT, p‑AKT, mTOR, p‑mTOR et PTEN ont été analysés par western blot et RT‑ Analyse qPCR. Comme le montre la Fig. 7A‑C, la modification de ces protéines se produit rapidement, avec une augmentation du taux de LC3‑II/LC3‑I et une réduction des niveaux de p62 (à la fois P<0.01) in="" the="" clp‑induced="" sepsis="" group.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" was="" significantly="" decreased,="" while="" the="" level="" of="" p62="" (both=""><0.01) was="" significantly="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" however,="" the="" inhibition="" of="" mir‑214="" displayed="" an="" opposite="" tendency="" to="" the="" above="" indicators="" (both=""><0.01). by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" rate="" of="" lc3‑ii/lc3‑i="" and="" the="" levels="" of="" p62="" in="">un rein tissues (both P>0.05). The two indicators of LC3‑II/LC3‑I and p62 had no significant difference among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Ces résultats ont montré que l'autophagie était induite par le CLP et que la surexpression de miR‑214 pouvait l'inhiber partiellement.
Comme le montrent les Fig. 7A et D‑F, le niveau d'expression de PTEN (P<0.01) was="" increased,="" and="" the="" expression="" levels="" of="" p‑akt="" (ser473)="" and="" p‑mtor="" (ser2448)=""><0.01) were="" decreased="" by="" clp.="" compared="" with="" the="" clp="" group,="" the="" expression="" level="" of="" pten="" was="" reduced,="" while="" those="" of="" p‑akt="" and="" p‑mtor="" (all=""><0.01) were="" subsequently="" increased="" in="" the="" ad‑mir‑214="" group.="" by="" contrast,="" the="" negative="" control="" had="" no="" effect="" on="" the="" changes="" in="" the="" expression="" levels="" of="" pten,="" p‑akt="" and="" p‑mtor="">un rein tissues (all P>0.05). There was no signifi‑ cant difference in the above indicators among the Ad‑miR‑214 group, the PTEN inhibitor group and the Ad‑miR‑214 + PTEN inhibitor group (all P>0.05). Ces résultats suggèrent que le CLP induitun reinautophagie tissulaire en inhibant la voie AKT/mTOR. Ad‑miR‑214 a activé la voie AKT/mTOR en faisant taire PTEN dansun reintissus. Cependant, par rapport au groupe CLP, l'anti‑miR‑214 n'a pas inhibé de manière significative l'expression de mTOR. Par conséquent, la RT-qPCR a été utilisée pour déterminer l'expression de l'ARNm des gènes liés à la voie de signalisation PTEN/AKT/mTOR. Selon les résultats de la RT‑qPCR (Fig. 8), par rapport au groupe Sham, les niveaux d'expression des ARNm de p62, LC3 et PTEN ont été nettement augmentés, tandis que l'expression des ARNm d'AKT et de mTOR a été diminuée dans le groupe CLP. Par rapport au groupe CLP, l'Ad‑miR‑214, PTEN
les groupes inhibiteur et Ad‑miR‑214 plus inhibiteur de PTEN ont affiché une diminution de l'expression de l'ARNm de LC3 et PTEN, mais une augmentation de l'expression de l'ARNm de p62, AKT et mTOR (tous P<0.05); in="" the="" anti‑mir‑214="" group,="" an="" opposite="" changing="" tendency="" was="" observed="" (all=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" above="" indicators="" among="" the="" ad‑mir‑214="" group,="" the="" pten="" inhibitor="" group="" and="" the="" ad‑mir‑214="" +="" pten="" inhibitor="" group="" (all="" p="">0.05). Ainsi, l'effet de p62 sur l'autophagie peut se produire au niveau transcriptionnel plutôt qu'au niveau post‑transcriptionnel. Les résultats actuels ont démontré que miR‑214 réduisait l'expression de PTEN et activait la voie de signalisation AKT/mTOR.
Discussion
La présente étude a révélé qu'une autophagie excessive était préjudiciable àfonction rénalechez les souris septiques. Des études antérieures ont montré que miR‑214 est associé à une prolifération accrue, des métastases, une invasion et fonctionne comme un oncogène pour les cellules et les tissus (19‑22). Des études rapportent que miR‑214 joue un rôle protecteur contre l'IRA en atténuant l'apoptose, le stress oxydatif et en régulant à la baisse les facteurs inflammatoires (21,23). La présente étude a examiné plus en détail les mécanismes sous-jacents à l'effet protecteur de miR‑214 sur l'IRA induite par le sepsis en se concentrant sur l'implication potentielle de miR‑214 dans la modulation de l'autophagie. Les résultats ont montré que le stress oxydatif se produisait dansun reinsuite à l'administration de la chirurgie CLP. Pendant ce temps, l'activation de l'autophagie se produit dans leun rein.LC3 II/I élevé et la réduction de p62 dans leun reina été observé après un traitement par chirurgie CLP. Comme prévu, la surexpression de miR‑214 a significativement atténuéun reinblessures pathologiques etun reindysfonctionnement causé par une septicémie. Cependant, l'inhibition de miR‑214 a affiché une tendance opposée à la rénoprotection. De plus, l'effet protecteur de l'Ad‑miR‑214 a été renforcé par l'inhibiteur de PTEN.
Dans une fosse septiqueun rein, une inflammation excessive s'accompagne d'augmentations massives de la production de ROS et un grand nombre de ROS déclenche des changements dans la structure mitochondriale et altère la fonction mitochondriale, ce qui fait entrer le corps dans un cercle vicieux qui aggraveun reindégâts (24,25). Par conséquent, le stress oxydatif peut être l'un des principaux mécanismes pathologiques de l'IRA induite par le sepsis. La présente étude a fourni des preuves supplémentaires démontrant un stress oxydatif excessif, qui a été indiqué par une production accrue de MDA et une activité réduite de SOD dans leun reintissus après chirurgie CLP. De plus, il a été constaté que la surexpression de miR‑214 pouvait protéger leun reincontre les lésions oxydatives induites par le CLP, qui sont impliquées dans l'inhibition autophagique. Ceci est cohérent avec les études précédentes selon lesquelles miR‑214 protège diverses cellules et tissus contre le stress oxydatif (26,27).
L'autophagie sert d'«épée à double tranchant» dans le développement de la septicémie : l'autophagie basale peut exercer des effets protecteurs en éliminant les protéines oxydatives toxiques, mais une autophagie excessive peut entraîner la mort cellulaire autophagique en cas de stress sévère, comme l'éruption de ROS (28,29) . Il a été démontré que l'autophagie est initialement activée dans la septicémie, suivie d'une phase ultérieure de dysfonctionnement due à la mort cellulaire autophagique (30), qui aggrave les lésions oxydatives induites par la septicémie. Dans la présente étude, l'inhibiteur de PTEN ou la surexpression de miR‑214 a présenté une rénoprotection antioxydante chez les souris traitées au CLP. Cependant, l'inhibition de miR-214 a montré une tendance opposée à la rénoprotection antioxydante. Ainsi, une autophagie excessive ou inadéquate peut causerlésions rénales; les deux sont inadaptés et finissent par provoquer la mort cellulaire. Par conséquent, le maintien de niveaux modérés d'autophagie est la clé pour atténuer les lésions oxydatives dans un état septique.
CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE
De nombreuses preuves ont indiqué que miR‑214 inhibe l'autophagie dans divers tissus et cellules (31‑33). Dans la présente étude, la surexpression de miR-214 s'est avérée inhiber l'autophagie induite par le CLP cheztissus rénaux,comme indiqué par les changements dans les marqueurs protéiques, tels que LC3-II/I et p62. De plus, les résultats ont démontré que la surexpression de miR-214 atténuait les lésions oxydatives induites par le CLP en inhibant l'autophagie excessive. La présente étude a également étudié les mécanismes moléculaires par lesquels miR‑214 moduleun reinautophagie dans l'IRA induite par le sepsis. PTEN/AKT/mTOR est une voie de signalisation importante qui réguleun reinautophagie (34,35) et qui joue un rôle clé dans l'IRA induite par le sepsis, et PTEN est un inhibiteur négatif de la voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR. Des études antérieures ont rapporté que miR-214 peut réguler l'autophagie via la voie de signalisation PI3K/AKT/mTOR dans divers modèles (36-38). Ma et al (39) ont découvert que le miR‑214 peut réguler à la baisse l'autophagie dans les reins des diabétiques. Par conséquent, il a été émis l'hypothèse que les effets de miR-214 sur l'IRA induite par le CLP pourraient être impliqués dans la régulation de la voie PTEN/AKT/mTOR. Notamment, les résultats de la présente étude ont montré que la chirurgie CLP augmentait significativement les niveaux de PTEN mais diminuait les niveaux de p‑AKT et p‑mTOR, indiquant que la chirurgie CLP inactivait la voie AKT/mTOR. De plus, la surexpression de miR‑214 a activé la voie AKT/mTOR par le silençage de PTEN dans l'autophagie induite par le CLP chezun reintissus. Cependant, l'anti‑miR‑214 n'a pas inhibé de manière significative l'expression de mTOR dans les analyses par Western blot. Ainsi, la RT-qPCR a été utilisée pour déterminer l'expression de l'ARNm des gènes liés à la voie de signalisation PTEN/AKT/mTOR. La présente étude a identifié que miR‑214 régulait négativement l'expression de PTEN et activait la voie de signalisation AKT/mTOR pour inhiber l'autophagie. Cependant, d'autres études approfondies devraient être menées pour obtenir des détails supplémentaires liés au mécanisme deun reinautophagie en état septique.
En conclusion, les résultats de la présente étude suggèrent que le miR‑214 a joué un rôle protecteur contre le sepsis induitlésion rénaleen réduisant le stress oxydatif et en inhibant l'autophagie par la régulation de la voie PTEN/AKT/mTOR. Les résultats actuels suggèrent que miR‑214 pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour l'IRA induite par la septicémie. Cependant, la présente étude a utilisé des souris âgées de 6 à 8 semaines, de sorte que des recherches supplémentaires sur le mécanisme de miR-214 sont nécessaires chez les souris adultes.