Modulation des impacts de la voie de signalisation du récepteur d'hydrocarbure arylique sur la réplication du virus Junín Partie 2

3. Résultats et discussion

3.1. La voie AHR est surreprésentée pendant l'infection JUNV

Le foie est l'une des principales cibles lors de l'infection par le JUNV [22]. Pour élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans une infection hépatocytaire, nous avons effectué un criblage par micropuce Affymetrix pour déterminer les gènes exprimés de manière différentielle dans des cellules HepG2 humaines dérivées du foie infectées par JUNV IV4454 pendant 24 ou 48 h.

Nous avons utilisé le logiciel Transcriptome Analysis Console de ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA pour évaluer les gènes exprimés de manière différentielle dans les cellules infectées par JUNV par rapport au contrôle (Figure 1a, b). Un total de 266 et 313 gènes exprimés de manière différentielle ont été détectés à 24 et 48 h pi, respectivement (Figure 1a, b).

Test de puce à ADN Affymetrix (n=3 expériences indépendantes par condition). Les gènes hôtes présentant une variation d'expression d'au moins 1,6- et une probabilité de 95 % d'être exprimés de manière différentielle (p=0.05) ont été pris en compte pour une analyse plus approfondie. Les gènes représentés en rouge étaient régulés à la hausse, les gènes représentés en vert étaient régulés à la baisse et les gènes en gris n'ont montré aucun changement d'expression par rapport aux cellules HepG2 non infectées. ( b ) Gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules HepG2 infectées par un faux et infectées par JUNV à 48 h pi. ( c ) Analyse d'ontologie génique de gènes exprimés de manière différentielle dans des cellules HepG2 infectées par JUNV à 48 h pi. ( d ) Analyse de la surreprésentation des voies des cellules HepG2 infectées par JUNV par rapport aux cellules infectées par une simulation montrant les principales voies de signalisation affectées lors de l'infection. La barre rouge met en évidence la voie AHR. La ligne bleue pointillée indique p=0.05. Les valeurs p ont été déterminées par le logiciel WebGestalt (http://www.webgestalt.org, consulté le 3 juillet 2020).

Il existe une relation étroite entre les gènes de l'hôte et l'immunité. Les gènes hôtes déterminent en grande partie le développement et le fonctionnement du système immunitaire d'une personne et peuvent affecter la résistance d'une personne à différents agents pathogènes.

Plusieurs études ont montré que certaines mutations génétiques peuvent entraîner des déséquilibres du système immunitaire. Par exemple, certaines personnes peuvent souffrir de maladies dans lesquelles le système immunitaire réagit de manière excessive, amenant le système immunitaire à attaquer ses tissus corporels, comme les rhumatismes, le lupus érythémateux disséminé et d'autres maladies. De plus, la résistance aux agents pathogènes tels que les bactéries, les virus et les parasites est également associée à des différences génétiques. Certaines personnes naissent avec un système immunitaire plus efficace qui élimine les agents pathogènes plus rapidement et plus complètement.

La recherche sur la relation entre les gènes de l'hôte et l'immunité nous a permis de mieux comprendre les mécanismes de défense de l'organisme et nous a également aidés à mieux comprendre la réponse de l'organisme à différentes maladies. Ceci est d'une grande importance pour la prévention et le traitement des maladies.

Par conséquent, nous devons prêter attention à l'importance des tests génétiques et apprendre et comprendre les différences dans les gènes humains pour mieux protéger notre système immunitaire, renforcer notre physique et construire un corps fort. De ce point de vue, nous devons améliorer notre immunité. Cistanche peut améliorer considérablement l'immunité, car Cistanche est riche en une variété de substances antioxydantes, telles que la vitamine C, la vitamine C, les caroténoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent piéger les radicaux libres et réduire le stress oxydatif. Stimule et améliore la résistance du système immunitaire.

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Pour étudier plus avant l'impact de JUNV sur le paysage cellulaire, nous avons utilisé le logiciel WebGestalt (http://www.webgestalt.org, consulté le 3 juillet 2020), qui utilise la base de données Wikipathways comme référentiel pour effectuer une analyse d'ontologie génétique ( Figure 1c) et pour déterminer quelles voies de signalisation ont été modifiées de manière différentielle par rapport au contrôle (Figure 1d).

En ce qui concerne l'analyse d'ontologie génique à partir des gènes exprimés de manière différentielle, il a été conclu que l'infection par JUNV a un impact sur l'expression de gènes liés au métabolisme de l'ARN, aux kinases de l'hôte et au métabolisme des lipides (Figure 1c). Il convient de noter que ces processus biologiques et fonctions moléculaires ont été signalés comme étant ciblés par JUNV au cours de son cycle de réplication [23].

De plus, l'analyse de surreprésentation des voies a révélé que l'infection par JUNV enrichit la voie de signalisation AHR à 48 h pi (figure 1d) parmi de nombreuses autres voies (p <0.05). En particulier, nous avons détecté une expression accrue du gène cible AHR CYP1B1, ce qui met en évidence une activité accrue de la voie AHR.

Au cours des dernières années, plusieurs études ont révélé l'importance de la procréation assistée comme cible thérapeutique lors de différents scénarios pathologiques ; ainsi, une grande variété de petits composés pour moduler son activité a été développée. Nous avons décidé d'étudier plus avant l'impact de la modulation de l'AHR lors d'une infection JUNV in vitro.

3.2. La modulation pharmacologique de l'AHR affecte la réplication virale

Pour élucider le rôle joué par l'AHR dans les infections à JUNV, nous avons décidé de tester les effets des ligands connus de l'AHR CH223191 (antagoniste) et de la kynurénine (agoniste) sur des infections in vitro avec deux souches différentes de JUNV atténuées : IV4454 et Candid#1. Les traitements et les infections ont été effectués à l'aide de cellules Huh-7 et Vero. Étant donné que cette dernière lignée cellulaire ne peut pas exprimer et sécréter l'interféron de type I (IFN-I), son utilisation permet de déterminer l'importance de l'expression de l'IFN-I dans l'interaction potentielle hôte-virus médiée par la RHA.

Premièrement, la cytotoxicité de différentes concentrations de CH223291 et de kynurénine a été évaluée via un test MTT (Figure 2a, b) et des observations de microscopie optique (Figure 2c, d).

En ce qui concerne CH223191, une diminution de la viabilité cellulaire et des altérations morphologiques associées à des effets cytotoxiques n'ont été détectées qu'à des concentrations de 80 µM (Figure 2a, c). En revanche, la kynurénine n'a induit aucun effet cytotoxique à aucune concentration testée (Figure 2b, d).

Pour étudier l'effet de la modulation pharmacologique de l'AHR pendant l'infection par JUNV, des cultures cellulaires ont été traitées avec un véhicule (DMSO), CH223191 ou de la kynurénine, puis infectées avec JUNV pendant 48 h pour déterminer le rendement viral. En bref, les cellules Vero et Huh-7 ont été traitées avec un véhicule ou traitées avec différentes concentrations de la petite molécule CH223191 (2,5, 5 μM, 10 μM et 20 μM) ou de kynurénine (5 μM, 10 µM, 20 µM et 40 µM) infection avant et après JUNV avec IV4454 et Candid#1 à un MOI de 0,5. Après 48 h, les surnageants ont été récoltés et utilisés pour infecter des cellules Vero pour le test PFU (Figure 3).

Le blocage de l'AHR a considérablement réduit la production de particules virales d'une manière dose-réponse, même avec la plus faible concentration de CH223191 testée. Fait important, ce résultat a été observé non seulement en utilisant les deux souches atténuées par JUNV, mais également dans les deux lignées cellulaires infectées (Vero et Huh7). Le traitement CH223191 des cellules Vero et Huh-7 infectées par JUNV a diminué le nombre de plaques virales de 93 % et 97 %, respectivement (Figure 3a,b). Ces résultats suggèrent fortement que la voie de signalisation AHR est un facteur cellulaire important lors de l'infection par JUNV (Figure 3a, b). En revanche, l'administration de kynurénine avant et après l'inoculation de JUNV n'a pas modifié de manière significative le titre viral obtenu par rapport au contrôle viral (Figure 3c, d).

Dans l'ensemble, les résultats ont mis en évidence pour la première fois que l'AHR est un facteur cellulaire important lors de l'infection in vitro de JUNV, impliquant un rôle pro-viral en facilitant le cycle de réplication virale.

3.3. La modulation AHR a un impact sur l'expression de la protéine JUNV

Pour étudier plus avant les effets de la modulation AHR sur l'infection JUNV, nous avons effectué un test d'immunofluorescence indirecte. La protéine JUNV NP est la protéine structurelle et fonctionnelle la plus abondante au sein de la famille des Arenaviridae. Ainsi, NP a été choisi comme cible de coloration intéressante étant donné que seules quelques études ont rapporté le modèle d'expression de NP de différentes souches atténuées de JUNV. Notre première étape a consisté à déterminer la distribution NP des deux souches JUNV dans nos modèles cellulaires afin de comparer la permissivité des différentes lignées cellulaires et la dissémination virale des deux souches atténuées dans ces cultures cellulaires (figure 4).

La localisation de NP était exclusivement cytoplasmique et présentait un motif d'accumulation ponctué homogène, similaire pour les deux souches dans les lignées cellulaires Vero et Huh-7 (Figure 4).

Ensuite, nous avons évalué par immunofluorescence l'impact de la modulation pharmacologique de l'AHR sur l'expression de NP dans des cultures cellulaires infectées par JUNV.

En bref, les cellules ont été ensemencées sur des lamelles de verre, prétraitées avec le véhicule (DMSOCH223191 (10 uM) ou la kynurénine (40 uM), puis infectées par une simulation ou infectées par JUNV pendant 48 h. Ensuite, les cellules ont été fixées et traitées par immunofluorescence. dosage (Figure 5).

L'administration de CH223191 a remarquablement diminué le nombre de cellules NP-positives dans les deux cultures cellulaires et pour les deux souches JUNV (Figure 5). Ces observations sont en corrélation avec les résultats précédents illustrés à la figure 3a, b. Le blocage de l'AHR a réduit non seulement le pourcentage de cellules infectées par JUNV, mais également la taille des foyers viraux. Les cultures de cellules Vero prétraitées avec CH223191 et infectées avec IV4454 ou Candid#1 ont montré une réduction de 57,14 % (ET ± 7,98) et de 41,17 % (ET ± 9,05) de la taille des foyers, respectivement. De plus, les cultures de cellules Huh-7 prétraitées avec l'antagoniste et infectées avec IV4454 ou Candid#1 ont montré une réduction de 28,57 % (SD ± 8,70) et de 12,50 % (SD ± 9,30) de la taille des foyers, respectivement. En revanche, il a été observé que le traitement à la kynurénine ne modifiait pas le pourcentage de cellules NP-positives (Figure 5), ni la taille des foyers (non représenté), par rapport aux cellules infectées non traitées.

De plus, une inspection microscopique plus détaillée a montré que les foyers viraux étaient plus grands dans les cultures de cellules Vero infectées par rapport aux cultures de cellules infectées par Huh-7-. Nous avons observé que la moyenne des cellules Vero infectées par JUNV par foyer était constituée de 35 cellules, tandis que la moyenne des cellules Huh -7 infectées par JUNV par foyer était constituée de 6 cellules. Cette observation attendue est conforme à l'environnement viral restreint que les cellules compétentes en IFN ont imposé à la multiplication des JUNV [24].

3.4. La suppression de l'AHR réduit les niveaux viraux de JUNV

Enfin, pour évaluer si un blocage AHR a un impact sur les niveaux d'ARN JUNV, les cellules Vero et Huh-7 ont été traitées avec le véhicule, CH223191 (10 μM) ou la kynurénine (40 μM), puis ont été simulées ou infectées par JUNV pour 48h. Par la suite, les monocouches cellulaires ont été récoltées et traitées pour la RT-qPCR afin de surveiller les niveaux d'ARN ahr, cyp1a1 et np (figure 6).

Il a été observé que les cellules traitées par CH 223191- et infectées par JUNV présentaient une tendance à la baisse des niveaux d'ARNm ahr par rapport aux échantillons infectés par JUNV et traités par le véhicule (Figure 6a, b). À l'inverse, l'administration de kynurénine a affiché une tendance à l'amélioration des niveaux d'ARNm ahr dans les cellules infectées par JUNV par rapport aux échantillons infectés par JUNV traités par le véhicule (Figure 6a, b). Conformément à ces résultats, le traitement avec CH223191 a montré une tendance à une réduction des niveaux d'ARNm cyp1a1 dans les cellules Huh-7, tandis que le traitement avec la kynurénine a montré des effets opposés (Figure 6c). En ce qui concerne le niveau d'ARN de JUNV, il a été observé que le traitement avec l'antagoniste de l'AHR CH223191 réduisait les niveaux d'ARN viral dans les cellules infectées par rapport aux échantillons infectés par le véhicule et infectés par le JUNV, tandis que les cellules traitées à la kynurénine et infectées par le JUNV avaient tendance à augmenter le virus. Niveaux d'ARN (Figure 6d, e).

Dans ce travail, nous avons montré pour la première fois que l'infection in vitro par JUNV induit l'activation de la voie de signalisation AHR dans des cultures de cellules dérivées du foie. Les données d'analyse des puces à ADN ont montré que la voie de signalisation AHR est surexprimée dans les cultures cellulaires infectées par JUNV à 48 h pi.

Plusieurs études ont rapporté que l'activation de l'AHR peut avoir une variété d'effets sur la physiologie cellulaire, impactant la prolifération et les réponses immunitaires innées [6,25]. En fait, au cours de la dernière décennie, l'activation de la RHA a été décrite comme ayant des effets d'activité modulatrice de l'IFN sur la sécrétion de cytokines [26,27]. Il est important de noter que la signalisation de la régulation positive de l'AHR peut réduire les réponses immunitaires antivirales IFN-I [28]. À cet égard, nous avons évalué l'impact de la modulation de la voie de signalisation AHR sur des cultures de cellules IFN non compétentes et compétentes, telles que les modèles cellulaires Vero et Huh-7, en utilisant de petites molécules commerciales antagonistes et agonistes de l'AHR lors d'une infection JUNV in vitro avec deux souches atténuées différentes.

Grâce à différentes approches, il a été confirmé que la modulation négative de l'AHR par inhibition pharmacologique avec CH223191 avait une activité antivirale contre JUNV. Après le blocage de l'AHR, l'infection JUNV in vitro s'est avérée inhibée. Une diminution importante de l'expression des protéines virales a été observée dans les cultures de cellules infectées par JUNV traitées avec l'antagoniste de l'AHR. De plus, le blocage de l'AHR a diminué la production de particules virales infectieuses extracellulaires des souches atténuées IV4454 et Candid # 1 de JUNV étudiées dans ce travail. De plus, une tendance à la diminution des taux d'ARN viral dans les cellules traitées au CH223191- a été observée. Fait intéressant, ces résultats ont été observés dans les lignées cellulaires Huh -7 et Vero et ont montré une ampleur équivalente, ce qui suggère que le rôle pro-viral AHR pendant l'infection par JUNV pourrait être indépendant de la voie de signalisation IFN-I. Ces résultats sont en accord avec nos observations précédentes dans d'autres modèles viraux [13]. D'autres études seront nécessaires pour élucider quelle étape du cycle de réplication JUNV est affectée par le blocage de l'AHR.

Les études montrant l'activation de la RHA par des ligands anthropiques ont suscité un intérêt particulier en raison de la prise de conscience croissante de l'exploitation environnementale inappropriée et de son interaction avec la gravité de l'infection virale [2]. A noter, la zone d'habitat couverte par les rongeurs vecteurs JUNV comprend un vaste territoire ; cependant, à l'heure actuelle, la FAA n'affecte qu'une région restreinte et confinée où les activités sont principalement rurales [29]. De plus, les travailleurs agricoles sont la principale population à risque de souffrir de manifestations graves au cours de la maladie AHF. Nos travaux actuels suggèrent que l'exposition des rongeurs/humains aux agonistes de la procréation assistée pourrait avoir un impact sur l'issue de l'infection par le JUNV.

Bien que des efforts intensifs aient été consacrés au cours des dernières décennies à la recherche antivirale contre les arénavirus [30], aucune chimiothérapie antivirale spécifique n'est actuellement disponible pour le traitement de l'AHF et des maladies humaines causées par d'autres membres pathogènes des Arenaviridae. En particulier, le virus Lassa (LASV) est l'agent de la fièvre de Lassa (FL), qui représente une grave menace humaine dans les régions d'Afrique de l'Ouest avec un taux de mortalité très élevé [31]. À l'heure actuelle, le seul traitement alternatif contre la FL est l'utilisation hors AMM de la ribavirine, un analogue de la guanosine, qui s'est avéré partiellement efficace chez les patients atteints de FL uniquement si son administration est commencée dans les 6 jours suivant l'apparition des symptômes [32,33]. De plus, la ribavirine peut induire des effets secondaires indésirables limitant la recommandation de son administration aux seuls patients à haut risque. Ensuite, il existe une réelle demande pour de nouveaux antiviraux efficaces pour la thérapie des fièvres hémorragiques à arénavirus. L'AHR représente une nouvelle cible d'accueil à considérer. En effet, il existe plusieurs essais cliniques en cours impliquant des inhibiteurs de l'AHR (BAY2416964, IK-175 et HP163) dans le traitement de différents cancers. Néanmoins, ces essais n'en sont qu'à leurs débuts et aucun ne se concentre sur le potentiel antiviral du ciblage pharmacologique de la PA. De manière notable, les médicaments dirigés contre les facteurs cellulaires nécessaires au cycle de multiplication du virus ont retrouvé de l'intérêt pour le développement d'antiviraux étant donné la possibilité d'obtenir un inhibiteur à large spectre affectant une cible hôte commune à plusieurs agents pathogènes humains [34,35], une caractéristique associée à la RHA.

En conclusion, les résultats combinés de la présente étude mettent en évidence la pertinence de la modulation de la voie de signalisation AHR en tant que cible thérapeutique potentielle contre le JUNV. De futures études seront nécessaires pour mettre en œuvre des thérapies de ciblage AHR afin de surmonter des défis importants, tels que la livraison des ligands AHR aux tissus et cellules souhaités afin de minimiser les éventuels effets de modulation AHR hors cible.

Contributions d'auteur:

Conceptualisation, CCG ; méthodologie, MAP, AEADL et ABM ; logiciel, FG; validation, MAP et FG ; analyse formelle, MAP et MFT ; enquête, MAP et MFT ; ressources, EBD et CCG ; conservation des données, FG ; rédaction - préparation du projet original, MAP et MFT ; rédaction—révision et édition, EBD et CCG ; surveillance, GCC ; administration du projet, GCC ; acquisition de financement, EBD et CCG Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement:

Ce travail a été financé par l'Université de Buenos Aires (UBA) (numéro de subvention 20020170100363BA) et Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Tecnológicas (CONICET) (numéro de subvention PIP11220170100171CO). EBD et CCG sont membres de la carrière de recherche du CONICET ; MFT, AEADL et ABM sont boursiers du CONICET. MAP est un boursier de l'UBA.

Déclaration du comité d'examen institutionnel :

N'est pas applicable.

Déclaration de consentement éclairé :

N'est pas applicable.

Déclaration de disponibilité des données :

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Remerciements :

Nous remercions tous les membres des laboratoires impliqués pour leurs précieux conseils et discussions.

Les conflits d'intérêts:

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude; dans la collecte, l'analyse ou l'interprétation des données ; dans la rédaction du manuscrit; ou dans la décision de publier les résultats.

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