MTHFD2 est un effecteur contrôlant le point de contrôle métabolique et le destin et la fonction des lymphocytes T régulateurs

Résumé graphique

Auteurs :

Ayaka Sugiura, Gabriela Andrejeva, Kelsey Voss, ..., Ashutosh K. Mangalam, Joshua D. Rabinowitz, Jeffrey C. Rathmell

Correspondance:

jeff.rathmell@vumc.org

En bref :

La synthèse de nucléotides est nécessaire pour soutenir la prolifération rapide des lymphocytes T. Sugiura et al. montrent que les signaux du métabolisme des purines de novo dirigent la différenciation et la fonction des lymphocytes T et identifient le MTHFD2 comme un point de contrôle métabolique et une cible thérapeutique pour les maladies inflammatoires.

Points forts

• MTHFD2 est essentiel pour que les lymphocytes T CD4 activés maintiennent la synthèse de purine de novo

• Une quantité insuffisante de MTHFD2 favorise les phénotypes et le métabolisme de type cellule Treg dans les cellules Th17 d L'inhibition de MTHFD2 supprime la signalisation mTORC1 et modifie la méthylation des histones

• MTHFD2 peut être ciblé pour protéger contre l'inflammation et l'auto-immunité in vivo

MTHFD2 est un point de contrôle métabolique contrôlant le destin et la fonction des lymphocytes T effecteurs et régulateurs

Ayaka Sugiura,¹Gabriela Andrejeva,¹Kelsey Voss,¹Darren R. Heintzman,¹Xincheng Xu,⁵Matthew Z. Madden,¹Xiang Ye,¹Katherine L.Beier,¹Nowrin U. Chowdhury,²Melissa M. Wolf,²Arissa C.Young,¹Dalton L. Greenwood,¹Allison E. Sewell,¹Shailesh K. Shahi,³Samantha N. Freedman,³Alanna M. Cameron,⁴Patrik Förch,⁴Tim Bourne,⁴Juan C. Garcia-Canaveras,⁵John Karijolich,¹Aube C. Newcomb,²Ashutosh K. Mangalam,³Joshua D. Rabinowitz,⁵et Jeffrey C. Rathmell^1,6,*

¹Vanderbilt Center for Immunobiology, Département de pathologie, microbiologie et immunologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, États-Unis

²Département de médecine, Division d'hématologie et d'oncologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN 37232, États-Unis

³Département de pathologie, Université de l'Iowa, Iowa City, IA 52242, États-Unis

⁴Sitryx Therapeutics Limited, Magdalen Centre, Oxford Science Park, Oxford, Royaume-Uni

⁵Département de chimie, Ludwig Cancer Research Institute Princeton Branch, Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, Princeton, NJ 08544, États-Unis6Contact principal

*Correspondance : jeff.rathmell@vumc.org

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2021.10.011

SOMMAIRE

La stimulation antigénique favorise la reprogrammation métabolique des lymphocytes T pour répondre aux demandes accrues de biosynthèse, de bioénergie et de signalisation. Nous montrons que l'enzyme du métabolisme à un seul carbone (1C) méthylènetétrahydrofolate déshydrogénase 2 (MTHFD2) régule la synthèse et la signalisation de novo des purines dans les lymphocytes T activés pour favoriser la prolifération et la production de cytokines inflammatoires. Dans les cellules pathogènes T helper -17 (Th17), MTHFD2 a empêché la régulation positive aberrante du facteur de transcription FoxP3 ainsi que le gain inapproprié de capacité de suppression. Le déficit en MTHFD2 a également favorisé la différenciation des cellules T régulatrices (Treg). Mécaniquement, l'inhibition de MTHFD2 a entraîné l'épuisement des pools de purines, l'accumulation d'intermédiaires biosynthétiques de purines et une diminution de la signalisation mTORC1 du capteur de nutriments. MTHFD2 était également essentiel pour réguler la méthylation de l'ADN et des histones dans les cellules Th17. Fait important, le déficit en MTHFD2 a réduit la gravité de la maladie dans plusieurs modèles de maladies inflammatoires in vivo. MTHFD2 est donc un point de contrôle métabolique pour intégrer le métabolisme des purines à la signalisation des cellules effectrices pathogènes et constitue une cible thérapeutique potentielle dans les voies métaboliques 1C.

INTRODUCTION

Une mobilisation efficace de la réponse immunitaire adaptative nécessite une activation robuste des cellules CD4 plus T pour subir une croissance et une prolifération cellulaires rapides. Cela implique une reprogrammation métabolique, pilotée par le capteur de nutriments mTORC1, d'un état de repos catabolique à un état de croissance anabolique avec des demandes biosynthétiques, bioénergétiques et de signalisation accrues. Selon le milieu des cytokines, les lymphocytes T CD4 plus se différencient en sous-ensembles effecteurs et régulateurs qui ont des programmes métaboliques distincts pilotant leurs fonctions effectrices (Bantug et al., 2018; Buck et al., 2015). L'équilibre de ces sous-ensembles est essentiel pour une immunité normale tout en prévenant les maladies inflammatoires et auto-immunes. Par exemple, la sclérose en plaques (SEP) se caractérise par une augmentation des cellules T auxiliaires productrices d'interleukine-17 (IL- 17)-17 (Th17) et des cellules T régulatrices suppressives réduites ou inefficaces (Treg) (Dendrou et al., 2015). Cibler les programmes métaboliques spécifiques de ces sous-ensembles de lymphocytes T offre une approche alternative à l'immunothérapie.

La thérapie basée sur le métabolisme cellulaire a commencé en 1948 lorsque les agents chimiothérapeutiques anti-folates se sont révélés efficaces chez les enfants atteints de leucémie aiguë lymphoblastique (Farber et al., 1948). Le folate contribue au métabolisme à un carbone (1C) pour la biosynthèse des purines, la génération de donneurs de méthyle et le maintien de l'équilibre redox cellulaire (Ducker et Rabinowitz, 2017 ; Yang et Vousden, 2016). De nombreux médicaments, dont le méthotrexate (MTX), le fluorouracile (5-FU) et la mercaptopurine (6-MP), ont depuis été développés pour cibler cette voie. Les cellules à prolifération rapide, y compris les cellules cancéreuses et les cellules T activées, partagent des dépendances sur ces voies pour synthétiser l'ADN et l'ARN. Le MTX reste couramment utilisé pour traiter les maladies auto-immunes telles que la polyarthrite rhumatoïde (PR) (Brown et al., 2016). Cependant, en raison de la large expression des enzymes ciblées, ces agents thérapeutiques sont associés à des effets indésirables courants et potentiellement graves. L'identification de cibles d'enzymes métaboliques qui sont sélectivement importantes dans les populations cellulaires d'intérêt pourrait conduire au développement d'immunothérapies plus sûres et plus efficaces.

Le métabolisme 1C comprend les cycles du folate et de la méthionine avec transfert d'unités de carbone unique. La sérine sert de donneur 1C pour activer le tétrahydrofolate (THF) en 5,10-méthylèneTHF, avec production concomitante de glycine. Le 5,10-méthylèneTHF peut ensuite être oxydé à l'aide de NAD(P) pour générer le précurseur de purine 10- formylTHF. Alternativement, le 10-formylTHF peut être synthétisé à partir du formiate et du THF d'une manière dépendante de l'ATP. Dans la voie cytosolique, la production de 10-fomylTHF est médiée par la méthylèneTHF déshydrogénase 1 (MTHFD1). La perte de MTHFD1 affame les cellules pour le 10-formylTHF cytosolique, l'ablation de la capacité de biosynthèse de la purine et les mutations de MTHFD1 provoquent une immunodéficience combinée sévère (SCID) (Field et al., 2015). La voie mitochondriale repose sur les mitochondries MTHFD2 et MTHFD1-like (MTHFD1L).

Figure 1. Le métabolisme 1C et le MTHFD2 sont régulés positivement dans le CD4 activé^plusCellules T et dans le contexte de l'EAE

(A) Modification des espèces du métabolisme des nucléotides dans les CD4 différenciés in vitro^plusSous-ensembles de lymphocytes T comparés aux cellules naïves mesurées par spectrométrie de masse (n=3 réplicats biologiques).

(B) Flux de travail pour le dépistage CRISPR ciblé dans le modèle d'inflammation pulmonaire in vivo.

(C) Modification de l'abondance de l'ARNg à partir du dépistage CRISPR in vivo ciblé sur le métabolisme 1C dans le CD4 primaire^plusCellules T (analyse statistique réalisée par MAGeCK, n=3 réplicats biologiques).

(D) Expression de l'ARNm des gènes identifiés en (C) au cours du développement et de l'activation des lymphocytes T (données du navigateur de données ImmGen RNA-seq).

(E) Expression protéique des gènes identifiés en (C) dans les CD4 naïfs et activés^plusCellules T (données de l'Immunological Proteome Resource [ImmPRes]).

(F) Expression de l'ARNm des gènes identifiés en (C) dans le sang total d'individus présentant les troubles inflammatoires indiqués par rapport à des individus témoins sains (Aune et al., 2017). RA-MTX, PR sous traitement MTX ; LED, lupus érythémateux disséminé ; MS-Tx naïfs, SEP naïfs de traitement au moment du diagnostic ; SEP établie, SEP sous traitement et en rémission ; n=3–8 donneurs.

(G) IHC montrant la coloration CD3 et MTHFD2 dans le segment de la queue de cheval de la moelle épinière de souris présentant une EAE symptomatique à 2003 (en haut ; barre d'échelle, 100 mm) et 4003 (en bas ; barre d'échelle, 50 mm) grossissement (les données sont représentatives de deux expériences indépendantes).

(H et I) Relative (H) intensité de fluorescence moyenne (MFI) et (I) expression de l'ARNm de MTHFD2 dans CD4^plusCellules T de la rate et de la moelle épinière de souris présentant une EAE symptomatique et de la rate de souris témoins (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, les données sont représentatives de deux expériences indépendantes avec 6 répétitions biologiques totales).

(J) Expression de l'ARNm de MTHFD2 dans le CD4 indifférencié^plusCellules T 0, 5 et 24 h après activation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, n=3 réplicats biologiques).

(K) Relative MTHFD2 MFI sur 5 jours après l'activation dans les sous-ensembles de cellules CD4 plus T, normalisées aux cellules au repos (moyenne ± SD, n=3 réplicats biologiques). Voir également la figure S1. Les résultats statistiquement significatifs sont étiquetés (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" pour="" cent="">

MTHFD2 est l'un des gènes les plus fortement induits et surexprimés dans toutes les tumeurs (Nilsson et al., 2014). Bien que largement régulé positivement au cours de l'embryogenèse, MTHFD2 a peu ou pas d'expression dans la plupart des tissus adultes (Nilsson et al., 2014). Dans le traitement anticancéreux (Zhu et Leung, 2020), l'inhibition de MTHFD2 peut entraîner une augmentation du stress oxydatif (Ju et al., 2019 ; Wan et al., 2020), une dépendance à la glycine (Koufaris et al., 2016) et une insuffisance synthèse des purines (Ben-Sahra et al., 2016 ; Pikman et al., 2016). Le déficit en MTHFD2 peut également supprimer l'activité de mTORC1 par plusieurs mécanismes, notamment par l'épuisement de la guanine et l'inhibition ultérieure de la mTORC1-activant la GTPase Rheb (Emmanuel et al., 2017). Le déficit en MTHFD2 provoque également une accumulation d'intermédiaires de la voie de synthèse des purines, y compris l'analogue de l'adénosine monophosphate (AMP) 5-aminoimidazole carboxamide ribonucléotide (AICAR) (Ducker et al., 2016), qui peut activer la protéine kinase activée par l'AMP (AMPK) pour inhiber mTORC1 (Su et al., 2019).

Étant donné que le métabolisme du 1C intègre de multiples apports de nutriments et qu'il est thérapeutiquement traitable, nous avons examiné le rôle du métabolisme du 1C dans les CD4^plusEffecteur T (Teff) et sous-ensembles de cellules Treg. Grâce à un dépistage ciblé in vivo impartial basé sur CRISPR-Cas9-dans les lymphocytes T murins primaires, nous avons identifié MTHFD2 comme un hit qui était également régulé à la hausse de manière constante chez les personnes atteintes de troubles inflammatoires. Notamment, le déficit en MTHFD2 a altéré la prolifération et la fonction des cellules Teff. Le déficit en MTHFD2 a également favorisé l'expression aberrante de FoxP3 et l'activité suppressive dans les cellules Th17 tout en favorisant la différenciation des cellules Treg. Ces effets étaient associés à une accumulation d'AICAR, à une réduction des concentrations de purine, à une régulation négative de la signalisation mTORC1, à une augmentation du métabolisme mitochondrial et à une altération de la méthylation de l'ADN et des histones. In vivo, ciblant MTHFD2 protégé contre plusieurs modèles de maladies inflammatoires. Ces données montrent que MTHFD2 sert de point de contrôle métabolique dans les cellules Th17 et Treg et mettent en évidence le potentiel de cette enzyme comme cible pour l'immunothérapie anti-inflammatoire.

RÉSULTATS

Le métabolisme 1C et la synthèse des purines sont différentiellement actifs dans le CD4^plusSous-ensembles de lymphocytes T

Nous avons émis l'hypothèse que la synthèse des nucléotides peut différer d'un CD4 à l'autre.^plusSous-ensembles de lymphocytes T. CD4^plusLes cellules T ont été différenciées in vitro en cellules Th1, Th17 et Treg et collectées après 72 h pour la spectrométrie de masse. Les quantités d'espèces de nucléotides étaient généralement élevées dans tous les sous-ensembles par rapport aux cellules naïves (figure 1A). Notamment, les intermédiaires de synthèse des purines étaient différemment abondants, avec la plus forte accumulation de ribonucléotide de glycinamide (GAR), de 1-(phosphoribosyl) imidazole carboxamide (SAICAR) et d'AICAR dans les cellules Th17 (Figure S1A).

Pour tester la dépendance du CD4^plusCellules T sur les enzymes du métabolisme 1C, nous avons effectué un criblage in vivo basé sur CRISPR-Cas9-dans le CD4 primaire^plusCellules T (figure 1B). Une bibliothèque d'ARN guide personnalisé (ARNg) a été construite pour cibler les enzymes du métabolisme 1C, ainsi que le complexe de sclérose tubéreuse 2 (TSC2) comme contrôle positif et les contrôles négatifs non ciblés (NTC). CD4^plusDes cellules T isolées à partir de souris transgéniques transgéniques OT-II Cas9 à double récepteur de cellule T (TCR) spécifiques à l'ovalbumine (OVA) ont été transduites avec cette bibliothèque et transférées par voie intraveineuse dans Rag1^{__ /__}hôtes. Les souris ont ensuite été immunisées avec de l'OVA intranasal pour induire une inflammation pulmonaire. Les cellules T récupérées dans les poumons de ces souris ont été séquencées et l'enrichissement ou l'épuisement des ARNg a été établi par rapport aux fréquences d'entrée. L'ARNg de TSC2 a été enrichi, soutenant le rôle inhibiteur de cette protéine dans les cellules T. En revanche, les ARNg PPAT, AHCY, MAT2A et MTHFD1 ont été considérablement appauvris, et les ARNg GART, DHFR, DNMT1, MTRR, MTR, SHMT2 et MTHFD2 ont été réduits dans une moindre mesure, ce qui indique que ces gènes contribuent à la prolifération des cellules T et à la fonction inflammatoire. in vivo (figures 1C et S1B).

Nous avons ensuite examiné le profil d'expression des gènes identifiés à partir de l'écran. Bien que tous aient été régulés positivement de manière coordonnée dans les thymocytes en développement, l'ARNm et la protéine MTHFD2 ont été induits le plus fortement dans les cellules T périphériques stimulées (figures 1D et 1E). De plus, dans un ensemble de données de séquençage d'ARN (ARN-seq) publié séparément à partir de sang total d'individus atteints de diverses maladies inflammatoires et auto-immunes (Aune et al., 2017), MTHFD2 était surexprimé de manière constante dans plusieurs conditions, y compris la colite ulcéreuse, la maladie de Crohn , la maladie cœliaque, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé (LED), le psoriasis, le rhumatisme psoriasique, le syndrome de Sjo¨ gren et la SEP (Figure 1F). Notamment, les personnes atteintes de SEP récemment diagnostiquée présentaient une expression significativement élevée de MTHFD2 par rapport aux donneurs sains ou aux personnes atteintes de SEP suivant un traitement avec rémission de la maladie (Figure S1C). Ainsi, CD4^plusLa prolifération et la survie des lymphocytes T dépendent de certains gènes du métabolisme 1C, et l'expression de ces gènes diffère selon les stades de développement, d'activation et de différenciation des lymphocytes T ainsi que dans le cadre de l'inflammation pathologique.

Figure 2. Le déficit en MTHFD2 altère le CD4^plusProlifération et fonction des lymphocytes T

(A–D) Prolifération mesurée par (A) dilution de CellTrace Violet (CTV), (B) viabilité, (C) expression de CD25 et (D) expression de TF dans CD4^plusSous-ensembles de lymphocytes T traités avec le MTHFD2i pendant 72 h après l'activation (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques totales).

MTHFD2 est fortement régulé positivement dans les CD4 infiltrant le SNC^plusCellules T dans l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) et dans le CD4 activé^plusCellules T in vitro

La régulation de MTHFD2 n'a pas été bien décrite dans les cellules CD4 plus T. Pour mesurer l'expression de MTHFD2 dans les lésions inflammatoires in vivo, CD4^plusLes cellules T de souris 2D2 transgéniques TCR spécifiques à la myéline ont été activées et transférées de manière adoptive dans Rag1^{__ /__}souris pour induire l'EAE. Après que les souris ont commencé à présenter une paralysie des pattes postérieures, le segment de la queue de cheval de la moelle épinière a été analysé par immunohistochimie (IHC). Les souris qui ont reçu des cellules T 2D2 ont montré un enrichissement en MTHFD2 et CD3^pluscellules qui était absente dans le contrôle (figure 1G). Pour déterminer directement si CD4^plusLes cellules T ont régulé positivement MTHFD2 dans les lésions enflammées, les cellules T de la rate et de la moelle épinière de souris soumises à un modèle d'EAE induit par la glycoprotéine oligodendrocyte de la myéline (MOG) et la toxine coquelucheuse (PTX) ont été collectées pour analyse. CD4 infiltrant le SNC^plusCellules T surexprimées MTHFD2 par rapport aux CD4 spléniques appariés^plusCellules T de souris témoins et EAE, telles que mesurées par cytométrie en flux (figure 1H) et qRT-PCR (figure 1I). La cinétique d'expression de MTHFD2 dans CD4^plusLes lymphocytes T in vitro ont ensuite été mesurés. Une régulation à la hausse robuste de l'ARNm de MTHFD2 a été détectée après 5 h de stimulation et a commencé à diminuer en 24 h (Figure 1J), alors que le CD4 différencié^plusLes sous-ensembles de lymphocytes T ont atteint l'expression la plus élevée de la protéine MTHFD2 48 h après l'activation (figure 1K). Ces données montrent que MTHFD2 est régulé positivement dans CD4^plusCellules T avec activation in vitro et au site de l'inflammation in vivo.

CD4^plusLes sous-ensembles de lymphocytes T nécessitent différemment MTHFD2 pour l'activation, la prolifération, la survie et la production de cytokines

Nous avons ensuite testé le rôle de MTHFD2 dans l'activation, la différenciation, la prolifération et la fonction du sous-ensemble de cellules CD4 plus T. CD4^plusLes cellules T ont été activées in vitro en présence de cytokines pour une différenciation optimale des cellules Th1, Th17 et Treg et un véhicule ou un inhibiteur de MTHFD2 (MTHFD2i; DS18561882) (Kawai et al., 2019). Après 72 h, tous les sous-ensembles avaient réduit la prolifération (figure 2A) et le nombre de cellules cyclables vivantes (figures S2A et S2B). La viabilité a été réduite dans les cellules Th1 et Th17 (figure 2B) et l'activation, telle que mesurée par l'expression de CD25, a été réduite dans tous les sous-ensembles (figure 2C). L'expression du facteur de transcription (TF) caractérisant la lignée a été réduite dans les cellules Th1 (T-bet^plus) mais inchangé dans les cellules Th17 (ROR t^plus) et peu modifié dans les cellules Treg (FoxP3^plus) (figure 1D). Pour mesurer la fonction des cellules Teff, les cellules ont été restimulées avec de l'acétate de 12-myristate 13- (PMA) et de l'ionomycine. Significativement moins de cellules Th1 exprimaient l'interféron-g (IFNg) et moins de cellules Th17 exprimaient IL -17 lorsqu'elles étaient différenciées en présence du MTHFD2i (figure 2E). Cela n'était pas dû à une activation initiale altérée, car ces phénotypes étaient maintenus lorsque l'exposition au médicament était retardée jusqu'à 24 h après l'activation, bien que l'expression de TF caractérisant l'âge de la lignée n'ait pas été modifiée dans ce contexte (figures S2C à S2F). MTHFD2 est donc nécessaire pour un CD4 maximal^plusActivation, prolifération, survie et production de cytokines des lymphocytes T.

Pour valider génétiquement ces effets pharmacologiques, nous avons généré un Mthfd2^fl/flsouche de souris et l'a croisée avec des souris transgéniques Cd4- cre pour obtenir une suppression génétique conditionnelle. Comme prévu, CD4 activé^plusCellules T de Mthfd2^fl/flCD4-cre plus (CD4^ΔMthfd2) les souris avaient une expression plus faible de MTHFD2 par rapport aux cellules de Mthfd2^fl/flCD4-cre^plus(type sauvage [WT]) compagnons de portée (figure 2F). Au départ, les souris CD4DMthfd2 avaient légèrement moins de CD4^plusCellules T dans la rate par rapport au WT (figure 2G). Lors de l'activation et de la différenciation in vitro, le nombre de cellules et la viabilité du CD4^ΔMthfd2Les cellules Th17 et, dans une moindre mesure, les cellules Treg étaient significativement plus faibles (figure 2H). De plus, l'expression de CD25 a diminué dans les cellules Th17 et Treg et a eu tendance à baisser dans les cellules Th1 (figure 2I). Enfin, CD4^ΔMthfd2Les cellules Th1 et Th17 avaient une expression plus faible de T-bet et ROR t, respectivement. FoxP3 dans les cellules Treg, cependant, était inchangé (figure 2J). Malgré les changements dans l'expression de TF, les cellules Teff qui se différencient ont produit des quantités normales de cytokines (figure 2K). Les différences de résultats entre les approches pharmacologiques et génétiques peuvent être attribuées au moment et à l'intégralité de la perte de la fonction enzymatique au cours du développement et aux mécanismes de compensation potentiels.

Le MTHFD2i induit l'expression de FoxP3 dans les cellules Th17 et améliore la différenciation des cellules Treg

Compte tenu de la dépendance des cellules Teff vis-à-vis de MTHFD2, nous avons testé la régulation MTHFD2i des cellules FoxP3 et Treg. Notamment, la régulation à la hausse aberrante induite par le traitement MTHFD2i de FoxP3 dans Th1 et plus particulièrement dans les cellules Th17 de manière dose-dépendante (figure 3A). Cela s'est également produit lorsque le traitement a été retardé jusqu'à 24 h après l'activation (figure 3B). Une tendance similaire a été observée dans les cellules CD4DMthfd2 Th17 (figure 3C). Cette régulation à la hausse de FoxP3 était fonctionnelle car les cellules Th17 traitées par MTHFD2i ont acquis une capacité suppressive lorsqu'elles sont co-cultivées avec CD8^plusCellules T (figure 3D). Le MTHFD2i peut ainsi promouvoir les phénotypes de type cellule FoxP3 et Treg dans les cellules Th17. Le MTHFD2i a également amélioré la différenciation des cellules Treg induites. Les cellules Treg ont été différenciées avec une gamme de concentrations de facteur de croissance transformant b (TGF-b) en présence du MTHFD2i. À chaque concentration testée sauf la plus élevée, l'expression de FoxP3 a augmenté avec le traitement MTHFD2i (figures 3E et 3F). Ce phénotype a également été maintenu avec un traitement MTHFD2i retardé (figure 3G).

Figure 3. Le déficit en MTHFD2 induit l'expression de FoxP3 et favorise une évolution vers la phosphorylation oxydative

(A) Expression de FoxP3 dans les cellules Th1 et Th17 traitées par MTHFD2i 72 h après l'activation (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques totales).

(B) Expression de FoxP3 dans les cellules Th1 et Th17 activées pendant 24 h puis traitées avec un véhicule ou 500 nM MTHFD2i pendant 48 h (moyenne ± SD, test t non apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 9 répliques biologiques totales).

( C ) Expression de FoxP3 dans les cellules Th1 et Th17 des compagnons de litière WT et CD4DMthfd2 72 h après l'activation (moyenne ± SD, test t non apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques totales).

(D) Essai de suppression mesurant la capacité de suppression aberrante des cellules Th17 traitées par MTHFD2i. Des cellules Th17 prétraitées ont été co-cultivées avec des cellules CD8 plus T colorées au CTV pour mesurer la prolifération lors de l'activation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, n=3 réplicats biologiques) .

(E) Expression de FoxP3 dans des cellules Treg différenciées avec une gamme de concentrations de TGF-b et traitées avec le MTHFD2i (moyenne ± SD, test t non apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques totales).

(F) Tracés de cytométrie en flux pour les données tabulées en (E).

(G) Expression de FoxP3 dans les cellules Treg activées et différenciées avec de faibles concentrations de TGF-b pendant 24 h puis traitées avec le MTHFD2i pendant 48 h (moyenne ± SD, test t non apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 9 répliques biologiques totales ).

(H) Test de stress Seahorse XF Cell Mito effectué sur des cellules Th17 et Treg traitées au MTHFD2i (moyenne ± SD, n=3 réplicats biologiques). (I) Basal ECAR, basal OCR, max OCR et basal OCR/ECAR ratio mesuré dans (H) (moyenne ± SD, test t non apparié, les données sont représentatives de deux expériences indépendantes avec 6 répétitions biologiques totales). Les résultats statistiquement significatifs sont étiquetés (* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p pour cent 0,001).

Les cellules Treg ont un métabolisme mitochondrial plus important que les cellules Th17 (Michalek et al., 2011). Pour déterminer les conséquences métaboliques du traitement MTHFD2i, les cellules Th17 et Treg ont été évaluées par des analyses de flux extracellulaires. Le MTHFD2i a augmenté le taux de consommation d'oxygène basal et maximal (OCR) des cellules Th17 pour indiquer un changement vers la respiration mitochondriale (Figure 3H). À l'inverse, les cellules Th17 et Treg présentaient une diminution du taux d'acidification extracellulaire basale (ECAR) avec le traitement MTHFD2i, suggérant une glycolyse réduite (Figure 3I). Le rapport basal de l'OCR à l'ECAR a augmenté de manière significative dans les cellules Th17 et Treg car le MTHFD2i a déplacé le programme métabolique de la glycolyse vers la phosphorylation oxydative. Ces données montrent que le MTHFD2i améliore l'expression de FoxP3 dans les cellules Th17 et les cellules Treg différenciées dans des conditions de TGF-b faibles et déplace les cellules Th17 vers un métabolisme plus proche des cellules Treg.

Le déficit en MTHFD2 dans les lymphocytes T humains CD4 plus diminue la prolifération et la viabilité des cellules Th17 tout en augmentant l'expression de FOXP3 et en atténuant l'activité de mTORC1

Pour tester la traduisibilité des résultats ci-dessus aux cellules humaines, CD4^plusLes cellules T isolées du sang périphérique de donneurs sains ont été différenciées in vitro en cellules Th1, Th17 et Treg et traitées avec le véhicule ou MTHFD2i à partir du moment de l'activation. La prolifération a diminué de manière significative dans les cellules Th17 et Treg traitées par MTHFD2i (figure 4A), et les cellules Th17 ont également présenté une apoptose accrue (figure 4B). La diminution de la prolifération dans les cellules Th17 a été récapitulée avec une approche génétique utilisant de petits ARN interférents (siARN) (figures 4C et S2G). Semblable aux cellules murines, l'expression de FOXP3 était plus élevée dans les cellules Th17 humaines traitées au MTHFD2i et avait une tendance plus élevée dans les cellules Treg humaines traitées au MTHFD2i (figures 4D et S2H). Étant donné que l'axe mTORC1-AMPK est essentiel pour la différenciation des cellules Th17 et Treg, la phosphorylation de la protéine ribosomique cible mTORC1 S6 (phospho-S6) a également été mesurée. Cela a montré une diminution de l'activité mTORC1 dans les cellules Th17 avec MTHFD2i ou siMTHFD2 (Figure 4E). Ainsi, la perte de capacité proliférative et l'induction de l'expression de FOXP3 dans les cellules Th17 et Treg peuvent être récapitulées dans le CD4 humain primaire.^plusCellules T.

Figure 4. Le déficit en MTHFD2 altère la prolifération et induit l'expression de FOXP3 dans les cellules Th17 humaines

(A) Prolifération mesurée par dilution CTV dans des sous-ensembles de lymphocytes T CD4 humains plus traités avec un véhicule ou 2 mM MTHFD2i pendant 72 h après activation avec des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 (test t apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 5 –6 donneurs sains).

(B) Apoptose mesurée par l'annexine V dans des lymphocytes CD4 plus T humains traités avec le MTHFD2i pendant 72 h (test t apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 5 à 6 donneurs sains).

(C) Expression de Ki-67 dans des cellules CD4 humaines plus T transduites avec NTC ou siMTHFD2 (test t apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 4 patients donneurs sains).

( D ) Expression de FOXP3 dans des cellules CD4 plus T humaines traitées avec MTHFD2i pendant 72 h (test t apparié, les données sont représentatives de trois expériences indépendantes avec 6 à 10 donneurs sains).

(E) Modification de l'expression de phospho-S6 dans les CD4 humains plus les lymphocytes T traités avec MTHFD2i pendant 72 h ou transduits avec siMTHFD2 (moyenne ± SD, test t d'un échantillon, données représentatives de trois expériences indépendantes avec 4 à 6 donneurs sains). Les résultats statistiquement significatifs sont étiquetés (* p < 0.{{10}}5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" pour="" cent="">

Les cellules T reposent sur la fonction enzymatique MTHFD2 et les phénotypes peuvent être sauvés par le produit

Le MTHFD2 est nécessaire au maintien du pool de formiate mitochondrial pour la synthèse des purines (Ma et al., 2017), mais peut également jouer des rôles non enzymatiques. Soutenant l'activité enzymatique essentielle, le traitement MTHFD2i a conduit à une absorption compensatoire de formiate du milieu dans les sous-ensembles de lymphocytes CD4 plus T (figure 5A). L'unité 1C utilisée pour la synthèse du formiate est fournie par la conversion de la sérine en glycine, et la sérine intracellulaire s'est accumulée alors que la glycine a été épuisée avec le traitement MTHFD2i dans tous les sous-ensembles (figure 5B). Les concentrations de méthionine ont également légèrement augmenté, suggérant une inhibition du cycle de la méthionine. Comme prévu, étant donné que l'étape de conversion sérine-glycine est en amont de MTHFD2, ces modifications n'ont pas été sauvées par l'apport de formiate dans le milieu.

Figure 5. Les effets de MTHFD2i sur les sous-ensembles de lymphocytes T sont sauvés par le formiate exogène

(A) Absorption de formiate mesurée par spectroscopie de résonance magnétique 1 H (MRS) dans des sous-ensembles de lymphocytes CD4 plus T traités avec un véhicule ou 500 nM MTHFD2i pendant 72 h après l'activation (moyenne ± SD, test t non apparié, les données sont représentatives de deux expériences indépendantes avec 6 réplicats biologiques au total).

(B) Modification des concentrations de sérine, de glycine et de méthionine dans les cellules CD4 plus T traitées avec 500 nM MTHFD2i ou 500 nM MTHFD2i plus 1 mM formiate pendant 4 à 6 h par rapport au véhicule, mesurée par spectrométrie de masse (moyenne ± SD, n { {8}} répétitions biologiques).

(C) Nombre de cellules vivantes, viabilité et expression de CD25 dans des cellules CD4 plus T traitées par MTHFD2i sauvées avec une solution de formiate 1 mM ou une solution de purine d'adénine et de guanine 60 mM pendant 72 h après l'activation (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, les données sont représentatif de trois expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques au total).

(D) Nombre de cellules vivantes, viabilité et expression de CD25 dans les cellules CD4 plus T des compagnons de litière WT ou CD4DMthfd2 sauvés avec du formiate ou des purines pendant 72 h après l'activation (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, n=3 réplicats biologiques ).

Nous avons ensuite testé si l'ajout de formiate ou d'une solution de purine d'adénine et de guanine pouvait sauver une fonction enzymatique déficiente et inverser les effets en aval du déficit en MTHFD2. En effet, le formiate 1 mM a restauré la prolifération, la viabilité et l'activation dans les cellules traitées au MTHFD2i (figure 5C). La supplémentation en purine a sauvé la prolifération dans tous les sous-ensembles et l'activation dans les cellules Th1 et Th17, mais pas la viabilité dans tous les sous-ensembles et l'activation dans les cellules Treg. Le formiate a également sauvé la prolifération, la viabilité et l'activation dans CD4^ΔMthfd2Cellules T (figure 5D). La production de cytokines altérée dans les cellules Th1 et Th17 traitées par MTHFD2i a été inversée en quantités de véhicule avec addition de formiate ou de purine (figure 5E). Notamment, la régulation positive aberrante de FoxP3 dans les cellules Th17 a été sauvée par l'ajout de purine mais pas de formiate, alors que l'ajout de formiate et de purine a réduit l'expression de FoxP3 à la ligne de base dans les cellules Treg différenciées avec de faibles concentrations de TGF-b (Figure 5F). Les phénotypes MTHFD2i semblent dépendre du maintien par MTHFD2 des pools de formiate ou de purine mitochondriale.

MTHFD2 régule l'activité de mTORC1 et la méthylation de l'ADN et des histones dans CD4^plusCellules T

Dans les cellules cancéreuses immortalisées, le déficit en MTHFD2 peut entraîner une accumulation des intermédiaires de synthèse des purines GAR, SAICAR et AICAR, qui sont en amont des étapes de formylation médiées par le 10-formylTHF (Ducker et al., 2016). CD4^plusLes sous-ensembles de lymphocytes T ont été cultivés pendant 72 h avant d'être exposés au MTHFD2i pendant 4 à 6 h. Ce court laps de temps a été choisi pour éviter tout effet secondaire, y compris les changements compensatoires. Le traitement transitoire MTHFD2i a entraîné une accumulation de GAR, SAICAR et AICAR dans tous les sous-ensembles (figure 6A). Cet effet a été entièrement sauvé par l'ajout de formiate 1 mM, soutenant un rôle enzymatique de MTHFD2. Les nucléotides et les nucléobases, y compris la guanine, ont également été appauvris par le MTHFD2i et sauvés par le formiate dans les cellules Th17 et Treg (figure 6B).

Figure 6. MTHFD2i entraîne une accumulation d'intermédiaires de synthèse de purine atténuant l'activité de mTORC1 et altérant la méthylation de l'ADN et des histones

(A) Modification des concentrations de GAR, SAICAR et AICAR dans les cellules CD4 plus T traitées avec 500 nM MTHFD2i ou 500 nM MTHFD2i plus 1 mM formiate pendant 4 à 6 h par rapport au véhicule, mesurées par spectrométrie de masse (moyenne ± SD, un- façon ANOVA, n=3 réplicats biologiques).

(B) Modification des espèces du métabolisme des nucléotides dans les cellules Th17 et Treg traitées avec MTHFD2i avec ou sans formiate pendant 4 à 6 h par rapport au véhicule, mesurée par spectrométrie de masse (n=3 réplicats biologiques).

(C) Immunoblot de phospho-S6, S6, Rheb, phospho-ACC, ACC, HIF-1a et b-actine dans les cellules CD4 plus T traitées avec MTHFD2i avec ou sans formiate pendant 72 h après l'activation (données représentatif de trois expériences indépendantes avec n=3 réplicats biologiques).

(D) Changement des métabolites du cycle TCA dans les cellules Th17 traitées avec MTHFD2i avec ou sans formiate pendant 6 h par rapport au véhicule, mesuré par spectrométrie de masse (moyenne ± SD, ANOVA unidirectionnelle, n=3 réplicats biologiques).

(E) Cartes thermiques du rapport de contrôle H3K27me3 sur IgG dans les régions de ±10-kb autour des promoteurs des gènes connus de l'UCSC dans les cellules Th17 et Treg traitées avec MTHFD2i, mesurées par CUT&RUN (données regroupées à partir de 3 répétitions biologiques).

(F) Carte thermique de la fréquence médiane de méthylation de l'ADN du locus Foxp3 par site CpG dans les cellules Th1 et Th17 traitées avec le véhicule ou 500 nM MTHFD2i et dans les cellules nTreg des compagnons de litière WT ou CD4DMthfd2 (test de Mood, n=3 réplicats biologiques).

(G) Tabulation de (F) par promoteur proximal, promoteur distal et TSDR (test t apparié). Voir également les figures S3 et S4. Les résultats statistiquement significatifs sont étiquetés (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" pour="" cent="">

L'AICAR et les nucléotides sont des régulateurs établis de l'axe mTORC1-AMPK (Emmanuel et al., 2017 ; Kim et al., 2016). En effet, l'expression de phospho-S6 a été diminuée avec le traitement MTHFD2i dans tous les sous-ensembles et entièrement restaurée par l'ajout de formiate (figures 6C et S3A). La protéine de liaison au GTP Rheb, un activateur obligatoire de mTORC1, peut être sensible à la disponibilité intracellulaire de la guanine (Emmanuel et al., 2017), et l'expression de Rheb a été atténuée par le traitement MTHFD2i (figures 6C et S3B). AICAR est un analogue de l'adénosine et un activateur de l'AMPK (Rae et Mairs, 2019 ; Su et al., 2019). Cependant, 72 h après l'activation, la phosphorylation de l'AMPK ou de ses cibles, l'acétyl-coenzyme A(CoA) carboxylase (phospho-ACC) et Unc-51-like autophagy activating kinase (phospho-ULK1), n'a pas changé avec le traitement MTHFD2i (Figures 6C, S3C et S3D). L'activité de mTORC1 favorise Th17 et atténue la différenciation des cellules Treg en partie par l'induction du métabolisme glycolytique dépendant de HIF-1a (Shi et al., 2011). Conformément à cela, l'expression de HIF-1a a diminué dans les cellules traitées par MTHFD2i et CD4DMthfd2 Th17 (figures 6C, S3E et S3F). Ces modifications de l'activité de mTORC1 n'étaient associées à aucun déficit de la signalisation TCR, telle que mesurée par l'expression de Nur77 avec et sans restimulation (Figure S3G). L'activité du transducteur de signal et de l'activateur de la transcription 3 (STAT3), qui est essentielle pour le développement des cellules Th17, est restée inchangée ou a légèrement augmenté avec le traitement MTHFD2i (Figure S3H). Une diminution de l'activité de mTORC1 et un passage de la glycolyse à la phosphorylation oxydative avec le traitement MTHFD2i ont suggéré des changements dans l'abondance relative des métabolites du cycle de l'acide tricarboxylique (TCA). Les concentrations de succinate et de fumarate ont été réduites de manière significative par le MTHFD2i mais sauvées par le formiate (figure 6D).

Les métabolites du TCA sont des inhibiteurs connus de l'ADN et des histones déméthylases (Su et al., 2016), et l'épuisement des pools de succinate et de fumarate peut favoriser un état hypométhylé. La tri-méthylation de H3K27 (H3K27me3) à travers le génome a été mesurée par séquençage CUT&RUN (clivage sous cibles et libération à l'aide de nucléase) (Skene et Henikoff, 2017). En effet, les cellules Th17 traitées par MTHFD2i avaient réduit H3K27me3 par rapport au véhicule (figures 6E et S4A). La méthylation de l'ADN au locus Foxp3 a également été mesurée par séquençage au bisulfate pour déterminer si la méthylation différentielle contribuait à la régulation à la hausse de FoxP3 induite par MTHFD2i. Bien que plusieurs loci CpG aient différé dans la fréquence de méthylation entre le véhicule et les conditions MTHFD2i, il n'y avait aucun motif discernable dans la région déméthylée spécifique des cellules Treg (TSDR). Il n'y avait également aucune différence entre les cellules nTreg (CD4 plus CD25 plus) isolées des souris WT et CD4DMthfd2 (figure 6F), bien que la pureté de chaque population enrichie soit faible (figure S4B). Cependant, il y avait une diminution significative de la fréquence de méthylation de l'ADN sur la région promotrice proximale Foxp3 dans les cellules Th17 traitées par MTHFD2i par rapport au véhicule (figure 6G), indiquant une amélioration possible de la transcription avec MTHFD2i.

En plus de maintenir le pool de formiate intracellulaire, l'activité MTHFD2 contribue à l'équilibre redox cellulaire par la conversion du NAD^plusà NADH et NADP^plusau NADPH (Shin et al., 2017) et soutien de la voie de transsulfuration et de la synthèse ultérieure du glutathion. Les cellules Th17 traitées au MTHFD2i avaient des concentrations réduites de NAD^plus, NADH, NADP^plus, et NADPH, qui a été sauvé avec du formiate (Figure S4C). Cependant, NAD^plus/NADH et NADP^plusLes ratios /NADPH étaient inchangés dans toutes les conditions. Ceci, combiné à l'absence de changement dans les espèces réactives de l'oxygène cellulaire (ROS) et le superoxyde mitochondrial (Figure S4D), suggère que les changements dans l'état redox sont peu susceptibles d'être un contributeur majeur au phénotype MTHFD2i.

Le déficit en MTHFD2 in vivo réduit la gravité de multiples maladies inflammatoires

L'efficacité de MTHFD2 en tant que cible thérapeutique a ensuite été testée dans un modèle in vivo d'hypersensibilité de type retardé dépendant des lymphocytes T (DTH). Les souris ont été immunisées et provoquées sur l'oreille avec de l'hémocyanine de patelle (KLH) pour induire une inflammation locale et traitées avec un véhicule oral ou MTHFD2i. Le traitement n'a montré aucune toxicité manifeste car les animaux ont maintenu leur poids (Figure S5A). Il est important de noter que l'épaisseur et le poids de l'oreille ont augmenté chez les souris DTH témoins, mais pas chez les animaux traités avec un inhibiteur, ce qui indique une protection contre l'inflammation lors du traitement par MTHFD2i (figures 7A, 7B et S5B). L'immunoglobuline G spécifique de KLH (IgG) a également été réduite à la dose la plus élevée d'inhibiteur, indiquant des effets potentiels s'étendant à la fonction des cellules B (figure 7C).

Figure 7. Le ciblage de MTHFD2 in vivo réduit la gravité de la maladie dans les modèles DTH, EAE et IBD

(A et B) Épaisseur relative de l'oreille (A) et poids de la biopsie (B) 10 jours après KLH avec immunisation CFA et 3 jours après le défi KLH pour induire la DTH (ANOVA unidirectionnelle). Les souris ont été traitées deux fois par jour avec 0, 100 ou 300 mg/kg de MTHFD2i par voie orale (moyenne ± SEM, n=8 réplicats biologiques).

(C) Concentrations d'IgG spécifiques de KLH au jour 10 de DTH induite par KLH (moyenne ± SEM, test de Kruskal-Wallis, n=8 réplicats biologiques).

(D) Score clinique moyen au fil du temps chez les compagnons de litière WT et CD4DMthfd2 immunisés avec MOG avec CFA et PTX pour induire l'EAE (moyenne ± SEM, plusieurs tests de Mann-Whitney, les données sont représentatives de deux expériences indépendantes, chacune avec 5 répétitions biologiques).

(E) Nombre de cellules et fréquence des cellules CD4 plus T dans la moelle épinière des souris EAE au pic de gravité de la maladie (moyenne ± SEM, test t non apparié, les données sont représentatives de deux expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques totales).

(F) Expression de CD25 et CD44 dans les cellules CD4 plus T de la moelle épinière de souris EAE (moyenne ± SEM, test t non apparié, n=4 réplicats biologiques).

(G et H) Nombre de cellules de (G) T-bet plus , RORgt plus , FoxP3 plus , FoxP3 plus /T-bet plus ratio, FoxP3 plus /RORgt plus ratio et (H) IL-17 plus , IFNg plus et IL -17 plus IFNg plus CD4 plus cellules T de la moelle épinière de souris EAE (moyenne ± SEM, test t non apparié, les données sont représentatives de deux expériences indépendantes avec 9 répétitions biologiques totales).

(I) Coloration H&E, IHC anti-CD3 et Luxol Fast Blue (LFB) pour la myéline dans la moelle épinière d'une souris WT sans immunisation et compagnons de litière WT et CD4DMthfd2 avec EAE au pic de la maladie (grossissement de 2003, représentatif de 5 répliques biologiques ).

(J) Changement de poids corporel au fil du temps de Rag1^__/__les souris ont injecté par voie ip des cellules CD4 plus naïves WT ou CD4DMthfd2 pour induire une colite IBD (moyenne ± SEM, tests t multiples, n=8 réplicats biologiques).

(K et L) Nombre de cellules de (K) cellules CD4 plus T totales et (L) T-bet plus, RORgt plus et FoxP3 plus CD4 plus cellules T des MLN de souris IBD (moyenne ± SEM, test t non apparié n { {4}} répétitions biologiques). Voir également les figures S5 et S6. Les résultats statistiquement significatifs sont étiquetés (* p < 0.05,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< 0,001,="" ****="" p="" pour="" cent="">

De même, le double inhibiteur de MTHFD1/2 LY345899 (Gustafsson et al., 2017) a été efficace pour améliorer la maladie dans un modèle EAE. L'EAE a été induite avec MOG et PTX, et les souris ont été traitées quotidiennement avec une injection intrapéritonéale (ip) de DMSO ou de LY345899. Le traitement par inhibiteur a entraîné une réduction significative de la gravité de la maladie et du score clinique cumulé par rapport au véhicule (Figures S5C et S5D). Les souris ont été sacrifiées au jour 26 et les cellules infiltrant la moelle épinière ont été collectées pour le profilage immunitaire. Notamment, beaucoup moins de CD45^plus, CD4^plus, et CD8^plusles cellules ont infiltré la moelle épinière des souris traitées au LY345899- (Figures S5E–S5G). Il n'y a eu aucun changement dans la fréquence de ROR t^plusou FoxP3^pluscellules parmi les CD4 infiltrants^plusCellules T (Figure S5H). Cependant, il y a eu une diminution de la fréquence des cellules IFNg plus IL -17 plus et une augmentation des cellules IL -17 plus (Figure S5I), suggérant un passage possible à un phénotype moins pathogène.

Pour tester directement la dépendance intrinsèque des lymphocytes T à MTHFD2 in vivo, les compagnons de litière WT et CD4DMthfd2 ont été soumis à trois modèles différents : EAE, maladie inflammatoire de l'intestin (MII) et maladie allergique des voies respiratoires. L'EAE a de nouveau été induite avec MOG et PTX et, comme dans l'expérience sur les inhibiteurs, les souris CD4DMthfd2 ont considérablement réduit la gravité de la maladie sur 26 jours (figure 7D). Une cohorte distincte a été euthanasiée au pic de la maladie au jour 15 après l'induction pour le phénotypage des lymphocytes T (figures S6A et S6B). Bien que CD4^plusou CD8^plusLe nombre de lymphocytes T était inchangé dans la rate (Figure S6C), l'infiltration de CD4 plus les lymphocytes T dans la moelle épinière a diminué de manière significative (Figure 7E). Les cellules CD4 plus T infiltrant la moelle épinière chez les souris CD4DMthfd2 avaient une expression de CD25 similaire à celle du WT mais une expression réduite de CD44, indiquant une activation partiellement altérée (Figure 7F). Les numéros de T-bet^plus, ROR t plus et les cellules FoxP3 plus (figure 7G), ainsi que les cellules IL -17 plus et IFNg plus (figure 7H), ont également été réduites dans la moelle épinière des souris CD4DMthfd2 par rapport au WT. Notamment, les rapports de FoxP3 plus à T-bet plus et RORgt plus les cellules étaient élevés chez les souris CD4DMthfd2 par rapport au WT au pic de la maladie, reflétant les résultats in vitro d'une expression accrue de FoxP3 avec un déficit en MTHFD2 (Figure 7G). Bien que la fréquence des cellules exprimant le TF parmi les cellules infiltrantes ait globalement augmenté, la fréquence d'expression des cytokines était inchangée (figures S6D et S6E). Histologie de la moelle épinière de souris témoins sans EAE et WT et CD4^ΔMthfd2les souris avec EAE ont montré une cellularité accrue et une positivité CD3 dans la moelle épinière chez les souris WT qui était associée à la démyélinisation, comme le montre la coloration Luxol Fast Blue (Figure 7I). Ces changements étaient absents chez le témoin sans EAE et CD4^ΔMthfd2souris.

Le rôle de MTHFD2 a ensuite été testé dans des modèles de MII et de maladies respiratoires allergiques. Les lymphocytes T CD4 plus naïfs WT et CD4DMthfd2 ont été transférés à Rag1 / receveurs pour initier l'IBD. Bien que les souris qui ont reçu des cellules WT aient commencé à perdre du poids au fur et à mesure que l'IBD progressait, les receveurs de cellules T CD4DMthfd2 ont continué à prendre du poids (Figure 7J). Un nombre et une fréquence significativement inférieurs de lymphocytes T CD4DMthfd2 ont été trouvés dans la rate (Figure S6F) et les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) drainant le côlon (Figures 7K et S6G). Le nombre de lymphocytes T-bet plus, ROR t plus et FoxP3 plus CD4DMthfd2 a également diminué dans les MLN, mais la fréquence des cellules FoxP3 plus a augmenté (figures 7L et S6H). Cependant, il n'y avait aucune différence dans les ratios de comptage de cellules FoxP3/T-bet et FoxP3/RORgt dans les MLN à ce stade avancé (Figure S6I). Semblable aux résultats de MTHFD2 comme un succès modeste dans l'écran CRISPR d'inflammation des voies respiratoires in vivo (Figure 1C), les souris CD4DMthfd2 soumises à une maladie allergique des voies respiratoires induite par Alternaria avaient une tendance à la diminution de l'abondance des neutrophiles dans le liquide de lavage bronchioalvéolaire (BALF), bien qu'aucun des changements ont été observés dans le nombre de lymphocytes, d'éosinophiles et de macrophages BALF (Figure S7A).

Enfin, l'effet du MTHFD2i a été testé sur l'activité immunitaire générale. OT-II CD45.2 spécifique à l'OVA^plusCD4^plusLes cellules T ont été transférées de manière adoptive dans CD45.1^plussouris, qui ont ensuite été immunisées par voie sous-cutanée avec une émulsion d'OVA avec adjuvant complet de Freund (CFA) et traitées quotidiennement avec le véhicule oral ou le MTHFD2i. Le poids corporel était inchangé dans toutes les conditions (Figure S7B). Extension de l'OT-II CD45.2 transféré^plusles cellules ont été légèrement retardées chez les souris immunisées traitées au MTHFD2i, mais ont atteint le nombre de véhicules au jour 7 (Figures S7C – S7E). Cependant, la fréquence des cellules IFNg plus a été réduite dans les LN drainants (Figure S7F). Ces données montrent que le traitement MTHFD2i in vivo permet l'expansion des lymphocytes T spécifiques de l'antigène après une stimulation aiguë, bien qu'avec une production de cytokines inflammatoires atténuée.

DISCUSSION

L'activation, la différenciation et la fonction des lymphocytes T nécessitent une reprogrammation métabolique appropriée pour répondre aux besoins accrus des cellules en énergie, en blocs de construction biosynthétiques et en molécules de signalisation. Dans cette étude, nous avons étudié la fonction du métabolisme 1C dans les lymphocytes CD4 plus T primaires. En utilisant une combinaison de données de dépistage et d'expression génique basées sur le CRISPR des cellules T primaires in vivo, MTHFD2 a été identifié comme une cible potentielle pour les thérapies anti-inflammatoires. L'inhibition ou la déficience de MTHFD2 a généralement entraîné une diminution de la prolifération des lymphocytes CD4 et T. Notamment, cela a été associé à l'induction de l'expression de FoxP3 et à la fonction suppressive dans les cellules Th17 ainsi qu'à une différenciation améliorée des cellules Treg. Ces données suggèrent que le MTHFD2 pourrait fonctionner comme un point de contrôle métabolique dans l'axe des cellules Th17-Treg, le traitement au MTHFD2i faisant la balance entre un phénotype pathogène et un phénotype plus anti-inflammatoire. En effet, l'inhibition ou la déficience génétique de MTHFD2 a amélioré la gravité de la maladie dans plusieurs modèles in vivo d'auto-immunité et d'hypersensibilité.

Le métabolisme 1C comprend le métabolisme de la sérine-glycine, le cycle du folate et le cycle de la méthionine et est au cœur de plusieurs processus, notamment la synthèse de novo de la purine, la génération de donneurs de méthyle et la régulation redox (Yang et Vousden, 2016). Le métabolisme du 1C est fortement engagé avec la stimulation du TCR (Tan et al., 2017) et nécessaire pour soutenir l'expansion des lymphocytes T (Ma et al., 2017). Le cycle du folate est compartimenté en composants cytosoliques et mitochondriaux. Dans le cytosol, MTHFD1 interconvertit 5,10-méthylèneTHF, 10-formylTHF et formiate. Dans les mitochondries, les mêmes réactions sont accomplies par MTHFD2 et MTHFD1L. Ces intermédiaires résultants sont utilisés pour soutenir les étapes de formylation dans la synthèse de purine de novo. MTHFD1 et MTHFD2 peuvent également moduler l'état redox par la génération de NAD(H) et NADP(H) (Ducker et Rabinowitz, 2017). Bien que certains types de cellules affichent une flexibilité pour passer à la source cytosolique dans des contextes de dysfonctionnement de la voie mitochondriale (Ducker et al., 2016), il a été proposé précédemment que les cellules T dépendent principalement de la voie mitochondriale pour fournir des unités 1C et des espèces réductrices (Ron- Harel et al., 2016). Il a également été démontré que les lymphocytes T dépendent de l'absorption de sérine, et les réponses immunitaires in vivo peuvent être modulées par les quantités de sérine alimentaire. Les effets de la privation de sérine sont médiés en limitant la biosynthèse des purines même en présence de voies de récupération intactes et peuvent être contournés par l'apport de glycine et de formiate (Ma et al., 2017). Nos données s'ajoutent à ces résultats et indiquent que le MTHFD2 est un régulateur critique qui influence le CD4^plusProlifération et différenciation des lymphocytes T.

Échanicoside

Bien que le métabolisme 1C joue un rôle important dans le métabolisme cellulaire, nous avons constaté que certaines fonctions étaient distinctes pour sélectionner des sous-ensembles de lymphocytes T. Toutes les cellules T humaines et de souris ont proliféré dans une moindre mesure avec un déficit en MTHFD2, indiquant une fonction partagée pour MTHFD2 pour soutenir la croissance et la division des cellules T. Cependant, les effets du déficit en MTHFD2 sur la différenciation des lymphocytes T et la fonction effectrice différaient dans chaque sous-ensemble testé. Les cellules Th1 ont montré une différenciation altérée avec une réduction de l'induction de T-bet et une diminution de la production de cytokines. Les cellules Th17 présentaient également une différenciation altérée et une production réduite de cytokines. Bien que ROR t n'ait pas été modifié, les cellules Th17 déficientes en MTHFD 2- ont régulé positivement la cellule Treg TF FoxP3 et ont acquis la capacité de supprimer la prolifération des cellules CD8 plus T activées. Les cellules Treg ont montré une différenciation accrue dans des conditions de faible TGF-b. Il est désormais bien établi que chacun de ces sous-ensembles peut avoir des besoins métaboliques distincts (Bantug et al., 2018 ; Buck et al., 2015). Nos données montrent que MTHFD2 est également requis de manière sélective pour les cellules Teff tout en favorisant le destin et la fonction des cellules Treg. Il est à noter que ces résultats diffèrent des déficiences GLUT1, GLS ou ASCT2 qui altèrent ou altèrent la différenciation des cellules Teff tout en ayant des effets modestes pour promouvoir directement la différenciation des cellules Treg ou la transdifférenciation des cellules Th17 en cellules Treg (Johnson et al., 2018 ; Macintyre et al ., 2014 ; Nakaya et al., 2014).

Ces destins distincts des lymphocytes T semblent dépendre de l'activité enzymatique de MTHFD2, car les effets du déficit en MTHFD2 ont été sauvés avec des nucléobases de formiate ou de purine. Bien que nous n'ayons trouvé aucun effet significatif de l'équilibre redox altéré avec un déficit en MTHFD2, la synthèse de purine de novo altérée semble être critique. Le traitement au MTHFD2i a entraîné une diminution des concentrations de purine, en particulier de guanine, tout en induisant une accumulation des intermédiaires de synthèse de purine GAR, SAICAR et AICAR. Ces intermédiaires nécessitent une formylation pour une biosynthèse supplémentaire, et les effets ont été sauvés lorsque le formiate de métabolite dérivé de MTHFD 2- a été ajouté au milieu, soutenant un mécanisme biochimique ciblé pour le MTHFD2i. La synthèse de novo de nucléotides pour soutenir la synthèse d'ADN et d'ARN est essentielle pour la prolifération des lymphocytes T (Que´me´neur et al., 2003, 2004). Ainsi, un composant du mécanisme par lequel le MTHFD2i altère l'expansion des lymphocytes T semble être une génération insuffisante de nucléotides.

Flavonoïde

L'incapacité à synthétiser des nucléotides adéquats peut supprimer les lymphocytes T effecteurs par de multiples mécanismes. AMPK et mTORC1 sont des moteurs majeurs de la reprogrammation métabolique avec des rôles généralement opposés dans les cellules Teff et Treg (Bantug et al., 2018 ; Buck et al., 2015). Nous montrons que le traitement par MTHFD2i dans les lymphocytes T a entraîné une accumulation aiguë d'AICAR, un métabolite remarquable en tant qu'analogue de l'adénosine et activateur de l'AMPK (Rae et Mairs, 2019 ; Su et al., 2019). Cependant, il n'y avait aucune preuve d'augmentation de l'activité de l'AMPK aux moments sélectionnés. Cela peut refléter une régulation supplémentaire de l'AMPK, mais l'AICAR peut également avoir des effets indépendants de l'AMPK (Dembitz et al., 2019). mTORC1 est également sensible aux concentrations de purine, car la diminution de la disponibilité de la guanine supprime l'activité de l'activateur mTORC1 Rheb (Emmanuel et al., 2017 ; Hoxhaj et al., 2017). L'accumulation d'AICAR et la réduction de l'activité de mTORC1 peuvent ainsi contribuer à une génération altérée de cellules Th1 et Th17 traitées par MTHFD2i et à une génération accrue de cellules Treg. La suppression de la signalisation mTORC1 peut également contribuer au passage du programme métabolique de la glycolyse à la respiration mitochondriale et à la modification de l'abondance des métabolites TCA dans les cellules Th17 traitées par MTHFD2i. La voie mTORC1 joue un rôle central dans la promotion du métabolisme anabolique et peut entraîner l'accumulation de TF ATF4, qui, à son tour, peut induire l'expression de MTHFD2 (Ben-Sahra et al., 2016).

Le flux métabolique est lié à la régulation épigénétique car les métabolites contribuent à de nombreuses modifications épigénétiques (Sharma et Rando, 2017), y compris le métabolisme 1C pour générer le donneur universel de méthyle S-adénosyl méthionine (SAM) pour la méthylation des protéines et de l'ADN. Cependant, les expériences de traçage du carbone dans les cellules T activées suggèrent que les unités 1C dérivées de la sérine dérivée du glucose et exogène ne contribuent pas de manière significative au cycle de la méthionine et à la méthylation (Ma et al., 2017). Le flux métabolique peut également affecter les schémas de méthylation en modifiant l'abondance des métabolites du TCA, notamment l'alpha-cétoglutarate, le fumarate et le succinate. Plus précisément, le fumarate et le succinate inhibent l'ADN et les histones déméthylases (Su et al., 2016). Conformément à l'épuisement de ces métabolites dans les cellules Th17 traitées par MTHFD2i, H3K27me3 a été largement réduit dans tout le génome et la méthylation de l'ADN a été réduite spécifiquement au niveau du promoteur proximal Foxp3, ce qui pourrait contribuer au phénotype de transdifférenciation. Le phénotype de transdifférenciation des cellules Th17 n'a pas été sauvé par la supplémentation en formiate, ce qui indique que des voies supplémentaires contribuent probablement à la régulation de FoxP3, par exemple par l'activité d'autres mécanismes de détection de concentration de nucléotides

Actéoside (Verbascoside)

Il a également été rapporté que MTHFD2 jouait des rôles non enzymatiques pouvant contribuer aux actions pro-inflammatoires de cette enzyme. Dans les cellules cancéreuses, MTHFD2 peut avoir des fonctions nucléaires, co-localisant avec les sites de réplication de l'ADN pour favoriser la progression du cycle cellulaire (Gustafsson Sheppard et al., 2015). Dans les cellules souches murines, il a été démontré que MTHFD2 module la réparation de l'ADN pour maintenir la stabilité génomique (Yue et al., 2020). Dans le carcinome à cellules rénales, MTHFD2 s'est avéré crucial pour la reprogrammation métabolique via la méthylation de l'ARNm (Green et al., 2019). Bien que ces rôles pour MTHFD2 ne soient pas mutuellement exclusifs avec nos découvertes, la capacité du formiate à sauver de nombreux phénotypes de déficience en MTHFD2 dans les lymphocytes T suggère que l'activité enzymatique de MTHFD2 est le principal moteur de la prolifération et du destin des lymphocytes T.

Le MTHFD2 a été largement considéré comme une cible médicamenteuse dans les contextes anticancéreux. Il peut également être une cible anti-inflammatoire prometteuse et offrir moins d'effets indésirables par rapport aux anti-folates actuellement disponibles, compte tenu de la faible expression dans la plupart des tissus adultes. Par exemple, une cible du MTX, la DHFR, est largement exprimée dans les tissus adultes (Nilsson et al., 2014). Par conséquent, le MTX peut être associé à une variété d'effets indésirables, y compris une toxicité gastro-intestinale. De plus, le mécanisme d'action du MTX reste mal connu malgré sa longue histoire (Cronstein et Aune, 2020). L'expression hautement régulée de MTHFD2 et le potentiel de redondance avec la voie cytosolique MTHFD1 peuvent entraîner une dépendance sélective de populations cellulaires spécifiques à MTHFD2. Nos résultats identifient MTHFD2 comme un point de contrôle métabolique critique dans CD4^plusCellules T. Bien qu'il existe un large chevauchement entre la biologie des cellules cancéreuses et la biologie des lymphocytes T à prolifération rapide, nous constatons que les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 plus affichent une sensibilité supplémentaire grâce à la modulation de la différenciation et de la fonction cellulaires. Il est probable que le ciblage de MTHFD2 dans les thérapies anticancéreuses puisse restreindre l'immunité anti-tumorale. Cependant, des contextes tels que le carcinome colorectal, où l'inflammation médiée par les cellules Th17 contribue à la maladie, peuvent être bien adaptés au MTHFD2is. La sensibilité des cellules T au MTHFD2is peut être une forme efficace d'immunothérapie dans les contextes de CD4^plusInflammation induite par les lymphocytes T au-delà du cancer et entraînant moins d'effets indésirables que les agents thérapeutiques actuellement disponibles.

Limites de l'étude

Le MTHFD2i utilisé dans cette étude a une valeur IC50 de 0.0063 mM pour MTHFD2 et 0,57 mM pour MTHFD1 ; par conséquent, des effets hors cible mineurs de la double inhibition de MTHFD2 et MTHFD1 ne peuvent être exclus. Étant donné que la régulation à la hausse aberrante de FoxP3 dans les cellules Th17 n'a pas été sauvée par l'apport de formiate mais que l'activité de mTORC1 l'a été, le mécanisme sous-jacent à ce phénotype nécessite une enquête plus approfondie. De plus, tous les modèles in vivo ont été réalisés avec un traitement MTHFD2i ou une ablation génétique à partir du moment de l'induction de la maladie, et le phénotypage des lymphocytes T a été réalisé à un seul moment. Pour mieux caractériser l'effet de la déficience en MTHFD2 sur la pathogenèse de la maladie, d'autres études devraient inclure des expériences au cours du temps avec une caractérisation en série des populations de lymphocytes T afin de déterminer plus définitivement si les sous-ensembles de lymphocytes CD4 plus T sont affectés de manière différentielle in vivo. Enfin, pour améliorer la pertinence de cette étude pour les applications cliniques, l'efficacité du traitement MTHFD2i commencé après le début de la maladie doit être testée.

MÉTHODES STAR★

Des méthodes détaillées sont fournies dans la version en ligne de ce document et incluent les éléments suivants :

• TABLEAU DES RESSOURCES CLÉS

• LA DISPONIBILITÉ DES RESSOURCES

• B Contact principal

• B Disponibilité des matériaux

• B Disponibilité des données et des codes

  
  

• MODÈLE EXPÉRIMENTAL ET DÉTAILS DU SUJET

• B Souris B Cellules T humaines

• Lignées cellulaires B

  
  

• DÉTAILS DE LA MÉTHODE

• B CD4 de souris in vitro^plusActivation et différenciation des lymphocytes T

• Test de suppression des cellules B Th17

• B CD4 humain in vitro^plusConditions de culture des lymphocytes T

• B Criblage CRISPR B Métabolomique par spectrométrie de masse

• Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire du proton B (1H-MRS)

• B Immunoblot

• B CUT&RUN B Séquençage au bisulfite NextGen ciblé EpigenDx

• B Modèles EAE in vivo pour IHC et cytométrie en flux

• B Traitement LY345899 in vivo dans le modèle EAE

• B Traitement DS18561882 in vivo dans le modèle DTH B Modèle IBD in vivo avec WT et CD4^ΔMthfd2compagnons de portée

• B Modèle de maladie allergique des voies respiratoires in vivo avec WT et CD4^ΔMthfd2compagnons de portée

• B Traitement DS18561882 in vivo dans le modèle d'immunisation OVA

  
  

• QUANTIFICATION ET ANALYSE STATISTIQUE

INFORMATION SUPPLÉMENTAIRE

Des informations supplémentaires sont disponibles en ligne sur https://doi.org/10.1016/j. immuni.2021.10.011.

REMERCIEMENTS

Nous remercions les membres du laboratoire Rathmell pour leur contribution à ce projet. Nous remercions Thomas Aune pour avoir fourni les données RNA-seq et J. Cools (VIB) pour avoir fourni la construction pMx-U6-gRNA-GFP. Nous remercions Max R. Van Belkum pour la conception des amorces MTHFD2 qPCR. Nous remercions Nello Mainolfifi, Vipin Suri, Adam Friedman et Mark Manfredi de Raze Therapeutics, Inc. (Boston, MA) pour avoir fourni le composé Raze 1459, qui a été utilisé pour corroborer les résultats (données non présentées). Les diagrammes ont été créés avec BioRender. Nous reconnaissons la ressource partagée de pathologie translationnelle, soutenue par la subvention de soutien du NCI/NIH Cancer Center 5P30 CA68485-19 et la subvention d'instrumentation partagée S10 OD023475-01A1, pour le Leica Bond RX. Ce travail a été soutenu par le William E. Paul Distinguished Innovator Award pour la Lupus Research Alliance (à JCR), R01s DK105550 (à JCR), HL136664 (à JCR et DCN), CA217987 (à JCR), AI153167 (à JCR), AI137075 (vers AKM), T32 DK101003 (KV) et T32 GM007347 (vers AS).

LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR

AS, GA et JCR ont conçu la recherche. AS, GA, KV, DRH, XX, MZM, XY, KLB, NC, MMW, ACY, DLG, AES, SKS, SNF, AMC, PF, TB et JCG-C. effectué la recherche. AS, GA, XY, JK, DCN, AKM, JDR et JCR ont analysé les données. AS et JCR ont rédigé l'article avec les contributions des autres auteurs.

DÉCLARATION D'INTÉRÊTS

JCR est fondateur, membre du conseil consultatif scientifique et actionnaire de Sitryx Therapeutics ; membre du conseil consultatif scientifique et actionnaire de Caribou Biosciences; membre du conseil consultatif scientifique de NirogyTherapeutics ; a été consultant pour Merck, Pfizer et Mitobridge au cours des 3 dernières années ; et a reçu un soutien à la recherche d'Incyte Corp., CalitheraBiosciences et Tempest Therapeutics. JDR est co-fondateur et actionnaire de Raze Therapeutics, Toran, Serien Therapeutics et Farber Partners et conseiller et actionnaire d'Agios Pharmaceuticals, Kadmon Pharmaceuticals, Bantam Pharmaceuticals, Colorado Research Partners, RafaelHoldings, le Barer Institute et LEAF Pharmaceuticals ; il a reçu des honoraires de consultation et des fonds de recherche de Pfizer et Rafael et est l'inventeur de brevets détenus par l'Université de Princeton. AMC, PF et TB sont des employés de Sitryx Therapeutics.

INCLUSION ET DIVERSITÉ

Nous avons travaillé pour assurer l'équilibre des sexes dans la sélection des sujets non humains. Un ou plusieurs des auteurs de cet article s'identifient comme une minorité ethnique sous-représentée en science. Tout en citant des références scientifiquement pertinentes pour ce travail, nous avons également travaillé activement pour promouvoir l'équilibre entre les sexes dans notre liste de références. La liste des auteurs de cet article comprend des contributeurs du lieu où la recherche a été menée qui ont participé à la collecte de données, à la conception, à l'analyse et/ou à l'interprétation du travail.

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MÉTHODES STAR★

TABLEAU DES RESSOURCES CLÉS

LA DISPONIBILITÉ DES RESSOURCES

Contact principal

De plus amples informations et demandes de ressources et de réactifs doivent être adressées à et seront satisfaites une fois le MTA approprié terminé par le contact principal, le Dr Jeffrey Rathmell (jeff.rathmell@vumc.org).

Disponibilité des matériaux

Les plasmides et les lignées de souris générés dans cette étude seront mis à disposition à la fin du MTA approprié sur demande.

Disponibilité des données et des codes

Les données de séquençage CUT&RUN ont été déposées chez GEO et sont accessibles au public à compter de la date de publication (GSE180356). Les données de microscopie et les images Western blot originales rapportées dans cet article seront partagées par le contact principal sur demande. Toute information supplémentaire requise pour réanalyser les données rapportées dans ce document est disponible auprès du contact principal sur demande.

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