Les régimes à base de plantes ont été associés à un risque moindre de développer des maladies chroniques telles que l'obésité

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Résumé:Il a été suggéré que l'extrait méthanolique d'épinard (SME) inhibe la formation de produits finaux de glycation avancée (AGE), qui augmentent au cours de la progression du diabète, il est donc important de savoir si les PME ont des effets bénéfiques sur la rétine diabétique. Dans cette étude, des essais in vitro ont montré que la SME inhibe la glycation, la formation de groupes carbonyle et l'épuisement du groupe thiol réduit dans l'albumine sérique bovine incubée soit avec des sucres réducteurs, soit avec du méthylglyoxal. L'effet SME dans les rétines de rats diabétiques induits par la streptozotocine (STZ2) a également été étudié (n=10) dans le groupe normoglycémique, STZ, rats STZ traités par SME, et rats STZ traités par aminoguanidine (référence anti-AGEs groupe) pendant 12 semaines. La rétine a été sectionnée et immunocolorée pour la Ne-carboxyméthyl lysine (CML), le récepteur RAGE, le NADPH-Nox4, l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS), la 3-nitrotyrosine (NT), le NF-kB nucléaire, le facteur de croissance endothélial vasculaire ( VEGF), protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), protéine S100B et test TUNEL. La peroxydation lipidique a été déterminée dans l'ensemble de la rétine par les niveaux de malondialdéhyde (MDA). Les résultats ont montré que dans la rétine diabétique, le SME réduisait la co-localisation CML-RAGE, le stress oxydatif (NOX4, iNOS, NT, MDA), l'inflammation (NF-B, VEGF, S10B, GFAP) et l'apoptose (p<0.05).therefore, smes="" could="" attenuate="" retinal="" degeneration="" by="" inhibiting="" cml-rage="">

Mots clés:épinard; la rétinopathie diabétique; produits finaux de glycation avancée ; stress oxydatif; inflammation; RAGE; carboxyméthyl L-Lysine

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1. Introduction

Les régimes à base de plantes ont été associés à un risque moindre de développer des maladies chroniques telles que l'obésité, le diabète de type 2 et les maladies coronariennes. L'épinard (Spinacia oleracea L.) est un légume feuillu comestible consommé dans le monde entier car il fournit une quantité appréciable de fibres, de vitamines et de minéraux [1,2]. Plusieurs de ses composés phytochimiques ont été identifiés, notamment les chlorophylles, les caroténoïdes (lutéine et zéaxanthine) [3] et les composés phénoliques (flavones, flavonoïdes, coumarines) [4-8] (voir supplément 1). Il a été rapporté que les épinards, lorsqu'ils sont ingérés comme aliment, extrait soluble dans l'eau ou sous forme lyophilisée, et ses thylakoïdes ont des propriétés anticancéreuses, anti-obésité et hypoglycémiantes [9]. L'effet anti-inflammatoire des épinards a été démontré dans des modèles d'endotoxémie animale, des animaux obèses et des humains en bonne santé [9]. Son effet antioxydant a été étudié dans des cellules de carcinome prostatique humain, des modèles animaux obèses, des souris irradiées aux UV et des adénocarcinomes de la prostate de souris transgéniques [9,10]. Les effets anti-glycation et anti-inflammatoires de l'extrait méthanolique d'épinard (EMS) ont été étudiés dans le modèle du diabète induit par le glucose chez le poisson zèbre et de la nécrose myocardique induite par l'isoprotérénol chez le rat, respectivement [11,12]. La SME a diminué les niveaux d'hémoglobine glycosylée et de fructosamine, y compris les niveaux de protéines glyquées, en réduisant l'activité de l'aldose réductase dans le cristallin oculaire [11]. Les résultats ci-dessus suggèrent que les PME pourraient avoir un effet préventif sur la progression des complications du diabète sucré telles que la rétinopathie diabétique (RD).

La RD entraîne progressivement une perte d'acuité visuelle ou une cécité qui a été liée à l'inflammation, au stress oxydatif et à l'accumulation de produits finaux de glycation avancée (AGE) [13,14]. Les AGE induisent la réticulation des protéines, altérant la structure/fonction et son renouvellement/clairance. Les AGE peuvent être produits par une réaction non enzymatique entre le glucose et un groupe aminé libre de protéines, formant des intermédiaires réversibles tels que les bases de Schiff et les produits d'Amadori (fructosamine) [15]. D'autres mécanismes de formation des AGE comprennent la voie du « stress carbonyle », où l'oxydation des sucres et des lipides crée des composés intermédiaires de dicarbonyle tels que le glyoxal et le méthylglyoxal (MGO), qui conduisent à la formation des AGE comme la N :-carboxyméthyl lysine (CML) [ 16]. L'augmentation des taux de LMC dans le sérum et le vitré peut être un marqueur biochimique de l'apparition et de la progression de la RD [17,18]. Dans la rétine, l'activation du récepteur RAGE par les AGEs (AGEs-RAGE) induit la surexpression de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) et des facteurs pro-inflammatoires, régulés par le facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer de B activé cellules (NF-kB) [19]. NF-kB régule positivement l'expression de RAGE en agissant comme un mécanisme de rétroaction positive [20].qu'est-ce que cistancheD'autre part, des concentrations élevées de S100B, une protéine liant le calcium, peuvent également activer NF-kB, induisant une neuroinflammation et une activation des cellules gliales [21]. La surexpression de S100B dans les astrocytes provoque des effets neurotoxiques se manifestant par une astrogliose rétinienne [22].

Cistanche peut anti-âge

Des stratégies ont été développées expérimentalement pour prévenir les lésions rétiniennes. Certains composés phytochimiques d'épinards isolés d'autres plantes ont été associés à l'inhibition des AGE et au stress oxydatif [8,23-26]. La lutéine, l'astaxanthine et le kaempférol ont protégé les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes d'origine humaine (ARPE-19) contre les dommages grâce à leurs propriétés anti-AGE, antioxydantes et anti-apoptose [26-28]. Ces résultats suggèrent que les composés phytochimiques des épinards ont un rôle pertinent dans la prévention de la dégénérescence rétinienne comme la RD. Une autre stratégie consiste à utiliser l'aminoguanidine (AG) comme puissant inhibiteur de la glycation et de l'activité iNOS, atténuant l'accumulation de LMC et la formation de précurseurs di-carbonyliques réactifs chez le rat [29]. Cependant, dans un essai clinique multicentrique et randomisé portant sur 690 patients diabétiques, l'effet bénéfique n'a pas été clairement établi [30].

Les modifications de la dégénérescence rétinienne dans des conditions hyperglycémiques ont été peu étudiées. Par conséquent, il est intéressant de savoir si la SME protège les couches rétiniennes des dommages liés à ses propriétés anti-AGE, antioxydantes et anti-inflammatoires dans la rétine des rats diabétiques induits par la streptozotocine.

2. Matériels et méthodes

2.1.Préparation de l'extrait méthanolique d'épinard (SME)

Les feuilles fraîches d'épinard (S.oleracea L.) ont été récoltées pendant la saison automne-hiver dans un champ agricole de la province de Puebla, au Mexique, et identifiées par un botaniste dans l'herbier de l'Institut national polytechnique (IPN, Mexico, Mexique). Le spécimen justificatif numéro 4532 a été déposé à l'herbier de l'Ecole Nationale des Sciences Biologiques de l'IPN.

Les feuilles ont été déshydratées et finement broyées. Les feuilles séchées ont été macérées avec du méthanol à température ambiante, filtrées à travers des filtres en cellulose (Whatman, Maidstone, Royaume-Uni) et séchées à l'aide d'un évaporateur rotatif sous vide (BUCHI Rotavapor R{{0}}, Suisse) à 45 degrés pour donner une gomme verte (95,0 g/kg de feuilles sèches).Cistanche anti-âgeLe SME a été stocké dans l'obscurité à 4 degrés jusqu'à son utilisation. Pour tous les dosages, l'extrait a été reconstitué dans de l'eau distillée[11].

2.2.Tests in vitro de l'activité anti-glycation SME

2.2.1. Formation de produits finaux de glycation avancée dérivés de l'albumine sérique bovine (BSA-AGE)

Le test BSA-AGEs a ​​été réalisé, comme décrit précédemment [31]. En bref, 10 mg/mL de BSA (fraction V ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis) a été ajouté soit dans du D-glucose 0.5 M, D-fructose {{12 }}.5 M, ou méthylglyoxal 2,5 mM, et préparé dans une solution 0.1 M PBS (pH 7,4) et 0,02 % d'azide de sodium. Des concentrations de SME (5, 10, 25, 50, 100 et 200 mg/mL) ont été ajoutées à chaque mélange, puis incubées à 37 degrés pendant 4 semaines. Ensuite, les sucres n'ayant pas réagi ont été éliminés par dialyse contre de l'eau distillée pendant deux jours à 4 degrés. Les niveaux de BSA-AGE ont été déterminés par spectrophotométrie de fluorescence (Ex370/Em 440 nm ; modèle LS 30, PerkinElmer LAS Ltd., Buckinghamshire, Royaume-Uni) [32]. La glycation de la protéine BSA par les sucres réducteurs et le MGO était un contrôle positif (BSA glyquée), tandis que l'incubation de la BSA glyquée avec de l'aminoguanidine (1 mg/mL) était utilisée comme contrôle négatif (BSA glyquée-AG). Les dosages ont été réalisés en triplicat.

2.2.2. Dosage de fructosamine

Le niveau de fructosamine a été déterminé par le dosage du nitro bleu tétrazolium (NBT) [33], qui est basé sur la capacité de la fructosamine à réduire le NBT, formant du formazan, un produit final coloré dans des conditions alcalines. Dix microlitres de l'un des contrôles ou des concentrations de SME incubées avec BSA glyquée （BSA-SME） ont été ajoutés à 90 μL de NBT à 2,5 mM, préparé dans un tampon carbonate (0,1 M; pH 10,3); tous ont été incubés à 37 degrés C pendant 30 min. L'absorbance à 530 nm a été mesurée. Les concentrations de fructosamine (nmol/mg) ont été calculées selon une courbe standard de formazan.

2.2.3. Détermination de la formation de groupes carbonyle et de l'épuisement des groupes thiol dans les BSA-AGE

La concentration du groupe carbonyle a été mesurée dans BSA-SME et dans des échantillons témoins, selon Levine et al. [34]. Une solution de 2,4-dinitrophénylhydrazine (DNPH ; 10 mM) dans 400 μL de HCl 2,5 M a été ajoutée à 100 μL de chaque échantillon et incubée dans l'obscurité pendant 60 min à température ambiante.cistanche benefíciosEnsuite, 500 μL d'acide trichloroacétique (20 % p/v) ont été ajoutés et conservés sur de la glace pendant 5 min. Les échantillons ont été centrifugés à 4000 tr/min pendant 15 min, et le culot de protéines a été lavé trois fois avec de l'acétate d'éthyle/éthanol (1:1 v/v). Ensuite, les échantillons ont été mis en suspension dans 250 μL de chlorhydrate de guanidine à 6 M. La concentration des groupes carbonyle (nmol/mg de protéine) a été calculée par spectrophotométrie à une absorbance de 370 nm (EON, BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) en utilisant le coefficient d'absorption de DNPH (22 000 M-1 cm-1).

Selon la méthode d'Ellman, la détermination de l'épuisement du groupe thiol dans le BSA-SME et les échantillons de contrôle a été effectuée. En bref, 10 μL de 5,5'-Disulfanediylbis（2-acide nitrobenzoïque）（DNTB ; 10 mM, préparé dans du PBS）avec 50 μL d'échantillons glyqués a été incubé pendant 15 min à température ambiante, puis l'absorbance à 410 nm a été mesurée. Le niveau de groupes thiol libres a été calculé à l'aide d'une courbe standard de L-cystéine（0.4-11 μM） et exprimé en nmol/mg de protéine [34].

2.3. Effet du SME sur la rétine des rats diabétiques 2.3.1. Induction du diabète chez les rats

Des rats mâles Wistar pesant 250± 10 gr(N=40) à jeun depuis 8 h ont été utilisés. Une dose intrapéritonéale de streptozotocine (60 mg/kg) dans un tampon citrate (10 mM, pH 4,5) (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) a été administrée [35]. Trois jours plus tard, le taux de glucose a été mesuré (glucomètre ; ACCU-CHEK actif ; Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Allemagne) en prélevant une goutte d'un échantillon de sang de la queue. Des animaux avec des niveaux glycémiques supérieurs à 350mg/dL ont été recrutés pour l'étude. Le glucose dans le sang a été mesuré chaque semaine pendant 12 semaines.

2.3.2. Conception expérimentale

Les rats diabétiques induits par la streptozotocine (STZ) ont été divisés au hasard dans les groupes suivants (n =10) : STZ traité par voie intragastrique avec 2 mL d'eau potable (STZ) ; STZ traité avec SME à 400 mg/kg (STZ-SME) ; rats normoglycémiques (NG); et STZ traité avec 50 mg/kg d'aminoguanidine (AG; Sigma-Aldrich, Inc.) (STZ-AG). STZ-AG a été utilisé comme groupe de référence anti-AGE. Les doses attribuées ont été administrées toutes les 24 h (9h00) pendant 12 semaines. Le niveau glycémique dans tous les groupes a été surveillé chaque semaine. Le schéma posologique de SME à 400 mg/kg était basé sur ce qui suit : 7 g de SME sont obtenus à partir de 100 g d'épinards frais (données non présentées). Cette quantité équivaut à la consommation quotidienne d'une personne moyenne de 70 kg dans l'alimentation américaine [36], ce qui correspond à 100 mg d'extrait/kg de poids corporel.Extrait de Cistanche Anti RadiationD'autre part, en raison de la différence de métabolisme accéléré des rats, il est recommandé d'augmenter la consommation de tout extrait naturel jusqu'à 6,4 fois pour les études de comparaison avec l'homme [37]. La dose de 400 mg/kg que nous avons utilisée était basée principalement sur les résultats obtenus dans un modèle de nécrose myocardique induite chez le rat Wistar, qui ont montré que l'effet anti-inflammatoire du SME est plus important à 300 mg/kg [12].

2.3.3. Évaluations histologiques et immunohistochimiques

Les yeux énucléés ont été fixés dans du formol neutre, puis ont été déshydratés dans des alcools gradués et inclus dans de la paraffine. Des coupes histologiques de 2 μm ont été montées sur des lames électrochargées, déparaffinées et réhydratées jusqu'à la solution de récupération d'antigène (K035; tampon citrate 10 ×, pH 6; Diagnostic BioSystems, Pleasanton, CA, USA). Un système d'immunodétection à base de polymère (système de détection PolyVuemouse/lapin DAB, Diagnostic BioSystems) a été utilisé. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : protéine acide fibrillaire gliale (anti-GFAP ; MAB360 ; Chemicon International, Inc., Temecula, CA, USA) ; facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (anti-VEGF;sc-7269 ; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, États-Unis), protéine B de liaison au calcium S100 (anti-S100B ; ab52642 ; Abcam PLC, Cambridge, Royaume-Uni) , et activateur de la chaîne légère kappa du facteur nucléaire des lymphocytes B activés (anti-NF-kB p65;sc-8008). Un anticorps secondaire (Mouse/Rabbit PolyVueTM) a été ajouté selon les instructions du fournisseur.cistanche herbeLes coupes ont été colorées avec du DAB plus/substrat chromogène et de l'hématoxyline. Les observations histologiques et la capture d'images ont été réalisées dans un microscope Carl Zeiss (Carl Zeiss Microscopy GmbH, Jena, Allemagne).

Pour la coloration par immunofluorescence, les lames ont été incubées pendant une nuit à 4 °C avec les anticorps primaires suivants : carboxyméthyllysine (anti-CML ; ab124145 ; Abcam PLC, Cambridge, Royaume-Uni), récepteur AGE (anti-RAGE ; sc-365154), NADPH oxydase 4 (anti-Nox4 ; ab133303), 3-nitrotyrosine (anti-NT ; ab110282) et synthase d'oxyde nitrique (inductible) (anti-iNOS ; A00368-1 ; Boster Bio, Pleasanton, CA , ETATS-UNIS). Ensuite, les anticorps secondaires suivants ont été utilisés : pour l'anti-RAGE, lgG(FITC) anti-souris de chèvre conjugué (1:200 ; Santa Cruz, Biotechnology, Inc.) ; pour anti-CML et anti-NT, IgG-PE de souris anti-lapin (SC-3753) ; et pour les anti-iNOS et anti-Nox4, m-IgGkBP-PE (Sc-516141). Tous ont été incubés à température ambiante pendant 60 min. Ensuite, les coupes ont été montées dans un milieu contenant du dichlorhydrate de 4',6-diamidine-2'-phénylindole (DAPI). Les anticorps anti-CML et anti-RAGE ont été co-hybridés dans la même lame. La station d'imagerie cellulaire FLoidTM (Life technologies Carlsbad, San Diego, Californie, États-Unis) a été utilisée pour les images de fluorescence.

2.3.4.Évaluation de l'apoptose

L'apoptose des cellules rétiniennes a été détectée conformément au manuel décrit par le test de marquage de la désoxyuridine triphosphate (dUTP) à médiation par la désoxyuridine triphosphate (dUTP) en utilisant le kit de détection de la mort cellulaire in situ, TMR (tétraméthyl-rhodamine{{ 3}}dUTP) rouge, version 12 (12156792910 ; Roche Diagnostics). Brièvement, les lames déparaffinées ont été réhydratées et rincées deux fois avec du PBS. Ensuite, elles ont été incubées avec le mélange réactionnel TUNEL dans une atmosphère humidifiée pendant 60 min à 37 C. Par la suite, les coupes ont été montées au DAPI et observées en microscopie à fluorescence (FLoidTM Cell Imaging Station). IOD pour TUNEL a été calculé pour les couches rétiniennes.

2.3.5. Test de peroxydation lipidique

Pour l'évaluation des niveaux de malondialdéhyde (MDA) dans le tissu rétinien, environ 3 mg de tissu frais (n=3) ont été homogénéisés et traités comme indiqué précédemment [38]. Les niveaux de MDA ont été quantifiés en suivant les instructions du fournisseur du kit (kit d'analyse OXItek-TBARS, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA).

2.4.Analyse statistique

Pour l'analyse statistique, toutes les micrographies rétiniennes ont été capturées avec une magnitude de 200× à 100 μm au-delà de la région du nerf optique. Environ 40 images par groupe d'animaux (n=7) ont été analysées. L'analyse des images a été réalisée avec le logiciel Image-Pro Premier Version 9.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA). Nous avons utilisé le logiciel GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA ; version 8.0). Les figures montrent les valeurs représentées graphiquement dans des tracés en boîte à moustaches (médiane, premier tiers quartile, valeur minimale-maximale) pour la couche de cellules ganglionnaires (GCL), la couche nucléaire interne (INL) et la couche nucléaire externe (ONL). La moyenne et l'écart type (moyenne ± ET) sont présentés à l'annexe A (tableaux A1-A3). Dans tous les cas, un test ANOVA unidirectionnel suivi du test de Tukey a été réalisé. p<0.05 was="" considered="" statistically="">