Partie 1 Effets neuroprotecteurs des glycosides phényléthanoïdes dans un modèle in vitro de la maladie d'Alzheimer
Mar 10, 2022
L'effet neuroprotecteur de Cistanche est-il réel ?
JIANHUA YANG1*, BOWIE JU1,2*, YAO YAN1, HUAN HUAN XU1,
SHANSHAN WU1, DANDAN ZHU1, DANDAN CAO1 et SAUT HU2
1 Département de pharmacie, Le premier hôpital affilié ; 2 Département des médecines naturelles,
Collège de pharmacie, Université médicale du Xinjiang, Urumqi, Xinjiang 830011, République populaire de Chine
Reçu le 8 janvier 2016 ; Accepté le 6 janvier 2017
Résumé.
La présente étude visait à étudier les effets neuroprotecteurs deglycosides phényléthanoïdes(PhGs) sur H2O2- et -peptide amyloïde (A)1-42-blessure induite des cellules PC12 comme modèle in vitro de la maladie d'Alzheimer (MA). Les conditions d'induction optimales ont été établies par le criblage de divers temps d'incubation et concentrations. Les cellules PC12 ont été traitées avec 0.5 µM A 1-42 et H2O2 en présence de PhG pendant 24 h et la viabilité cellulaire a ensuite été évaluée par un test MTT ; La libération de lactate déshydrogénase (LDH) et la teneur en malondialdéhyde (MDA) ont également été mesurées. Les conditions optimales pour établir le modèle AD étaient le traitement des cellules PC12 avec 0.5 µM A 1-42 pendant 48 h, ou avec 25 µM H2O2 dissous dans du DMEM avec du PBS. Les PhG à des concentrations de 5, 25 et 50 µg/ml ont augmenté la viabilité et diminué la libération de LDH et de MDA par les cellules PC12 blessées par A 1-42 ou H2O2. En conclusion, le modèle de lésion des cellules PC12 induite par A 1-42- et H2O2- a été établi avec succès. Il a été démontré que les PhG ont un effet neuroprotecteur significatif contre les lésions cellulaires induites par A 1-42- ou H2O2-.
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Introduction
La maladie d'Alzheimer (MA), une maladie neurodégénérative présentant les caractéristiques cliniques d'une perte de mémoire progressive et d'une altération des fonctions cognitives (1), est la cause la plus fréquente de démence dans le monde (2). Les coûts financiers sont immenses en raison de la prévalence de la MA (3). Il est donc urgent de développer des moyens appropriés de prise en charge et de prévention de la MA.
La pathogenèse de la MA est étroitement associée à l'accumulation d'enchevêtrements neurofibrillaires et de plaques séniles (SP) dans les régions cérébrales affectées (4,5). Il a été rapporté que le peptide amyloïde (A), le composant principal des SP, a un rôle causal dans la progression de la MA, car il a un effet toxique sur les cellules neuronales (6). Des fragments A, comprenant A 1-40, A 25-35 et A 1-42, ont été générés par la scission de la protéine précurseur amyloïde (7). La neurotoxicité de A 1-42 s'est avérée significativement plus élevée que celle de A 25-35 et A 1-40, et A 1-42 est capable d'induire un modèle AD (1,{ {13}}). Le stress oxydatif peut être impliqué dans la pathogenèse de la MA et est le principal mécanisme sous-jacent à la neurotoxicité induite par A (11-13). Plusieurs études ont suggéré que A 1-42 provoquait une accumulation intracellulaire d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), entraînant une oxydation des lipides et des protéines, des dommages à l'ADN et l'activation de la signalisation du point de contrôle du cycle cellulaire (1, 14, 15). Des quantités excessives de H2O2 peuvent entraîner des dommages oxydatifs et induire l'apoptose des cellules PC12 (16). Par conséquent, cibler le stress oxydatif peut être une approche prometteuse pour le développement de stratégies thérapeutiques pour inhiber la neurotoxicité induite par A dans la MA. Herbe (H.)Cistanche, une plante médicinale chinoise couramment utilisée en Chine continentale pour nourrir les reins et reconstituer l'essence et le sang, a été utilisée pour traiter la perte de mémoire et la constipation sénile (17).Glycoside de phényléthanoïde(PhG), l'un des principaux constituants de H.Cistanche, améliore l'altération de l'apoptose neuronale causée par A 25-35 via ses effets anti-oxydants (18,19). Une étude précédente a identifié cinq composants majeurs des PhG totaux, à savoiractéoside, 2'-l'acétylactéoside, échinacoside, les cistanosides etisoacteoside(20). Parmi ces composants,actéosideetéchinacosideont été signalés comme ayant des effets neuroprotecteurs sur la neurotoxicité induite par A 25-35- ou H2O2-(21-23). Par exemple, Wu et al (24) ont suggéré queactéosideetéchinacosidedysfonctionnement cognitif amélioré causé par A 1-42. La présente étude visait à étudier les effets protecteurs des PhG dans un modèle in vitro de cellules de rat de la MA.
matériaux et méthodes
PréparationdePhG. Les PhG totaux ont été extraits deH. Cistanchecomme décrit précédemment (25). La tige séchée à l'air deH. Cistanche a été réduite en poudre et extraite par percolation avec EtOH à 80 %. Le percolat est évaporé sous atmosphère réduite
pression, suivie d'une remise en suspension dans une quantité appropriée de H2O2(100 µmol/l). Le mélange a été isolé sur une colonne de résine macroporeuse SP-825 (Mitsubishi Chemical, Tokyo, Japon) et élué avec 0, 30, 50, 70 et 90 % d'EtOH dans l'eau. Pour obtenir la fraction riche en PhG, les éluants EtOH à 30-50 % ont été concentrés et séchés sous pression réduite. Une spectrophotométrie ultraviolette (UV) a été réalisée pour déterminer les PhG totaux. Le contenu deéchinacosideetactéosidea été déterminée par chromatographie liquide haute pression selon un protocole antérieur (26). Une colonne Hypersil ODS-2 (4,6x250 mm, 5 µm ; Dalian Elite Analytical Instruments, Co., Ltd., Dalian, Chine) a été utilisée et maintenue à température ambiante. Les phases mobiles étaient des cyanures de méthyle et de l'eau contenant 0,4 % d'acide phosphorique (v/v ; Sigma-Aldrich ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). Le débit était de 0,75 ml/min et la longueur d'onde était fixée à 333 nm.
Culture de cellulesettraitement médical.La lignée cellulaire de phéochromocytome de rat PC12 a été fournie par le Dr He Chunhui, de la Faculté de médecine de l'Université de médecine du Xinjiang (Urumqi, Chine). Les cellules ont été cultivées dans du milieu d'Eagle modifié à haute teneur en glucose de Dulbecco (DMEM ; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, États-Unis) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (Sangon Biotech Co. Ltd., Shanghai, Chine), 100 U/ml pénicilline et 100 U/ml de streptomycines dans un incubateur à 37 °C contenant 5 % de CO2et 95 % d'air. Après avoir atteint 80 % de confluence, les cellules ont été traitées avec 0,25 % de trypsine et repiquées.
Afin d'éliminer l'interférence du médicament lui-même sur la croissance des cellules PC12, une expérience de toxicité a été réalisée. En bref, les cellules PC12 (3x104cellules/ml) ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à 100 µl/puits et incubées à 37 °C pendant une nuit. Après avoir jeté le surnageant, 200 µl de DMEM complet ont été ajoutés dans le groupe blanc, tandis que les cellules des groupes d'intervention ont été traitées par des PhG à différentes doses (5, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 et 200 µg/ ml). Après incubation des cellules à 37 °C pendant 48 h, 20 µl de solution MTT (Sigma-Aldrich ; Merck KGaA) ont été ajoutés à chaque puits. Après incubation pendant 4 h, le surnageant a été jeté et 150 µl de diméthylsulfoxyde ont été ajoutés par puits, suivi d'une agitation pendant 10 min. Les valeurs de densité optique (DO) à 490 nm ont été détectées à l'aide d'un lecteur de plaque ELISA.
A 1‑ 42‑induitPC12lésion cellulaire.Un peptide 1-42 acheté auprès de Bioss Biotech (Beijing, Chine) a été dissous dans de l'eau (100 µg/ml). Ensuite, le mélange a été incubé à 37 °C pendant 4 jours et stocké à 4 °C avant utilisation.
Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des 96-plaques à puits (3xl04cellules dans 100 µl par puits). Après culture pendant 24 h pour l'adhérence, 50 µl A 1-42 à différentes concentrations finales (0, 0.25, 0.5, 1, 1.5 ou 2 µM) dissous dans du DMEM sans sérum a été ajouté, suivi d'une incubation de 24, 48, 72 ou 96 h. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test MTT. La concentration optimale de A 1-42 était de 0,5, déterminée comme étant µM. Cellules PC12 (3xl04cellules par puits) ont été traités avec différentes doses de PhGs ({{0}}, 0.5, 5, 25 ou 50 µg/ml) en présence de 0,5 µM A {{8 }} pendant 24h. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test MTT.
H2O2‑induitPC12lésion cellulaire. Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des plaques 96-puits (3xl04cellules dans 100 µl par puits). Après culture
pendant 24 h pour l'adhérence, 100 µl H2O2à différentes concentrations finales ({{0}}, 25, 50, 100, 200, 300, 400 et 500 µM) dissous dans du DMEM avec ou sans PBS (0,01 mol/l) a été ajouté, suivi d'une incubation pendant 24h. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test MTT. Le H optimal2O2la concentration et le solvant ont été déterminés pour établir lain vitromodèle d'AD.
Cellules PC12 (3xl04cellules par puits) ont été traités avec différentes doses de PhG ({{0}}, 0,5, 5, 25 et 50 µM). Après culture pendant 24 h pour l'adhérence, les cellules PC12 ont été traitées avec 100 µl de H2O2dissous dans du DMEM avec du PBS en présence de PhGs pendant 24 h. La viabilité cellulaire a été évaluée par un test MTT.
Lactatedéshydrogénase (LDH)test de libération. La lésion cellulaire a été évaluée en mesurant l'activité LDH dans le surnageant des cellules PC12 à l'aide d'un kit LDH selon le protocole du fabricant (n° de catalogue 20150604 ; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine). En bref, H distillé deux fois2O, {{0}}.2 µmol/ml d'acide pyruvique, de tampon de matrice et de tampon de coenzyme I ont été ajoutés en séquence 48 h après le traitement médicamenteux. Après incubation à 37 °C pendant 15 min, de la 2,4‑dinitro‑phénylhydrazine a été ajoutée. Ensuite, 250 ul d'une solution de NaOH 0,4 M ont été ajoutés à chaque puits. Le surnageant est récupéré après 30 minutes d'incubation à température ambiante. L'absorbance à 450 nm a ensuite été mesurée avec un lecteur de microplaques.
La mesuredemalondialdéhyde(MDA). Le MDA a été mesuré dans le surnageant des cellules PC12 à l'aide d'un kit commercial (cat. n° 20150604 ; Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute) selon le protocole du fabricant En bref, de l'alcool déshydraté et d'autres réactifs ont été ajoutés dans l'ordre, suivis d'une incubation dans un bain-marie à 95˚C pendant 40 min. Le mélange a été centrifugé à 1 006 xg et 25˚C pendant 10 min après refroidissement. Le surnageant a ensuite été utilisé pour déterminer la teneur en MDA. L'absorbance a ensuite été mesurée avec un lecteur de microplaques à 532 nm.
Évaluation de protecteur effets de échinacoside et actéoside contre UN D dans vitro. Les cellules PC12 ont été ensemencées à une densité de 3xl04cellules/puits dans des plaques {{0}}puits (100 µl/puits). Les cellules ont été incubées avec des médicaments, notamment de l'échinacoside (n° de catalogue 111670-200503 ; National Institutes for Food and Drug Control, Pékin, Chine) et de l'actéoside (n° de catalogue 111530-200505 ; National Institutes for Food and Drug Control ) à différentes concentrations (0,5, 25 et 50 µg/ml). Par la suite, les cellules ont été traitées avec A 1-42 ou H2O2pendant 24 h et la viabilité cellulaire a été mesurée par un test MTT.
Statistique une analyse. Les valeurs sont exprimées en moyenne ± écart type. Le test t de Student a été utilisé pour les comparaisons intergroupes. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de SPSS 18.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, États-Unis). P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Résultats
Quantification des PhG de H. Cistanches.Les spectres UV des PhG extraits ainsi que des solutions étalons deéchinacosideet l'actéoside ont été enregistrés, et les résultats ont montré que les spectres UV étaient cohérents (Fig. 1). Spectrophotométrie UV
ont montré que la teneur en PhG était de 87,6 pour cent. Les résultats HPLC ont montré que les teneurs en échinacoside et en actéoside étaient
37,7 et 17,8 %, respectivement (Fig. 2).
DéterminationdelaidéalPhGconcentration. Par rapport au groupe témoin, PhG à 75, 100, 125, 150, 175 et 200 µg/ml a eu un effet inhibiteur significatif sur les cellules PC12 (P<0.05), while="" phg="" at="" 5,="" 25="" and="" 50="" µg/ml="" showed="" low="" toxicity="" on="" pc12="" cells,="" and="" the="" cell="" viability="" was="">80 % (Fig. 3). Ainsi, des PhG à la concentration de 5, 25 et 50 µg/ml ont été utilisés pour traiter les cellules PC12 dans des expériences ultérieures car ils n'affectaient pas la viabilité cellulaire.
A 1‑42‑induitPC12lésion cellulaire.Par rapport à celle du groupe témoin, la viabilité cellulaire dans le groupe de blessures 0.5 µM A 1-42 était de 63 % (P<0.05). the="" cell="" viability="" was="" decreased="" by="" aβ1-42="" in="" a="" concentration-dependent="" manner,="" and="" the="" viability="" was=""><50% in="" the="" 1,="" 1.5,="" and="" 2="" µm="" aβ1-42="" injury="" groups="" (fig.="" 4).="" thus,="" treatment="" with="" 0.5="" µm="" aβ1-42="" for="" 48="" h="" was="" determined="" to="" be="" the="" optimal="" condition="" for="" establishing="" the="">in vitroModèle AD.
L'activité des cellules PC12 traitées avec 0.5 µM A 1-42 en présence de doses sûres de PhG (5, 25 et 50 µg/ml) pendant 24 h a également été déterminée. Par rapport au groupe modèle (P<0.01), phgs="" showed="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" rescued="" by="" phgs="" in="" a="" dose-dependent="" manner="" (fig.="">
H2O2‑induitPC12lésion cellulaire. La viabilité des cellules PC12 traitées avec 25 µM H2O2dissous dans du DMEM avec du PBS était de 56,43 %. La viabilité des cellules PC12 traitées avec 200 µM H2O2dissous dans du DMEM sans PBS était de 71,64 % (tableau I). Ainsi, les cellules PC12 traitées avec 25 µM H2O2dissous dans du DMEM avec du PBS ont été sélectionnés comme condition optimale pour établir le modèle AD.
Par rapport au groupe témoin, la viabilité cellulaire dans le groupe modèle était de 48,8 % (P<0.05). compared="" with="" the="" model="" group,="" phgs="" had="" a="" significant="" neuroprotective="" effect="" on="" pc12="" cells.="" the="" cell="" viability="" was="" dose-dependently="" increased="">
Les PhG et la viabilité des cellules PC12 traitées avec les PhG à des concentrations de 5, 25 et 50 ug/ml étaient respectivement de 54, 57 et 64 % (tableau II).
Les PhG inhibent la libération de LDH induite par les lésions par les cellules PC12. Par rapport au groupe témoin, la teneur en LDH du surnageant de cellules PC12 blessées a été augmentée, ce qui a été inhibé par les PhG de manière dépendante de la concentration. Ce résultat indique que les PhG ont un effet neuroprotecteur significatif sur les cellules PC12 (Fig. 6).
inhibée par les PhG de manière concentration-dépendante. Ce résultat indique que les PhG ont un effet neuroprotecteur significatif sur les cellules PC12 (Fig. 7). PhG et ses composants échinacoside et actéoside sauvent la viabilité des cellules PC12 blessées. Par rapport au groupe modèle, le traitement par l'actéoside a augmenté de manière significative la viabilité des cellules PC12 blessées par A 1-42- de manière dose-dépendante. Les PhG et l'échinacoside ont également augmenté de manière significative la viabilité des cellules PC12 blessées par A 1-42- à toutes les concentrations testées (Fig. 8A).
Par rapport au groupe modèle, l'actéoside a significativement augmenté la viabilité des cellules PC12 traitées avec H2O2. Les PhG ont également augmenté la viabilité des cellules PC12 traitées avec H2O2, alors que l'effet n'était pas significatif à des concentrations de 5 et 25 µg/ml (Fig. 8B). De plus, l'échinacoside a augmenté la viabilité cellulaire à 25 µg/ml.
En conclusion, l'actéoside, les PhG et l'échinacoside ont exercé des effets neuroprotecteurs significatifs sur les cellules PC12 soumises à une lésion avec A 1-42 ou H2O2.
