De nombreux composés thérapeutiques ont été isolés de ressources organiques naturellement abondantes

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De nombreux composés thérapeutiques ont été isolés à partir de ressources organiques naturellement abondantes, qui peuvent offrir des sources économiques et durables de composés avec des activités biologiques sûres et efficaces. Dans l'industrie cosmétique, les composés naturels aux activités anti-âge sont très recherchés. Ainsi, nous avons préparé divers extraits de feuilles de Rubusfraxinifolius et utilisé des tests d'inhibition enzymatique pour isoler des composés ayant des effets protecteurs contre le vieillissement cutané. Deux triterpénoïdes ont été isolés de Rubus fraxinifolius Poir. feuilles. Les structures ont été caractérisées par des analyses spectroscopiques (LC-ESI-MS, RMN 1D/2D) et par comparaison avec les données rapportées. Les composés 1 et 2 ont été déterminés comme 2,3-O-éthylène glycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-acide dioïque et 2,{{15} }O-propanediol,19-hydroxyurs-12-en-28-acide oïque. L'extrait de méthanol et les isolats ont été évalués pour leurs effets inhibiteurs sur l'élastase et la tyrosinase. Les composés 1 et 2 ont inhibé l'élastase avec ICso 122,199 ug/mL et 98,22 ug/mL, et ont également inhibé la tyrosinase avec ICso 207,79 ug/armée et 221,51 ug/mL, respectivement. L'amarrage moléculaire a prouvé que les deux composés ont des affinités envers les enzymes.

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Bien que difficiles à réaliser, les substances anti-âge naturelles qui sont sans danger pour l'homme peuvent être récoltées de manière économique et durable à partir de ressources naturelles abondantes. Environ 700 espèces de Rubus (Rosaceae) sont réparties dans le monde, même si peu d'espèces se trouvent sous les tropiques. Ce genre contient des nutriments (sucre, vitamines, etc.), des métabolites secondaires (triterpénoïdes, flavonoïdes, polyphénols, etc.), et possède de nombreuses activités anti-âge (antioxydant, ant élastase, ant tyrosinase, anti-collagénase, anti-UV, anti-inflammatoire, cicatrisant, etc.)1. En outre, les espèces de Rubus ont également signalé contenir divers triterpènes avec diverses activités biologiques -'.

En Indonésie, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) est distribuée à Java, Bornéo, etc., et populairement connue sous le nom de « urbaine ».qu'est-ce que cistancheDe plus, certains agriculteurs locaux récoltent ces plantes et les baies sont généralement consommées fraîches ou congelées. Notre étude précédente a démontré que l'extrait de tige de R. frascinifolius a l'activité d'inhiber l'élastase, la tyrosinase et en tant qu'antioxydant8. Certaines autres recherches ont également montré que la feuille et le fruit de R. fraxinifolius ont une puissante activité antioxydante ?

Cistanche peut anti-âge

L'élastase est une enzyme sérine protéase, qui joue un rôle crucial dans les rides ou l'affaissement de la peau par la dégradation de la fibre élastique du derme (élastine) et provoque une perte d'élasticité de la peau. L'un d'entre eux est l'élastase dérivée des fibroblastes cutanés. Ainsi, en tant que modérateurs de la dégradation des fibres d'élastine qui provoque le vieillissement cutané, les inhibiteurs d'élastase ont attiré l'attention en tant qu'agents pour les préparations cosmétiques,12. La mélanogenèse est médiée par la tyrosinase et régule la biosynthèse de la mélanine par une réaction en deux étapes. Dans la première étape, la L-tyrosine est hydroxylée en L-3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA). Dans la deuxième étape, la L-DOPA est oxydée en O-quinone correspondante. Par conséquent, les composés naturels ayant une activité inhibitrice de la tyrosinase sont couramment utilisés dans les cosmétiques qui inhibent l'hyperpigmentation avec la mélanine et favorisent ainsi le blanchiment de la peau.Cistanche anti-âgeLes inhibiteurs des enzymes élastase et tyrosinase pourraient être développés en tant qu'agents de blanchiment de la peau, anti-âge ou anti-rides pour traiter les troubles dermatologiques44.

Cette étude a isolé les triterpénoïdes ursanes des feuilles de R. fraxinifolius et a élucidé leurs structures dans des analyses spectroscopiques à l'aide de la spectroscopie de masse à ionisation par électrospray (ESI-MS) et de la RMN 'H,|3CNMR et RMN 2D (DEPT, HSQC, HMQC et HMBC). Par la suite, nous avons effectué des dosages des activités inhibitrices de l'élastase et de la tyrosinase d'extraits bruts, de fractions et de composés isolés.

L'activité de deux composés sélectionnés a également été observée par la méthode in silico dans cette recherche. Une approche d'amarrage moléculaire a été réalisée avec DockThorl516. Les macromolécules utilisées dans cette recherche ont été obtenues à partir de la banque de données de protéines (RCSB PDB, 2000) avec les identités 2y9x et 3hgp pour la tyrosinase et l'élastase, respectivement l718. Les macromolécules ont été optimisées dansUCSF Chimera et les résultats d'amarrage moléculaire ont été observés avec PyMOL1920.

résultats et discussion

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 % dans 100 ug/mL, alors que l'extrait de n-hexane n'avait aucune activité (Fig. 1). Certains Rubus ont également montré une activité inhibitrice de l'élastase tels que R. Sanctus (pourcentage d'inhibition 14.68-49.20 dans 100 ug/mL), R.compactus,R. robustus, etc.221. Par conséquent, nous avons fractionné les extraits actifs en utilisant la chromatographie liquide sous vide/VLC et avons collecté ll fractions de chacun. Les fractions de l'extrait d'acétate d'éthyle ont montré de faibles activités inhibitrices de l'élastase (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Les isolats ont été identifiés et caractérisés par chromatographie liquide-spectroscopie de masse (LCMS), 'H et 13CNMR, DEPT, cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC), corrélation quantique multiple hétéronucléaire (HMQC) et corrélation de liaison multiple hétéronucléaire (HMBC). Le tableau 1 montre les données spectrales RMN des composés.

Composé 1 : a été isolé sous la forme d'une poudre blanche amorphe. Les spectres LCMS-ESI pour ce composé ont montré un pic d'ions moléculaires à m/z 543,32 [MH] t, suggérant la formule moléculaire C32H48O- avec neuf équivalents d'insaturation. Les spectres IR ont révélé des maxima d'absorption correspondant à l'hydroxyle (3,343,4 cm-l) et groupes fonctionnels oléfiniques (1,684 cm-1). De plus, les spectres RMN 'H du composé I ont révélé un signal singulet du proton méthine (CH) à 2,6, un signal caractéristique pour le H-18 de type ursane triterpènes avec 19-O-substitutions. Le triterpène de type 19a-hydroxy-ursane a également un signal protonique typique autour de 2,6 ppm. Ce signal déblindé peut différer sensiblement des autres signaux de protons méthylène ordinalI, avec un décalage caractéristique dû à un proton oléfinique (H12) à ou 5,28(t,J=6Hz).cistanche benefíciosLes affectations complètes et non équivoques des déplacements chimiques 'H et l3C ont été assistées par les spectres HMQC(13Cx'H) et HMBC(15Cx'H). {5}}(Fig.2a). D'autres caractères spécifiques ont été trouvés pour les cinq singlets de méthyle à 1,89,1.02,0,82,1,32,1,20(each,H24-27;29),un doublet de méthyle à og 0,92(d, J=6 Hz), et le signal du proton oléfinique à 5,30(t, J=7 Hz, H-12). Les spectres présents13CNMR montrent 32 résonances de carbone, et avec les spectres DEPT et HMQC, affichent deux carbones carbonyle (δC183.70,C-28 et 8-178.96,C-23), un carbone oléfinique à oc 127.23,C-12,un carbone quaternaire oléfinique (oc139.49,C-13),un carbone quaternaire contenant de l'oxygène （o-72.7, C-19 ）, dix méthylènes aliphatiques et six carbones de méthyle. Les deux carbones oléfiniques à δ-127.23（C-12）et 139.49(C-13) étaient caractéristiques du type ursane-triterpénoïde. Un autre signal indiquant la présence d'éthylène glycol （-OCH-CH-O-） a été montré à des signaux à δ4.62（d, J=11.5 Hz）,4.05（d, J=11. 5 Hz）,3,52（d, J=11.5Hz）et 4.06（d, J=11.5Hz）et pris en charge avec δ61.27（t）et 63.20（t）. Il était situé à C-2etC-3 basé sur la présence d'une corrélation à longue portée dans les spectres HMBC. Par conséquent, le composé 1 a été identifié comme 2,3-O-éthylène glycol,19-hydroxyurs-12-en-23,28-acide dioïque (Fig. 3a).

Composé 2 : a été obtenu sous la forme d'une poudre amorphe blanche. MS-ESI m/z 527,33 [MH] t (calculé pour 528,3815). Dans les spectres LCMS-ESI, un pic d'ions moléculaires est présent à m/z 527,33 [MH]t, indiquant la formule moléculaire CH Os, qui nécessitait 8 degrés d'insaturation. "Le spectre IR contenait des maxima d'absorption correspondant à l'hydroxyle (2 927,8 cm{ {15}}) et des groupes fonctionnels oléfiniques (1 686 cm -1). De plus, les spectres 'HNMR pour le composé 2 ont montré un singulet à 2,42, ce qui est caractéristique du H18 d'un triterpène de type ursane avec {{24 }} O-substitution.Extrait de Cistanche Anti RadiationD'autres spectres caractéristiques spécifiques comprenaient la présence de six singulets de méthyle à og1.22 0.76,0.97,0.69,1.30et 1.17(each,H -24-28,H-30),un doublet de méthyle à 0,91 (d,J=7Hz),et le signal du proton oléfinique à ou 5,37 (d,J=7Hz, H-12). Les spectres l3(CNMR et DEPT correspondants montrent 33 résonances de carbone, et les spectres HSQC et HMQC indiquent la présence d'un carbone carbonyle (oc 182.23, C-28), un carbone oléfinique （δ-129.36, C -12）, un carbone quaternaire oléfinique （δ-140.24, C-13）, un carbone quaternaire oxygéné (oc73.68, C-19), onze aliphatiques méthylène et sept carbones de méthyle. Ces données indiquent que le composé 2 porte un squelette ursane-triterpénoïde. Les autres signaux indiquent la présence d'un groupe fonctionnel 1,3-propanediol, à og 3,22(d,J=11 0,5 Hz),3,42(d,J=100,5 Hz),1,38(m),1,51(m)et 4,02(d,J=110,5Hz)et 3,36(t, J{ {57}}.5Hz).Son groupe fonctionnel a une corrélation à longue portée avec C2-C3. Sur la base de ces résultats, le composé 2 a donc été identifié comme 2,3-O-Propanediol,{{ 66}}hydroxyurs-12-en-28-acide oïque(Figs.2b et 3b). Un composé similaire est l'acide 2,3-O-isopropylidène, isolé de Rubus xanthocarpus.7

Dans le tableau 1, tous les spectres RMN 'H et ''C ont été comparés aux tourments acides (TA/2a,3a,19-trihydroxy-12-ursen-28-acide oïque）², qui est un triterpénoïde ursane qui a été trouvé dans plusieurs espèces de Rubus-p L'acide tormentique présentait de fortes similitudes avec les composés 1 et 2, sauf que les déplacements chimiques liés à C-23 et C31-33 différaient. Cette fraction a également été confirmée dans Expériences DEPT, HMQC et HMBC (Fig.2).

L'acide triterpénoïde tourmente est largement distribué dans les aliments végétaux naturels. Il possède diverses bioactivités : effets hypoglycémiants, propriétés anti-inflammatoires et anti-athérogènes, réduction de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires et activités antiprolifératives dans les lignées cellulaires de cancer du rein, de la prostate et du mélanome2426. Par conséquent, étant donné que ces composés ont le même squelette, ils peuvent avoir des activités potentielles appropriées possibles.

La figure 4 représente l'activité inhibitrice de l'élastase et de la tyrosinase des isolats. Les données obtenues à partir d'essais d'inhibition enzymatique in vitro ont été exprimées sous forme d'écart type (ET). Les composés 1 et 2 ont inhibé l'élastase avec ICso 122,199 et 98,22 ug/mL, et ont également inhibé la tyrosinase avec ICso 207,79 et 221,51 ug/mL, respectivement. Certains triterpénoïdes pentacycliques (acide ursolique et acide oléanolique) ont rapporté avoir une activité d'inhibition de l'élastase2728. La valeur d'inhibition de l'élastase du composé 2 est également inférieure à celle du composé 1. Les deux composés avaient une activité d'inhibition inférieure à celle de l'acide oléanolique témoin positif, qui avait une valeur ICso de 90,39 ug/mL. En accord, des études antérieures ont montré une ICso pour l'acide oléanolique de 76,5 ug/mL et une valeur ICso de 31,0 ug/ml pour l'acide ursolique28. Des analyses cinétiques de triterpènes pentacycliques rapportées précédemment ont montré que ces composés inhibent de manière compétitive et réversible l'élastase des neutrophiles. Dans la même étude, des expériences d'amarrage moléculaire ont montré que la fraction d'échafaudage moléculaire 28-COOH et les doubles liaisons des triterpènes pentacycliques sont essentielles pour leurs activités inhibitrices.

L'hyperpigmentation est l'un des problèmes qui surviennent avec l'âge.cistanche herbeD'où la recherche permanente d'agents éclaircissants pour la peau ou de nouveaux dépigmentants. La suppression de la tyrosinase peut agir contre la mélanogenèse". Comme le montre la figure 4, l'extrait au méthanol et les composés I et 2 ont démontré des activités modérées en tant qu'inhibiteurs de la tyrosinase.

Dans cette recherche, l'amarrage moléculaire a également été utilisé pour analyser les activités de liaison de composés sélectionnés à la tyrosinase et à l'élastase comme cibles. Les structures cristallines utilisées étaient 2Y9X, une structure cristalline de tyrosinase d'Agaricus bisporus avec tropolone inhibiteur ; et BHGP, une structure cristalline d'élastase pancréatique porcine complexée avec un puissant inhibiteur de peptidyle FR130180. Les deux ont été sélectionnés car ils ont été obtenus à partir du même organisme utilisé pour le test in vitro de cette recherche. Les macromolécules sont également liées à leurs inhibiteurs respectifs afin que l'état actif des conformations enzymatiques puisse être obtenu. Les cocristaux ont été utilisés comme centre de la cible d'amarrage moléculaire pour réduire les probabilités de liaison du composé afin que le processus de notation devienne plus efficace.

À partir de l'amarrage moléculaire, des affinités de liaison moyennes ont été obtenues pour les deux composés, comme indiqué sur les figures 5 et 6. La prédiction d'affinité est utilisée pour classer différents ligands en tenant compte de la pose d'énergie supérieure de chaque composé, une prédiction d'une meilleure pose d'énergie est montrée par scores d'affinités de liaison inférieurs16. Le redocking de l'inhibiteur désigné tropolone a été effectué avec des affinités de liaison moyennes de -7.41 kcal/mol. Les affinités de liaison moyennes des composés 1 et 2 à la tyrosinase étaient respectivement -7.84 kcal/mol et -8.37 kcal/mol (tableau 2). Il a été prédit que les deux composés avaient une meilleure affinité que l'inhibiteur.

Pendant ce temps, les affinités de liaison moyennes de l'élastaseredocking étaient de -7 0,84 kcal/mol. Les affinités de liaison moyennes des composés 1 et 2 à l'élastase étaient respectivement -7.58kcal/mol et -8.06 kcal/mol. Même si le résultat a montré que le composé 1 a des affinités plus faibles que le cocristal, il est légèrement différent (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Méthodes

Procédures expérimentales générales. Les spectres RMN 'H et' ont été enregistrés à 500 MHz à l'aide d'un instrument JEOL JNM-ECZ500R/S1. Les spectres infrarouges (IR) ont été mesurés avec un FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. D'autres analyses ont été effectuées à l'aide d'un instrument Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, d'un lecteur de microplaques VersaMax et d'un lecteur de microplaques BioTek ELX800, de feuilles d'aluminium revêtues de lore TLC-gel de silice 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Allemagne) , la chromatographie sur colonne (CC) a été réalisée en utilisant du gel de silice 60 (Merck, Darmstadt, Allemagne) avec un maillage 70-230 pour la chromatographie ouverte et un maillage 230-400 pour la chromatographie sous vide. Matériaux végétaux. Des feuilles de R. fraxinifolius ont été prélevées dans une zone de plantation du mont Pangrango, dans l'ouest de Java, à une altitude de 4 343 pieds, en décembre 2018. Le spécimen a été identifié par un botaniste (Dr Joni Setijo) du Centre de recherche en biologie de l'Institut indonésien de Sciences, Indonésie, avec le numéro de spécimen 033/IPH.1.01/If.07. La collecte de matériel végétal avait reçu l'autorisation de l'agriculteur et était conforme aux réglementations et directives institutionnelles.

Extraction et isolement. Les feuilles en poudre séchées à l'air (2300 g) ont été extraites à l'aide d'un appareil Soxhlet avec un solvant à gradient (n-hexane, EtOAc et MeOH) pour fournir les extraits respectifs, puis évaporées avec un évaporateur rotatif et four sous vide. L'extrait de méthanol (291 g) et l'extrait d'acétate d'éthyle (65 g) ont été adsorbés sur le gel de silice et réalisés par chromatographie liquide sous vide/VLC, en éluant avec un gradient progressif d'EtOAc : MeOH (de 1 : 0 à 0 : 1) à produire des fractions pour chaque extrait (Eal-Hall et M1-Mill et). Des fractions similaires qui avaient des réactions positives avec les réactifs sulfuriques de vanilline en CCM ont été combinées. Rendement de la fraction : Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); et M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02 g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }} (2,9 g). Toutes les fractions ont été soumises pour l'activité de l'inhibiteur de l'élastase, Fr. M8 a donné le rendement le plus élevé et avait une activité puissante. Pr. M8 partitionné successivement par CC sur gel de silice (éluant CH2Cl2/MeOH avec un gradient progressif) et purifié à l'aide de la colonne Sephadex LH-20 (éluant avec CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Deux fractions ont montré une nature solide et ont été cristallisés avec du chloroforme et du méthanol pour obtenir deux isolats : le composé 1 (18 mg) et : 2 (31 mg). La pureté de tous les isolats a été évaluée par CCM bidimensionnelle et en visualisant la tache à l'aide de 5 % d'acide sulfurique. acide dans le méthanol, suivi du chauffage des plaques à 110 degrés pendant 5 min.

Les cristaux ont été identifiés et caractérisés par chromatographie liquide-spectroscopie de masse (LCMS), amélioration des distorsions LH et '3C par transfert de polarisation (DEPT) RMN, cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC), corrélation quantique multiple hétéronucléaire (HMQC) et multiple hétéronucléaire corrélation des obligations (HMBC).

Test d'inhibition de l'élastase. Le test d'inhibition de l'élastase a été effectué comme décrit précédemment avec quelques modifications32. En bref, dans des plaques de microtitration à puits Nunc-96,20- des aliquotes μL de 0.8-unités/mL d'EPI dans un tampon de base de degré Trizma （pH 8.0 ） ont été mélangés avec des échantillons de 20- μL, et les mélanges ont ensuite été dilués à 180 μL dans un tampon de base de degré Trizma. Les extraits de test ont été préincubés avec l'enzyme pendant 15 minutes et des aliquotes de 20- μL du substrat N-succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (A3PVN; 2,9 mM) ont été ajoutées et incubées pendant 15 minutes supplémentaires. Le contrôle positif et les puits blancs contenaient respectivement de l'acide oléanolique et de l'eau. Les expériences ont été menées en triple et les taux d'inhibition ont été déterminés en fonction de l'absorption ; ance à 401 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques VersaMax. Le pourcentage d'inhibition a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

où E est l'absorbance de la réaction enzymatique, Eb est l'absorbance du blanc d'enzyme, T est l'absorbance de l'échantillon d'essai et Tb est l'absorbance du blanc d'essai. les valeurs ont également été déterminées à partir d'un graphique linéaire du pourcentage d'inhibition de l'élastase par rapport à la concentration (50, 75, 100, 125, 150 ug/mL). Test d'inhibition de la tyrosinase. L'inhibition de la tyrosinase a été déterminée en utilisant la méthode de formation de DOPA-chrome comme décrit précédemment avec de légères modificationsl3. En bref, dans des plaques 96-puits, des aliquotes de 20 μL de DMSO （témoin） ou de composés à tester à différentes concentrations ont été mélangées avec des aliquotes de 40 μL de 30 U/mL de tyrosinase de champignon （Sigma Aldrich） et 100-μL de Tampon phosphate 0.1-M （pH 6.8）. Ils ont été préincubés pendant 10 min à température ambiante. Les réactions ont été initiées en ajoutant des aliquotes de 4 μL de 10 mML-DOPA à chaque puits et en incubant à 37 degrés pendant 20 min. L'activité tyrosinase a ensuite été déterminée en mesurant l'absorbance à 475 nm. L'acide kojique a été utilisé comme contrôle positif. Les expériences ont été réalisées en triple. Le pourcentage d'inhibition de la tyrosinase a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

où E est l'absorbance de la réaction enzymatique, Eb est l'absorbance du blanc d'enzyme, T est l'absorbance de l'échantillon d'essai et Tb est l'absorbance du blanc d'essai. les valeurs ont également été déterminées à partir d'un graphique linéaire du pourcentage d'inhibition de l'élastase par rapport à la concentration (250, 125, 62,5, 31,25, 15,6 ug/mL).

Amarrage moléculaire. Dans cette recherche, l'activité pharmacologique in silico a été prédite avec l'amarrage moléculaire à l'aide d'un médecin. L'amarrage moléculaire ciblé a été réalisé en utilisant un ligand cocristallisé comme centre du site actif. La structure 2Y9X a été utilisée pour l'amarrage moléculaire de la tyrosinase avec la tropolone, un inhibiteur de la tyrosinase de champignon, comme cocristal. Le centre du site d'amarrage moléculaire est défini à-10.032 ;-28.769 et-43.467 en tant que dimensions X, Y et Z respectivement. La chaîne A a été séparée pour être utilisée et l'atome d'holmium a été retiré de la structure à l'aide de la chimère UCSF.

La structure du 3HGP, une élastase porcine a également été utilisée dans cette recherche.FR130180, car le cocristal a été utilisé comme centre du site d'amarrage moléculaire. Les coordonnées étaient 12,453, 9,237 et 1,199 pour les dimensions X, Y, Z, respectivement. L'affinité de liaison a été analysée à partir des dix meilleurs conformères de chaque calcul d'amarrage moléculaire.

Cet article est extrait de Scientifc Reports|(2021) 11:20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x