L'Obacunone atténue la fibrose hépatique grâce à l'amélioration des effets anti-oxydants de la GPx-4 et à l'inhibition de l'EMT

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Résumé:L'obacunone, un triterpénoïde de limonine extrait de la plante Phellodendronchinense Schneid ou Dic-tamnus dasycarpusb Turcz, provoque une variété d'effets pharmacologiques tels que des effets anti-inflammatoires, anti-néoplasiques, anti-oxydants et anti-fibrose pulmonaire. Cependant, l'effet anti-fibrotique de l'oba-cône et le mécanisme sous-jacent détaillé de la fibrose hépatique restent incertains. La fibrose hépatique est une maladie débilitante menaçant la santé humaine. Le facteur de croissance transformant (TGF)-/P-Smad est une voie majeure de fibrose caractérisée par des transformations épithéliales-mésenchymateuses (EMT) et des dépôts de collagène, accompagnés d'un excès de radicaux libres d'oxygène. Nrf-2 agit comme un régulateur antioxydant clé qui pilote l'expression de divers gènes liés aux antioxydants. La glutathion peroxydase-4(GPx-4) est un membre de la famille des glutathion peroxydase qui inhibe directement l'oxydation des phospholipides pour atténuer le stress oxydatif. Dans la présente étude, nous avons cherché à explorer le rôle du squelette dans le modèle de fibrose hépatique de souris induite par le tétrachlorure de carbone (CCl4) et dans les cellules étoilées hépatiques (lignée cellulaire LX2) provoquées par le TGF-. L'obacunone a démontré de puissants effets d'amélioration sur la fibrose hépatique à la fois dans le LX2 activé et dans les tissus hépatiques de souris avec des niveaux réduits de -SMA, de collagène1 et de vimentine. L'obacunone a également remarquablement supprimé les signaux TGF-/P-Smad et le processus EMT. Pendant ce temps, l'obacunone a exercé un puissant effet anti-oxydant en réduisant les niveaux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les deux modèles. L'effet antioxydant du squelette a été attribué à l'activation de GPx-4 et Nrf-2. De plus, l'effet thérapeutique du squelette sur les cellules LX2 a été significativement supprimé in vitro plus avec l'antagoniste GPx -4 RSL3, parallèlement aux niveaux ré-élevés de ROS.puritains vitamine cAinsi, nous démontrons que le squelette est capable d'atténuer la fibrose hépatique en améliorant le signal GPx-4 et en inhibant la voie TGF-/P-Smad et le processus EMT.

Mots clés:colonne vertébrale ; fibrose hépatique ; EMT ; cellules étoilées hépatiques ; GPx-4 ;TGF- ;stress oxydatif

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1. Introduction

L'hépatite chronique est généralement causée par une hépatite virale, une stéatose non alcoolique, une hépatite alcoolique et une hépatite auto-immune. Une lésion hépatique persistante peut aboutir à une fibrose hépatique, voire à un cancer du foie, qui a fatalement affecté la santé humaine [1]. La fibrose hépatique est un type de réponse de non-guérison de la plaie sous les facteurs de blessure continus caractérisés par l'accumulation exagérée de matrice extracellulaire (ECM) et la formation de cicatrices [2]. Les cellules étoilées hépatiques (CSH) sont généralement à l'état de repos dans des conditions normales, elles sont devenues activées de manière aberrante lors d'une lésion hépatique chronique et se sont caractérisées par une prolifération et des sécrétions élevées d'ECM [3], appelées myofibroblastes [4]. Comprendre le mécanisme d'activation des HSC est d'une grande valeur pour le développement de nouvelles thérapies pour le traitement de la fibrose hépatique.

Le facteur de croissance transformant (TGF-) favorise les réponses inflammatoires en stimulant l'expression de l'interleukine-1 (IL-1) et de l'interleukine-6(IL-6) dans les monocytes [5]. De plus, il induit des métastases cancéreuses via la transformation épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et la fuite immunitaire tumorale [6-8]. L'EMT fait référence à un processus physiologique dynamique dans lequel les cellules épithéliales perdent leur polarité et se transforment en cellules mésenchymateuses telles que les fibroblastes et les myofibroblastes, conduisant ainsi au développement de la fibrose [9]. La survenue d'EMT est toujours associée à la régulation à la baisse de la E-cadhérine et à la régulation à la hausse des marqueurs cellulaires mésenchymateux, tels que la N-cadhérine et l'escargot [10]. L'activation du TGF- -Smad est l'une des principales voies intracellulaires dans l'EMT ainsi que la formation de myofibroblastes [11].

Le stress oxydatif est considéré comme l'une des principales causes de fibrose avec la surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) [12]. Le niveau élevé de ROS provoque des dommages structurels aux biomolécules, telles que les protéines, les lipides et l'ADN, conduisant finalement à des lésions cellulaires et à la promotion de la fibrose [13]. Sous stress oxydatif, le dimère de Nrf-2-Keep-1 est dissocié, le facteur respiratoire nucléaire-2(Nrf-2) est transporté dans le noyau, et induit l'expression de divers les enzymes antioxydantes en se liant aux éléments de réponse antioxydante (ARE) réduisent les niveaux de ROS [14]. La glutathion peroxydase-4 (GPx-4) ​​agit comme une protéine antioxydante avec une activité de glutathion peroxydase, étant principalement responsable de l'inhibition de l'oxydation des phospholipides et de la production de ROS dans le processus de ferroptose [15].sistancheDes études sur des souris ont montré que la fibrose est aggravée après la perte de Nrf-2 ou de GPx-4 [16,17].

Cistanche peut anti-âge

Actuellement, il existe plusieurs médicaments disponibles pour le traitement de la fibrose hépatique, y compris ceux qui ont des propriétés anti-inflammatoires [18], antioxydantes [19] et agonistes des récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) [20]. Dans une étude récente, le professeur Yu a découvert que les patients atteints de cirrhose du foie présentaient des niveaux d'oxydation des lipides plus élevés que les témoins sains dans des échantillons cliniques [21]. Plusieurs médicaments antioxydants tels que le resvératrol[19] et l'acide ursolique |13]ont démontré de bons effets sur la fibrose. Ces preuves suggèrent cumulativement que l'anti-oxydation est une stratégie prometteuse pour le traitement de l'anti-fibrose.

La pirfénidone (PFD) est un médicament à base de pyridine pour la fibrose pulmonaire idiopathique (IPF), alors qu'elle manifeste également un bon effet thérapeutique sur la fibrose hépatique dans plusieurs études [22,23]. Ainsi, le PFD est sélectionné comme médicament témoin positif dans cette étude. L'Obacunone (Oba) est un composé limonoïde naturel extrait de plantes rutacées comme Phellodendri et Dictamnus-dasycarpus [24], qui possèdent diverses propriétés biologiques telles que des propriétés anti-inflammatoires |25, antioxydantes [26] et antitumorales [27]. Des rapports récents ont révélé qu'Oba est un puissant agoniste Nrf-2, qui atténue efficacement la fibrose pulmonaire par l'induction de CCL4 et les dommages oxydatifs causés aux cellules MDA-MB-231 par H, O2. Plus important encore, Oba est non toxique pour les souris [28]. Cependant, aucun rapport sur l'effet d'Oba dans la fibrose hépatique n'est rapporté, en particulier sur GPx-4 médiant l'oxydation des anti-phospholipides, les signaux TGF- -Smad et le processus EMT. Ici, nous avons l'intention d'explorer les effets de l'Oba sur la fibrose hépatique et de définir les mécanismes moléculaires sous-jacents.

2. Résultats

2.1. Oba Inhibé TGF- -Lx Induit-2 Activation

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >Oba 20 uM. Fait intéressant, avec l'augmentation de la concentration d'Oba, l'effet d'inhibition de l'a-SMA n'a pas augmenté de manière significative (Figure 1B).qu'est-ce que cistancheAinsi, nous avons sélectionné une concentration de 20 μM pour l'expérience suivante, le PFD servant de contrôle positif. Oba a inhibé efficacement les niveaux de protéines de -SMA, de collagène -1, de vimentine et de facteur de croissance du tissu conjonctif (CTGF) (Figure 1C), dans les aHSC [3,4]. De plus, Oba a réduit les niveaux d'expression d'ARNm de -SMA, de collagène -1 et de vimentine (Figure 1D). Les résultats d'immunofluorescence ont en outre vérifié que les signaux de coloration positifs de -SMA étaient évidemment réduits par Oba (par rapport à ceux du groupe TGF-, car le nombre de globules rouges était réduit après traitement avec Oba) dans Lx -2 (Figure 1E). Ces résultats suggèrent que l'Oba exerce un bon effet inhibiteur sur l'activation de Lx-2.

2.2.Oba a inhibé les signaux TGF-/Smad, le processus EMT et l'effet anti-inflammatoire exercé

Pour définir les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets anti-fibrose ci-dessus, les niveaux d'expression protéique du récepteur TGF, P-Smad et -SMA ont été observés, qui ont été significativement inhibés par Oba dans les aHSC (Figure 2A). De plus, la protéine les niveaux d'expression de la N-cadhérine et de l'escargot ont été réduits, tandis que le niveau d'expression protéique de la E-cadhérine a été favorisé (Figure 2B), indiquant que la voie EMT était également bloquée [3]. De plus, nous avons constaté qu'Oba induisait un niveau réduit d'IL -6 (Figure 2C).Cistanche anti-âgePour mieux évaluer l'effet d'Oba sur l'inflammation, nous avons d'abord stimulé les cellules HepG-2 (un type de lignée cellulaire de carcinome hépatocellulaire humain) avec 20 nmol de CCl4, suivi d'un traitement avec 20 uM d'Oba. Ces résultats ont montré qu'Oba pouvait réduire les niveaux d'expression de l'ARNm et des protéines de l'IL-6 dans l'HepG stimulée par CCl4--2(Figure 2D). Dans l'ensemble, l'oba a affiché de multiples effets anti-fibrosants en inhibant les signaux TGF-/Smad et le processus EMT, ainsi que les anti-inflammatoires.

2.3. Les effets anti-fibrosants de l'Oba dépendaient de la capacité antioxydante améliorée en activant GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}}.75 μM, la viabilité cellulaire de Lx-2 a été significativement diminuée ; par conséquent, 0.75-μM RLS a été sélectionné pour intervenir dans l'expression de GPx-4. Les résultats du Western blot ont montré que lorsque RSL3 était ajouté dans les aHSC, l'expression de la protéine GPx-4 était réduite et les marqueurs profibrotiques, y compris -SMA et la vimentine, ont tous été inversés de manière significative, indiquant l'importance de GPx -4 dans la médiation des effets anti-fibrosants d'Oba (Figure 3D). Pendant ce temps, Oba a évidemment réduit le niveau de ROS des aHSC par les détecteurs fluorescents ROS, et cet effet a apparemment été bloqué par RSL3 (Figure). Ces données ont indiqué que le niveau inférieur de ROS de phospholipides médié par GPx -4 était le principal anti-fibrose signal d'Oba.

2.4. Oba atténue la fibrose hépatique de souris induite par CCl4-

La fibrose hépatique induite par CCl4-est l'un des modèles de souris les plus couramment utilisés pour étudier la fibrose hépatique [3]. Au niveau histologique, Oba a significativement atténué la pathologie hépatique, comme en témoignent les dépôts de collagène améliorés indiqués par la coloration de Masson et la coloration anti-SMA. (Figure 4A-D). Ensuite, les taux sériques d'alanine transaminase (ALT)/aspartate transaminase (AST) ont été déterminés pour tester les niveaux de dommages du foie, par rapport aux souris CCL4, le groupe Oba à faible dose et le groupe PFD ont considérablement diminué les niveaux d'ALT (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba a amélioré l'expression de GPx-4, diminué l'inflammation, les expressions de protéines liées à l'EMT et réduit les niveaux d'oxydation des lipides dans la fibrose hépatique induite par CCl4-

Comme le montre la figure 5A, Oba a inhibé les expressions protéiques de l'IL -6 et l'apparition d'EMT dans le foie fibrotique de souris avec des niveaux réduits d'escargot et de N-cadhérine mais des niveaux plus élevés d'E-cadhérine. De plus, les expressions protéiques de Nrf-2 et GPx-4 ont évidemment augmenté après traitement avec des doses moyennes et élevées d'Oba (figure 5B).cistanche benefíciosLes résultats de la coloration immunohistochimique (IHC) ont démontré que par rapport au groupe modèle, le nombre de cellules positives GPx -4 (marron) dans les groupes Oba à dose élevée et moyenne a été significativement augmenté (Figure 5C, E). Nous avons ensuite testé les niveaux de stress oxydatif dans le foie des souris et avons constaté que, par rapport au témoin, l'intensité de fluorescence ROS du groupe modèle était apparemment plus élevée. D'autre part, le niveau de ROS a été significativement diminué après le traitement avec Oba (Figure 5D, F).

3. Débat

La fibrose est une maladie intimidante dans le monde. Quelle que soit l'étiologie, y compris l'infection virale, l'hépatite alcoolique ou non alcoolique et les réponses auto-immunes, toutes aboutissent à une fibrose due à une atteinte hépatique chronique [1]. L'activation des CSH est l'événement central sous-jacent à la fibrose hépatique. Les CSH sont activées avec des productions aberrantes d'une variété de facteurs fibrogènes et de dépôts de MEC [2,3]. La signalisation d'activation canonique de Smad liée au TGF- -, le processus EMT ainsi que l'inflammation chronique liée à l'IL-6- seraient impliqués dans les processus ci-dessus [3,4]. Afin d'évaluer les effets anti-fibrosants de l'Oba sur la fibrose hépatique, nous nous attachons dans un premier temps à définir ses effets sur l'activation Lx-2 induite par le TGF- , puis à vérifier ses effets anti-fibrosants in vivo en utilisant CCl4-modèle de souris à fibrose hépatique induite à la fin.

Oba est un composé limonoïde naturel [24] et ses effets biologiques comprennent principalement des fonctions anti-inflammatoires [25], antioxydantes [26] et antitumorales [27]. Récemment, il a été découvert que l'Oba est un agoniste Nrf-2 puissant et efficace et exerce des effets anti-fibrose pulmonaire chez la souris [28]. Cependant, les preuves manquent encore sur ses effets anti-fibrose hépatique et les mécanismes moléculaires associés. Ici, les surexpressions de -SMA, de collagène 1 et de CTGF ont toutes été inhibées par Oba dans des modèles Lx-2 stimulés par TGF- . La signalisation EMT améliorée est également efficacement supprimée par Oba.

Il a été confirmé que le stress oxydatif est un contributeur important à la fibrose [12]. Les espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont un terme générique désignant les molécules ou ions oxydés ayant une activité biologique et les surproductions de divers ROS dans les hépatocytes peuvent entraîner leur mort et provoquer une fibrose hépatique [13]. Au contraire, les CSH au repos sont activées après une lésion des cellules hépatiques et un excès de ROS amplifie davantage l'activation des CSH et aboutit à une fibrose hépatique [12]. Par conséquent, l'amortissement du stress oxydatif exagéré devient un traitement efficace contre la fibrose.

Nrf-2 est un régulateur essentiel du stress antioxydant, le Nrf-2 phosphorylé activé est transloqué dans le noyau pour entraîner la régulation à la hausse des protéines antioxydantes en aval, GST, HO1[15]. De nombreux activateurs chimiques naturels de Nrf2 possèdent des effets anti-fibrosants, tels que la tert-butylhydroquinone et la curcumine. Parmi toutes les protéines antioxydantes, la glutathion peroxydase-4(GPx-4) fait partie de la famille des glutathion peroxydase(GPx1-8) et elle facilite l'équilibre redox en réduisant le glutathion [ 30-32]. Il est prouvé que les expressions plus élevées de glutathion peroxydase -7 inhibent la stéatose hépatique non alcoolique en diminuant la production de ROS [33]. GPx-4 a réduit le peroxyde de phospholipides sur la membrane lipidique pour protéger les cellules des lésions oxydativesJ15]. Kazuya Tsubouchi et al. ont constaté que l'expression de GPx-4 est réduite dans les tissus de fibrose pulmonaire de souris induite par la bléomycine, et que la fibrose est plus sévère lorsque le gène GPx-4 est désactivé. En outre, la peroxydation lipidique et la voie TGF-/P-Smad sont significativement améliorées dans les fibroblastes pulmonaires lorsque le gène GPx-4 est épuisé [17]. Récemment, davantage de preuves ont soutenu que les ROS dérivés de phospholipides sont impliqués dans la mort cellulaire spéciale, appelée ferroptose. L'inhibiteur de la GPx -4, RSL3, est également appliqué comme inducteur de la ferroptose [21, 34].

Dans nos expériences, nous avons constaté qu'Oba exerçait la capacité antioxydante en régulant à la hausse Nrf-2 et GPx-4 et en régulant à la baisse Nox-2. Notamment, l'effet anti-fibrosant d'Oba était considérablement affaibli lorsque le gène GPx-4 était inhibé par RSL3, l'inhibiteur de GPx-4. Constamment, le niveau réduit de ROS par le traitement Oba a également été éclairé. Ces observations in vitro ont fortement soutenu que les ROS anti-phospholipides médiés par GPx -4- étaient essentiels pour les effets protecteurs d'Oba.

Afin de valider les résultats du traitement anti-fibrose ci-dessus d'Oba dans les cellules LX2, la fibrose hépatique de souris induite par CCl 4- a également été examinée. CCl4 est un type de poison hépatotrope, la dégradation médiée par l'enzyme microsomale P450 produit des radicaux libres hautement réactifs pour détruire l'intégrité de la membrane cellulaire, déclenchant à son tour une série de dysfonctionnements et de lésions hépatiques, évoluant finalement vers une fibrose hépatique [35]. Dans notre expérience, Oba a montré de bons effets curatifs sur la fibrose hépatique induite par CCl. Il a atténué les dommages au foie avec un niveau inférieur d'AST, la zone des faisceaux de fibres de collagène est devenue plus petite et les expressions protéiques de l'a-SMA, du CTGF, du collagène -1, de l'escargot, de la N-cadhérine et de l'IL{{10 }} ont tous été réduits. Alors que la signalisation antioxydante, les expressions protéiques de Nrf-2 et GPx-4 étaient également élevées, les niveaux plus élevés de ROS ont diminué. Ces résultats ont en outre confirmé les effets anti-fibrosants in vitro de l'Oba et de la signalisation associée, en particulier l'inhibition de l'EMT et des effets antioxydants par Nrf-2 et GPx-4.

En résumé, nous avons conclu qu'Oba atténuait l'activation des HSC induite par le TGF- - et la fibrose hépatique induite par le CCl4- par le biais de divers mécanismes. Premièrement, Oba a inhibé la voie classique TGF-/Smad, l'EMT et la production d'IL-6. Deuxièmement, il a affiché une excellente capacité antioxydante en améliorant les expressions de Nrf-2 et GPx-4. Les ROS anti-phospholipides médiés par la GPx -4 contribuaient principalement à ses effets anti-fibrosants. Par conséquent, Oba peut servir de régent chimique candidat pour la prévention et le traitement de la fibrose.

Oba a montré un effet curatif sur la fibrose hépatique induite par CCl4- chez les souris C57. Oba pourrait réguler à la baisse l'expression de biomarqueurs de protéines de fibrose, tels que : -SMA, CTGF, etc. Pendant ce temps, Oba a réduit l'expression protéique de I-6, E-cadhérine, etc. Il était intéressant que Mid-Oba montre des signes de meilleurs résultats par rapport à l'Oba faible et à l'Oba élevé en termes d'expression relative de ces protéines, bien que cela ne soit pas statistiquement significatif. Cependant, cela a indiqué que le dosage optimal pourrait être un facteur critique dans ce processus, et nous explorerons ce phénomène dans la prochaine expérience. De plus, nous avons constaté que les ROS et le degré de fibrose hépatique étaient inférieurs avec des expressions régulant positivement Nrf-2 et GPx-4. Nous pensons donc qu'Oba pourrait soulager la fibrose hépatique en régulant le Nrf-2 et le GPx-4. Cependant, le PFD pourrait avoir une meilleure action thérapeutique que l'Oba à la fois in vivo et vitro. Cependant, Oba était meilleur que PFD sur l'effet anti-oxydant, il est propice à augmenter la possibilité de trouver un nouveau médicament pour l'effet anti-foie-fibrogène du côté anti-oxydant, et apporte une petite contribution à la santé humaine.

4. Matériels et méthodes

4.1. Produits chimiques et réactifs

Oba (n° B20553, pureté supérieure ou égale à 98 %) et RSL3 (n° S81241, pureté supérieure ou égale à 98 %) ont été achetés auprès de YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Shanghai, Chine) et dissous dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) (n° R21950 ; YUANYE) à une concentration de 72,64 mg/mL et 6 mmol, respectivement. Après stérilisation sur filtre, la solution résultante a été conservée à -20 degré C. La solution a été ajoutée au milieu de culture pour obtenir une concentration finale de DMSO de<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Cultures cellulaires et conception expérimentale

La lignée de cellules étoilées hépatiques humaines Lx-2 et la lignée de cellules cancéreuses du foie humain Hepg-2 (toutes provenant du département de pharmacie de la quatrième université médicale militaire, Chine) ont été cultivées dans le milieu d'aigle modifié de Dulbecco ( DMEM) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de 1 % de pénicilline (Thermo Fisher Scientific) et de streptomycine (Thermo Fisher Scientific), puis maintenu à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 et de 95 % d'air. Pour évaluer l'effet d'Oba sur la viabilité des cellules Lx-2, Lx-2 a été recouvert de 1 × 10 * cellules/puits dans une plaque à puits 96- et incubé pendant 24 h avant l'ajout. d'Oba. Ensuite, Lx-2 ont été traités avec différentes concentrations d'Oba (10,20, 40,80 et 160 wM et cultivés pendant 24,48 ou 72 h. La viabilité cellulaire a été testée par le CCK8. Pour évaluer la effet d'Oba sur l'activation de Lx-2, Lx-2 a été pré-cultivé avec un milieu sans sérum pendant 12 h, suivi d'une stimulation avec TGF- (10ng/mL, 24 h) et d'un traitement avec Oba ou PFD. Pour évaluer l'effet d'Oba sur l'inflammation, Hepg-2 a été stimulé par CCl4(20 nm, 8 h) et traité avec 20 μM d'Oba. À la fin de la culture, les cellules ont été collectées et soumises à Western blot et analyse qPCR en temps réel.

4.3. Animaux et conception expérimentale

Des souris mâles C57 pesant 20± 0,5 g (The Laboratory Animal Center of The Fourth Military Medical University) ont été hébergées dans des conditions appropriées de température de 25 degrés ± 2 degrés et d'un cycle lumière/obscurité de 12-h avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Chaque expérience de cette étude a été réalisée conformément aux protocoles approuvés par le Comité de la quatrième université médicale militaire sur les soins aux animaux. Les souris c57 ont été réparties au hasard en 6 groupes (n=6 dans chaque groupe) comme suit : i) groupe témoin factice, i) groupe modèle, ii) groupe à haute teneur en Oba (CCl4 plus 6 mg/kg d'Oba), io ) groupe Oba moyen (CCl4 plus 3 mg/kg Oba）, ø）groupe Oba faible （CCl4 plus 1,5 mg/kg Oba）, et vi） groupe PFD （CCl4＋ PFD）. Le groupe modèle a été traité avec CCl4 (30 cent CCl4/huile d'olive, injection intrapéritonéale de 5 ml/kg) trois fois par semaine pendant une période de 6- semaine pour induire une fibrose hépatique. Les autres groupes ont été nourris avec différentes doses d'Oba ou de VFI et des volumes égaux d'infection intrapéritonéale CCil4 pour une période de 6- semaine. Un volume égal d'huile d'olive au lieu de CCl4 a été administré à C57 par ipas un contrôle fictif. Chaque expérience dans cet article a été réalisée conformément aux protocoles approuvés par le quatrième comité universitaire médical militaire sur les animaux Se soucier.

4.4.Western Blot

Les foies C57 ou les cellules en culture ont été homogénéisés ou lysés dans un tampon RIPA en utilisant l'appareil de lapage des tissus ou le grattage des cellules (Service, KZ-2). La concentration en protéines a été mesurée à l'aide du kit de dosage des protéines BCA. Le lysat a été centrifugé (4 degrés, 12,000 tr/min, 5 min) et le surnageant a été recueilli. Les étapes opératoires ont été suivies comme précédemment rapporté [14]. Les échantillons ont été scannés sous un système d'imagerie et d'analyse par chimioluminescence (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Analyse qPCR en temps réel

Les foies C57 ou les cellules cultivées ont été homogénéisés ou lysés dans le réactif Trizol à l'aide de l'appareil de lapage tissulaire pour extraire l'ARN total. L'ARN total a été rétrotranscrit en ADNc en utilisant le kit de synthèse d'ADNc RevertAid First Strand. -actin a été utilisé comme référence interne. La RT-qPCR a été réalisée sur le système qPCR en temps réel 7500 (Applied Biosystems) avec les réactifs SYBR Premix Ex Taq. Les amorces de gènes humains utilisées ont été répertoriées dans le tableau 1.

Cet article est extrait de Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules