L'extrait de feuille d'olivier (OLE) a altéré le trafic d'aquaporine 2 induit par la vasopressine grâce à l'activation du récepteur de détection du calcium

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La vasopressine (AVP) augmente la perméabilité à l'eau dans lerénalcanal collecteur via la régulation du trafic des aquaporines-2 (AQP2). Plusieurs troubles, dont l'hypertension et la sécrétion inappropriée d'hormone antidiurétique (SIADH), sont associés à des anomalies de l'homéostasie hydrique. Il a été démontré que certains phytocomposés sont bénéfiques pour la santé humaine. Ici, les effets de l'extrait de feuille d'olivier (OLE) ont été évalués à l'aide de modèles in vitro et in vivo. Des études confocales ont montré que l'OLE prévient la translocation de l'AQP2 induite par la vasopressine vers la membrane plasmique dans les cellules MCD4 et le ratreins. L'incubation avec l'OLE diminue l'augmentation dépendante de l'AVP du coefficient de perméabilité à l'eau osmotique (Pf). Pour élucider les effecteurs possibles de l'OLE, le calcium intracellulaire a été évalué. , un inhibiteur sélectif de CaSR, a aboli l'effet inhibiteur de l'OLE sur la perméabilité à l'eau dépendante de l'AVP. Des expériences in vivo ont révélé que le traitement par OLE augmente l'expression de l'ARNm du CaSR et diminue l'ARNm de l'AQP2 parallèlement à une augmentation de l'AQP2-miARN ciblant-137. Ensemble, ces résultats suggèrent que l'OLE antagonise l'action de la vasopressine par la stimulation du CaSR, indiquant que cet extrait peut être bénéfique pour atténuer les troubles caractérisés par une signalisation anormale du CaSR et affectant la réabsorption rénale de l'eau.

Les feuilles d'olivier ont été largement utilisées comme remèdes traditionnels pour soigner plusieurs maladies, en particulier dans les pays méditerranéens. Les feuilles sont couramment consommées dans l'alimentation humaine sous forme d'extrait ou de poudre pour préparer des infusions ou des tisanes. L'analyse de caractérisation chimique a révélé que les feuilles d'olivier contiennent plusieurs composés bioactifs qui peuvent exercer des effets bénéfiques sur certaines morbidités telles que le syndrome métabolique, la dyslipidémie et l'hypertension. Chez les patients souffrant d'hypertension essentielle, l'OLE a diminué la tension artérielle et légèrement réduit la glycémie et la calcémie ». De nombreux polyphénols tels que l'oleuropéine, l'hydroxytyrosol et le tyrosol ont été trouvés enrichis dans un extrait de feuille d'olivier vert (OLE)5, et ils sont connus pour être impliqués dans la prévention de certaines maladies caractérisées par le stress oxydatif. Par conséquent, au cours des dernières années, l'intérêt pour l'étude des effets bénéfiques potentiels de l'extrait de feuille d'olivier a augmenté parmi les scientifiques de différents domaines de recherche. L'OIE a montré un effet antiprolifératif significatif dans les cellules de mésothéliome malin en modifiant la dynamique du calcium intracellulaire, ciblant éventuellement T- canaux de type Ca2 plus. Il est intéressant de noter que l'OLE exerce des effets antihypertenseurs sur l'hypertension génétique chez les rats spontanément hypertendus (SHR), liés à l'amélioration de la fonction vasculaire*. La réabsorption excessive d'eau joue un rôle important dans la pathogenèse de l'augmentation de la pression artérielle. Chez les patients hypertendus, traités avec de l'extrait de feuilles d'olivier, une réduction significative de plusieurs facteurs inflammatoires a été trouvée associée à une diminution de la pression artérielle. Par ailleurs, une rétention d'eau excessive caractérise plusieurs troubles tels que la cirrhose du foie, l'insuffisance cardiaque et la sécrétion inappropriée d'hormone antidiurétique (SIADH). L'homéostasie de l'eau corporelle est étroitement contrôlée par l'hormone antidiurétique vasopressine (AVP) qui est libérée en cas de déshydratation. L'AVP lie son récepteur apparenté V2R localisé sur la membrane basolatérale derénalles cellules principales activant ainsi la voie du signal de l'AMPc qui entraîne la translocation des vésicules portant l'aquaporine -2 (AQP2) d'un pool intracellulaire à la membrane plasmique apicale où se produit la réabsorption d'eau. Au niveau moléculaire, plusieurs facteurs peuvent moduler l'équilibre hydrique rénal. Un niveau élevé de calcium luminal a régulé à la baisse le trafic AOP2 dépendant de la vasopressine à court terme par l'activation du récepteur sensible au calcium (CaSR)1,12. D'autre part, l'activation du CaSR dans les cellules épithéliales tubulaires proximales rénales conditionnellement immortalisées, isolées de l'urine humaine, a induit une augmentation significative du calcium cytosolique et a réduit de manière significative l'augmentation de l'AMPc induite par la forskoline (FK), un activateur direct de l'adénylate cvclase3. , dans les cellules MCD4 du canal collecteur rénal, exprimant de manière stable le canal hydrique AOP2, la stimulation du CaSR a atténué l'augmentation dépendante de l'AMPc de la phosphorylation de l'AQP2 au niveau de la sérine 256 qui est un événement pivot dans la cascade de transduction du signal activée par la vasopressine et qui a finalement augmenté la perméabilité à l'eau4 ,15 En outre, dansun reintranches de rein de souris médullaire interne, l'activation du CaSR avec le NPS-R568 calcimimétique a provoqué une augmentation significative de l'AQP2-ciblant le miARN-137, confirmant une interaction étroite entre la voie du signal du CaSR et l'AQP{ {4}} perméabilité à l'eau dépendantel.17. Dans la présente étude, les effets de l'extrait de feuille d'olivier, obtenu à partir du cultivar local Coratina, ont été évalués sur la fonction AQP2 induite par la vasopressine dans les cellules MCD4 du canal collecteur rénal exprimant de manière stable AOP2 et dans dDAVP rats traités injectés avec l'extrait. Nous apportons la preuve que le traitement OLE neutralise la réponse de la vasopressine dans les cellules rénales, ce qui pourrait expliquer en partie son effet diurétique. Fait intéressant, cet effet semble être lié à l'activation induite par l'OLE du CaSR, un récepteur connu pour avoir une interaction négative avec le récepteur de la vasopressinel2.

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Résultats

Effets de l'OLE sur la fonction AQP2 induite par la vasopressine dans les cellules MCD4. Pour étudier l'implication possible de l'OLE sur la fonction AQP2 dépendante de la vasopressine,rénalDes cellules MCD4 du canal collecteur, exprimant de manière stable le récepteur 2 de la vasopressine (V2R) et l'AQP2 humain, ont été utilisées comme modèle expérimental18. Des études confocales (Fig. 1A) ont révélé que, par rapport aux cellules traitées avec dDAVP, dans lesquelles la coloration AQP2 était localisée sur la membrane plasmique apicale, le traitement avec OLE empêchait la localisation membranaire de l'AOP2 induite par la stimulation avec dDAVP. Conformément à ces observations, le traitement OLE a altéré l'augmentation induite par dDAVP de la réponse osmotique temporelle (indiquée par 1/t sur la figure 1B) (OLE/dDAVP=88.70±1.86 pour cent , n=292 cellules vs dDAVP=206.8±5,49 %, n=186 cellules ;p<0.001).altogether these="" findings="" suggested="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" principal="" cell="" permeability="" by="" preventing="" aqp2="" translocation="" from="" an="" intracellular="" vesicle="" pool="" to="" the="" apical="" plasma="" membrane.="" vasopressin-induced="" aop2="" trafficking="" is="" controlled="" by="" intracellular="" camp="" which="" stimulated="" the="" camp-dependent="" kinase="" (pka)1.="" further,="" to="" evaluate="" the="" functionality="" of="" the="" v2r="" in="" the="" presence="" of="" ole="" in="" terms="" of="" camp="" production,="" permeable="" 8-br-camp="" was="" used="" as="" an="" external="" source="" of="" camp.="" treatment="" with="" 8-br-camp="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" elicited="" by="" ole="" on="" osmotic="" water="" permeability(ole/8-br-camp="188.7±3.56%,n=293" cells="" vs="" ole="85.93±2.27%," n="238"><0.001).therefore, to="" evaluate="" whether="" treatment="" with="" ole="" regulates="" aqp2="" trafficking="" by="" fine-tuning="" intracellular="" camp="" level,="" fluorescence="" resonance="" energy="" transfer(fret)technology="" was="" applied.="" compared="" to="" untreated="" cells="" (ctr),="" normalized="" netfret="" signals="" are="" reduced="" with="" ddavp="" stimulation(ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.00l; fig.2a),consistent="" with="" a="" significant="" increase="" of="" intracellular="" camp.="" conversely,="" treatment="" with="" ole="" prevented="" the="" ddavp="" dependent="" decrease="" of="" netfront="" signals="" consistent="" with="" a="" decrease="" of="" the="" vasopressin="" dependent="" camp="" release="" (ole/ddavp="92.97±3.46%," n="211" cells="" vs="" ddavp="77.86±3.13%," n="173" cells;=""><0.05; fig.2a).treatment="" with="" ole="" alone="" did="" not="" affect="" the="" intracellular="" cgmp="" level="" compared="" with="" cells="" left="" under="" basal="" conditions(ole="96.15±3.80%," n="184" cells="" vs="" ctr="100.00±3.56%,n=276" cells;=""><0.05).besides, western="" blotting="" studies(fig.2b)revealed="" that="" treatment="" with="" ole="" significantly="" reduced="" the="" ddavp="" induced="" increase="" of="" aqp2="" phosphorylation="" at="" serine="" 256(aqp2-ps256),="" indicating="" that="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking,="" in="" response="" to="" ole,="" are="" dependent="" on="" camp-pka="" function.="" the="" phosphorylation="" level="" of="" aqp2-ps256="" in="" response="" to="" ole="" was="" not="" statistically="" different="" from="" the="" control="" even="" though="" it="" tended="" to="" be="" reduced.="" to="" gain="" insight="" into="" the="" molecular="" signals="" underlying="" the="" action="" of="" ole,="" intracellular="" calcium="" dynamics="" were="" evaluated.="" mcd4="" cells="" endogenously="" express="" a="" functional="" calcium-sensing-receptor(casr)20,="" which="" plays="" an="" important="" role="" in="" controlling="" aqp2="" expression="" and="" trafficking'4.long="" term="" incubation="" with="" ole(0.1="" mg/ml)slightly="" increased="" the="" intracellular="" calcium="" level="" compared="" with="" untreated="" cells(fig.3;="" ole="209.0±13.45" nm,n="128" cells="" ys="" ctr="163.3±8.957" nm,n="97cells:"><0.05).co-incubation with="" ole(0.1="" mg/ml)="" and="" the="" selective="" nps2143(1um)antagonist="" of="" the="" casr="" abolished="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" mobilization(ole/nps2143="168.8±11.43" nm,n="144" cells="" ys="" ole="209.0+13.45" nm.="" n="128"><0.05).to dissect="" further="" intracellular="" calcium="" signals="" in="" response="" to="" ole,="" functional="" experiments="" were="" also="" performed="" under="" acute="" stimulation="" with="" ole="" and="" nps2143.="" short-term="" treatment="" with="" ole="" (1="" mg/ml)="" evoked="" specific="" calcium="" oscillations(fig.4a)="" that="" were="" prevented="" when="" cells="" were="" pretreated="" with="" the="" selective="" casr="" inhibitor="" nps2143（10="" μm）.="" statistical="" analysis="" of="" the="" fluorescence="" responses（fig.="" 4b）revealed="" that="" incubation="" with="" ole="" increased="" cytosolic="" calcium="" by="" 97.06±6.93%(vs="" atp="" 100.00±2.28%).pretreatment="" with="" nps2143="" reduced="" the="" ole="" induced="" intracellular="" calcium="" increase(ole/nps2143="18.87±2.17%,n=59" cells="" vs="" ole="97.06±6.93%," n="50" cell;=""><0.001).to deeper="" investigate="" whether="" the="" effect="" of="" ole="" on="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" occurred="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling,="" functional="" studies="" were="" performed="" as="" previously="" shown="" (fig.1b).="" interestingly,="" treatment="" with="" nps2143="" abolished="" the="" inhibitory="" effect="" of="" ole="" on="" avp-regulated="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.5;="" ole/ddavp/nps2143="190.4±7.15%," n="">cellules vs OLE/dDAVP=88.70±1.86 pourcent, n=292 cellules ;p<0.001), suggesting="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" the="" avp-dependent="" water="" reabsorption="" through="" the="" activation="" of="" the="" casr="" signaling.="" compared="" to="" untreated="" cells,="" treatment="" with="" only="" nps2143="" did="" not="" affect="" the="" osmotic="" water="" permeability="" (fig.="">

<0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" alt="Figure 2. Efects of OLE on AQP2 phosphorylation and cAMP production in MCD4 cells. (A) Evaluation of cAMP production by FRET experiments in MCD4 cells transiently transfected with H96 as described in the " materials="" and="" methods"="" section.="" histogram="" reports="" netfret="" measured="" in="" cells="" under="" basal="" conditions,="" treated="" with="" ddavp="" (100 nm="" for="" 30 min),="" ole="" (0.1 mg/ml="" o/n),="" or="" co-treated="" with="" ole="" and="" ddavp.="" te="" treatment="" with="" ddavp="" displayed="" a="" signifcantly="" higher="" camp="" production="" depicted="" as="" a="" reduced="" netfret="" signal.="" data="" are="" shown="" as="" single="" values="" in="" a="" scatter="" plot="" reporting="" means±s.e.m=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.05 vs="" ddavp).="" (b)="" lysates="" from="" mcd4="" cells="" were="" subjected="" to="" immunoblotting="" using="" abs="" against="" aqp2-ps256="" and="" totalaqp2.="" densitometric="" analysis="" of="" aqp2-ps256="" bands="" normalized="" to="" total="" aqp2="" bands="" (total="" aqp2)="" is="" reported="" in="" the="" histogram.="" data="" are="" expressed="" as="" means±s.e.m=""><0.05 or=""><0.001 vs="" ctr;=""><0.001 vs="" ddavp)."="" width="480" height="320" border="0" vspace="0" style="width: 480px; height: 320px;">

Effets de l'OLE dans les reins de rats injectés d'OLE.

Pour étudier plus avant les actions de l'OLE, des études in vivo ont été réalisées. Plus précisément, des rats ont reçu une injection d'OLE (250 mg/kg/jour) une fois par jour pendant trois jours. Alternativement, les rats ont été co-traités avec OLE, pendant 3 jours, et dDAVP, pendant 30 min. L'évaluation de l'ARNm de CaSR qui a été isolé du canal collecteur rénal de rats et traité pour la PCR en temps réel (Fig.6) a révélé une augmentation significative de l'ARNm de CaSR dans OLE(OLE=1.87±0.29, n{{ 10}} rats vs CTR=1.02±0.17, n=5 rats ; p<0.05) and="" ole/ddavp(ole/ddavp="2.77±0.25," n="5" rats="" vs="" ctr="1.02±0.17,n=5" rats="" and="" ddavp="1.08±0.11," n="5" rats;=""><0.001)injected rats="" compared="" with="" control="" and="" ddavp="" animals,="" casr="" signaling="" can="" regulate="" the="" expression="" level="" of="" selective="" mirnas,="" which="" downregulated="" the="" expression="" level="" of="" aqp216.based="" on="" these="" findings,="" and="" considering="" that="" treatment="" with="" ole="" attenuated="" aqp2="" function,="" the="" level="" of="" mir-137,="" a="" known="" aqp2-targeting="" mir="" in="" the="" renal="" collecting="" duct,="" was="" evaluated.="" compared="" to="" control="" rats="" (fig.7),="" the="" level="" of="" mir-137="" in="" the="" renal="" collecting="" ducts="" of="" ole(ole="4.18.10-8±1.07.10-8ng,n=5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.05)and ole/ddavp="" rats="" was="" increased="" indicating="" that="" treatment="" with="" ole="" upregulates="" the="" casr="" signaling="" and="" the="" expression="" level="" of="" the="" mir-137(ole/ddavp="4.38.10-8±47.01·10-9ng," n="5" rats="" vs="" ctr="1.35.10-8±2.89.10-ng," n="5" rats;=""><0.01 and="" vs="" ddavp="2.1610-8±3.52.10-°ng," n="5"><0.05). to="" verify="" whether="" the="" increase="" of="" mir-137="" affected="" the="" expression="" level="" of="" aqp2,="" renal="" samples="" were="" processed="" for="" real-time="" pcr.="" data(fig.8a)revealed="" that="" the="" expression="" levels="" of="" aqp2="" mrna="" were="" lower="" in="" ole(ole="0.36±0.06,n=5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5"><0.01)and ole/ddavp(ole/ddavp="0.65±0.12," n="5" rats="" vs="" ctr="1.00±0.08," n="5" rats="" and="" ddavp="1.03±0.16,n=5" rats;=""><0.05)renal samples="" compared="" with="" specimens="" obtained="" from="" control="" animals.="" besides,="" western="" blotting="" analysis(fig.="" 8b)showed="" that="" treatment="" with="" ole="" reduced="" the="" abundance="" of="" aop2="" regardless="" of="" ddavp="" stimulation(ole/ddavp="0.62±0.13,n=5" rats="" vs="" ddavp="1.04±0.16,n=5"><0.05)indicating that="" the="" ole-induced="" reduction="" of="" aqp2="" mrna="" expression="" level="" coincided="" with="" a="" decrease="" of="" aqp2="" protein="" content.="" to="" evaluate="" the="" effect="" of="" ole="" on="" aqp2="" phosphorylation="" and="" trafficking="" in="" the="">un rein, une analyse Western blot et des études confocales ont été réalisées (Fig.9). Chez les rats ayant reçu une injection d'OLE/dDAVP, la phosphorylation de l'AQP2 au niveau de la sérine 256 a été significativement réduite par rapport aux tissus rénaux des animaux traités par dDAVP (OLE/dDAVP=0). 77±0.16, n=5 rats vs dDAVP=2.16±0.25,n=5 rats ; p<0.001,fig.9a),thereby confirming="" the="" in="" vitro="" findings(fig.2b).="" besides,="" confocal="" studies="" (fig.9b)="" of="" kidney="" sections="" revealed="" that="" exposure="" to="" ole="" prevented="" the="" aop2="" mem-brane="" localization="" that="" instead="" was="" observed="" in="" ddavp="" treated="">

Discussion

Le calcium est un important messager intracellulaire qui module une pléthore de fonctions cellulaires2. Une signalisation calcique anormale peut entraîner plusieurs maladies, notamment l'insuffisance cardiaque, le cancer et l'hypertension23. Le contrôle spécifique de l'expression et de l'activité des protéines contrôlant plusieurs signaux calciques intracellulaires s'est avéré efficace pour faire face à de nombreux troubles et est donc attractif pour le développement de médicaments. Cette étude fournit de nouvelles informations sur le mécanisme d'action de l'OLE en montrant sa capacité à moduler la signalisation intracellulaire du calcium par la stimulation du CaSR impliqué dans le réglage fin du trafic et de l'expression de l'AQP2 induite par la vasopressine. Dans des conditions physiologiques, l'AQP2 joue un rôle important dans le contrôle de l'homéostasie de l'eau corporelle25. La stimulation de la machinerie intracellulaire, conduisant à la localisation de l'AQP2 au niveau de la membrane plasmique apicale, entraîne une rétention d'eau anormale et une hyponatrémie consécutive, comme dans le syndrome de sécrétion inappropriée d'hormone antidiurétique (SIADH), de cirrhose du foie et d'insuffisance cardiaque congestive. Chez une souris modèle de SIADH, associé à l'haploinsuffisance de la polykystose rénale 1, le taux basal de calcium intracellulaire a été significativement réduit par rapport au taux mesuré dans les conduits collecteurs de souris de type sauvage. Un faible taux de calcium intracellulaire a régulé à la baisse l'activité de certaines enzymes, notamment la protéine phosphatase PP2A, entraînant la régulation à la hausse de la phosphorylation de l'AOP2 au niveau de la sérine 2561. Au contraire. l'activation du CaSR avec le calcimimétique NPS-R568 a augmenté la concentration de calcium intracellulaire et réduit le niveau d'AMPc dans les cellules déficientes en PKD1. Il est important de noter que le calcium cytosolique peut réguler à la baisse la cyclase adénylée3 inhibant le calcium, affinant ainsi le niveau intracellulaire d'AMPc. cyclase4.Dans cette étude, le traitement par OLE a empêché l'augmentation dépendante de la vasopressine de l'AMPc et de l'AOP2-pS256, peut-être secondaire à une augmentation de la concentration de calcium intracellulaire. Il convient de noter que l'exposition à une source externe d'AMPc à l'aide de 8-Br-AMPc perméable a contrecarré de manière significative l'effet inhibiteur de l'OLE sur la voie V2R.

Un niveau élevé de calcium cytosolique peut entraîner la mort cellulaire et l'apoptose. Cependant, une augmentation soutenue du calcium intracellulaire de 250 nM à plus de 600 nM a favorisé la survie neuronale4. Dans les cellules MCD4, le traitement par OLE à 0,1 mg/ml n'affiche pas un effet cytotoxique. A cette concentration, l'OLE (0,1 mg/ml) a légèrement augmenté le taux de calcium intracellulaire. L'imagerie calcique a révélé que la stimulation aiguë par OLE provoquait une augmentation transitoire du calcium intracellulaire par l'activation du CaSR qui est aboli lorsque les cellules étaient préincubées avec l'antagoniste sélectif du CaSR NPS2143, Dans les cellules du tubule proximal rénal, activation allostérique du CaSR avec l'I-ornithine réduit la production de ROS, régulant ainsi à la baisse le stress oxydatif mitochondrial qui a provoqué l'apoptose cellulaire356. De plus, notre étude précédente a montré que l'expression des variants de gain de fonction du CaSR réduisait la libération de ROS et la S-glutathionylation de l'AQP237. L'incubation avec OLE a diminué la génération de ROS dans les cellules MCD435 montrant sa capacité antioxydante. Néanmoins, pour le moment, il n'est pas clair si OLE affecte l'AOP2-S-glutathionylation. De nombreuses études ont révélé que l'OLE ou l'oleuropéine, qui est le principal constituant de l'OLE, peuvent avoir des rôles protecteurs en inhibant la mort cellulaire39. Cependant, des effets dose-dépendants ont été décrits chez des rats recevant de l'OLE. Des réponses bénéfiques ont été obtenues à des doses de 250 et 500 mg/kg. En revanche, à des concentrations plus élevées, le traitement par OLE peut avoir des effets néfastes éventuellement dus aux actions pro-oxydantes de plusieurs phytocomposés. Dans cette étude, des rats ont reçu une injection d'OLE à une dose de 250 mg/kg pendant trois jours, montrant une régulation positive du CaSR. Le niveau d'expression du CaSR est augmenté par certains composés qui agissent comme activateurs allostériques du récepteur. Les calcimimétiques ont en effet diminué les calcifications vasculaires en augmentant la biosynthèse du CaSR dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines. Dans ce concours, on ne peut exclure la possibilité que certains composés de l'OLE puissent fonctionner comme modulateurs allostériques du CaSR. D'autre part, la stimulation avec la vasopressine peut conduire à la libération d'IL-6 qui peut contribuer à augmenter le niveau d'expression du CaSR42.

Dans le rein, la stimulation de la signalisation CaSR est associée à une régulation à la baisse de l'expression de l'AQP2, éventuellement par le biais de la génération miR-137. Les miARN sont des modulateurs post-transcriptionnels essentiels. Plusieurs miARN dépendants de la vasopressine ciblant l'expression de l'AQP2 ont également été décrits43. La transfection avec miR-32 et miR-137 a considérablement réduit le niveau d'expression d'AOP2 dans les cellules mpkCCDc14. Fait intéressant, OLE peut atténuer les signaux inflammatoires et exercer des effets protecteurs en modulant le niveau d'expression de plusieurs miARN". En particulier, dans les cellules de glioblastome multiforme, OLE a favorisé l'expression de différents miARN, y compris miR -13745 qui est impliqué dans la régulation à la baisse de la voie de signalisation Akt/mTOR 46. Il convient de noter que le traitement à l'oleuropéine empêche la signalisation Akt/mTOR par l'activation de CAMK et d'AMPK induites par le calcium. L'activation de CaSR avec NPS-R568 active l'AMPK et réduit l'activité de mTOR dans les cellules tubulaires proximales humaines3. Conformément à ces résultats, l'incubation avec OLE augmente le calcium cytosolique, régule à la baisse l'activité de la PKA et réduit la taille du kyste dans un modèle de culture cellulaire 3D48. Ensemble, ces résultats suggèrent que l'OLE peut être utile dans le traitement de troubles caractérisés par une dérégulation de la dynamique du calcium intracellulaire liée à la régulation à la baisse de la signalisation CaSR.

L'extrait de feuille d'olivier se compose de plusieurs composants bioactifs, notamment des polyphénols, des fibres et des minéraux49. À l'heure actuelle, il n'est pas clair si un composé ou une combinaison synergique de phytocomposés dans OLE peut être bénéfique pour moduler les réponses intracellulaires. L'extrait utilisé dans cette étude a été appliqué comme un éventuel additif alimentaire et il est donc important de définir l'impact physiologique de l'extrait lui-même en considérant que plusieurs phénols, dont l'hydroxytyrosol, peuvent être filtrés par le rein et récupérés dans l'urine50. D'autres études fourniront l'efficacité de composants spécifiques qui peuvent activement réguler la signalisation intracellulaire du calcium par le CaSR. Pour conclure, cette étude fournit la preuve que l'OLE peut être considéré comme un nouvel adjuvant potentiel utile pour atténuer les troubles caractérisés par une réduction de l'expression de CaSR ainsi que par la signalisation et l'affectation de la perméabilité rénale à l'eau.

matériaux et méthodes

Produits chimiques et anticorps.Tous les produits chimiques et antibiotiques ont été achetés chez Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). La calcéine-AM, le Fura-2-AM, les milieux de culture cellulaire, le sérum de veau fœtal (FBS) et les substrats chimioluminescents Super Signal West Pico ont été achetés auprès de Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). Aquaporine{ {2}}(AQP2) a été détecté à l'aide d'anticorps spécifiques (C-tail Ab) dirigés contre un peptide synthétique correspondant aux 15 derniers acides aminés C-terminaux de l'AQP2 humain. Les anticorps AQP2-pS256 ont été gracieusement offerts par le professeur Peter Deen. Des anticorps de chèvre secondaires couplés à la peroxydase de raifort anti-lapin ont été obtenus auprès de Merck (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). Un anticorps secondaire chèvre-anti-lapin couplé à Alexa-488 a été acheté auprès de Thermo Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Production d'extraits riches en composés phénoliques et caractérisation chimique.La production d'un extrait riche en composés phénoliques à partir de feuilles d'olivier a été réalisée comme indiqué dans Ranieri et al.35. Après broyage avec un mélangeur (Waring-Commercial, Torrington, CT, USA), de l'eau ddH2O a été ajoutée (rapport 1/20, w/y) puis soumise à des ultrasons (CEIA, Viciomaggio, Italie) trois fois , pendant 30 min à 35 ± 5 degrés à chaque fois. Enfin, les extraits ont été filtrés sur du papier filtre, lyophilisés et stockés à -20 degré C. Les extraits obtenus ont été filtrés avec des filtres en nylon de 0,45 μm (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) et utilisés pour la caractérisation chimique. La teneur totale en phénols, l'activité antioxydante et l'identification des composés phénoliques individuels ont été réalisées selon Difonzo et al. L'OLE a montré une teneur en polyphénols, déterminée par Folin-Ciocalteu, égale à 195 mg. équivalents d'acide gallique (GAE) et une activité antioxydante, déterminée par ABTS (2,2'-azino-bis(3-éthylbenzothiazoline-6-sel diammonium d'acide sulfonique), représentant 750 μmol TE (équivalents Trolox) g!.

Culture cellulaire et traitements.Des cellules MCD4 du canal collecteur cortical de souris, exprimant de manière stable l'AQP2 humaine et le V2R-Rluc chimère ont été utilisées comme modèle expérimental18. Les cellules ont été cultivées dans un mélange 1:1 de milieu d'Eagle modifié Dalbec-cos et de F-12 additionné de 5 % (y/y) de sérum bovin fœtal. 1 % (y/y)L-glutamine et 1 % de pénicilline/streptomycine, 5 μM dexaméthasone,400 ug/ml de G418 (pour la résistance à l'AQP2) et 1 ug/ml de puromycine (pour la résistance à V2R-Rluc) , dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO, à 37 degrés. Les cellules MCD4 ont été laissées dans des conditions basales (CTR) ou traitées à long terme avec OLE à 0,1 mg/ml O/N, dDAVP à 100 nM pendant 30 min, ou co-traitées avec OLE et dDAVP ou NPS2143 à 1 μM O/N .En variante, les cellules ont été exposées à 8-Br-AMPc à 500 μM pendant 45 min. Des expériences à court terme ont été réalisées avec OLE à 1 mg/ml pendant 5 min et NPS2143 à 10 μM pendant 15 min. Des expériences ont été réalisées 3-5 fois indépendantes en utilisant des cellules provenant de différents passages.

Modèle animal et traitements.Toutes les procédures ont été accomplies en accord avec les directives nationales danoises pour le soin et la manipulation des animaux de laboratoire et les directives publiées des National Institutes of Health. Les protocoles ont été approuvés par l'Institute of Clinical Medicine. Université d'Aarhus, conformément aux licences d'utilisation d'animaux de laboratoire délivrées par le ministère danois de la justice (numéro d'approbation 2015-15-0201-00658). Des études ont été réalisées sur des rats Wistar mâles adultes avec un poids de départ de 200-225 g. Les animaux ont été maintenus sur un régime alimentaire standard pour rongeurs (Altromin, Lage, Allemagne) et avaient un accès gratuit à l'eau du robinet. Au cours des expériences, les rats ont été logés par groupes de deux par cage, avec un cycle lumière-obscurité de 12h12, une température de 21 ± 2 degrés C et une humidité de 55 ± 2 %.

Cinq rats ont été traités avec une injection sous-cutanée de 1 ng de dDAVP (Sigma-Aldrich, Glostrup, Danemark) dans 200 ul de solution saline/animal, et cinq rats traités avec le véhicule ont servi de témoins. Après 30 minutes, les rats ont été tués et les reins ont été traités comme décrit ci-dessous.

Cellules et lysats IMCD.Les cellules ont été cultivées sur des boîtes de {{0}}mm et remises en suspension dans un tampon contenant 220 mannitol mM, 70 saccharose mM, 0.5 M EGTA pH 8,0 ,0,5 M EDTA pH 8,0,1 M Tris-HCl pH 7,4 dans le

présence de protéases (PMSF 1 mM, leupeptine 2 mg/ml et pepstatine A 2 mg/ml) et d'inhibiteurs de phosphatases (NaF 10 mM et orthovanadate de sodium 1 mM). Alternativement, des coupes de rein d'environ 0,5 mm ont été préparées et équilibrées pendant 10 min dans un tampon contenant 1,8 mM de NaCl, 16 mM d'Hepes, 17 mM de Na-Hepes, 14 mM de glucose, 3,2 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,8 mM de MgSO4 et 1,8 mM KH2PO4 (pH7,4). Les papilles rénales ont été hachées avec des ciseaux dans le même tampon en présence de protéases (1 mM PMSF, 2 mg/mlleupeptine et 2 mg/mlpepstatine A) et de phosphatases (10 mM NaF et 1 mM sodium orthovanadate). Après sonication (60 kHz pendant 5 s), les lysats ont été centrifugés à 12 000 x g pendant 10 min. Les surnageants ont été collectés et utilisés pour des études d'immunotransfert 8.

Microscopie confocale.Des études confocales ont été réalisées comme décrit précédemment1. En bref, les cellules ont été cultivées sur des inserts PET de culture cellulaire et traitées comme décrit ci-dessus. En variante, des coupes de rein obtenues à partir de rats témoins, OLE, dDAVP et OLE avec dDAVP ont été soumises à des expériences d'immunofluorescence comme décrit précédemment. Les images ont été obtenues avec un microscope confocal à fluorescence à balayage laser Leica TCS SP2 (Leica Microsystems, Heerbrugg, Suisse).

Électrophorèse sur gel et immunotransfert. Les protéines ont été séparées sur des gels de polyacrylamide sans tache à 12 % (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, États-Unis) dans des conditions réductrices comme décrit précédemment=5,52. En bref, des bandes de protéines ont été transférées sur des membranes Immobilon-P (Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne) et immunoblottées à l'aide d'anticorps anti-AQP2 (Pre-C-tail Ab) et anti-AQP2-pS256. Les signaux immunoréactifs ont été obtenus à l'aide de substrats chimioluminescents Super Signal West Pico avec le système Chemidoc (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Hercules, CA, USA). L'analyse de densitométrie a été réalisée à l'aide d'ImageLab (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) et analysée à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Test de perméabilité à l'eau.La perméabilité à l'eau osmotique a été mesurée comme décrit précédemment43. En bref, les cellules MCD4 ont été cultivées sur des lamelles de verre de 40- mm. Après les traitements, les cellules ont été chargées avec 10 μM de calcéine-AM perméable à la membrane pendant 45 min à 37 degrés, 5 % de CO, dans du DMEM/F -12. Les lamelles ont été montées dans une chambre de perfusion (FCS2 Closed Chamber System, BIOPTECHS, Butler, USA). Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un microscope inversé TE2000-S (microscope Nikon Eclipse, Tokyo, Japon) équipé pour les mesures de fluorescence unicellulaire. et l'analyse d'images. Les échantillons chargés de calcéine-AM ont été excités à 490 nm. Mesures de fluorescence, suite à des solutions isosmotiques (NaCl 140 mM. KCl 5 mM, MgCl 1 mM. CaCl 1 mM, Acide Hepes sulfonique 10 mM, Glucose 5 mM, pH 7,4) ou hyperosmotiques (solution isosmotique additionnée de mannitol 135 mM) . ont été réalisées à l'aide du logiciel Metafluor (Molecular Devices, MDS Analytical Technologies, Toronto, Canada). Les données de fluorescence dans le temps après la perfusion des cellules avec des solutions iso- et hyperosmotiques ont été enregistrées. L'évolution temporelle du rétrécissement cellulaire a été mesurée par la constante de temps (Ki, exprimée en 1/r, sec), un paramètre corrélé à la perméabilité à l'eau, obtenu en ajustant les données avec une fonction exponentielle analysée à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego , Californie, États-Unis).

Mesures de transfert d'énergie de résonance de fluorescence.Pour évaluer les modifications intracellulaires de l'AMPc, la technologie de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) a été appliquée. Pour les expériences FRET, les cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour le capteur H96 contenant le motif consensus de liaison à l'AMPc d'EPAC1 intégré entre la protéine fluorescente cyan (CFP) et cp173Venus-Venus comme indiqué précédemment32.33.54. Le plasmide codant pour la sonde H96 était un cadeau du Dr.K. Jalink. La visualisation des cellules exprimant l'ECFP et/ou l'EYFP et la détection du FRET ont été réalisées à l'aide d'un microscope TE2000-S inversé (microscope Nikon Eclipse, Tokyo, Japon). Chaque image a été corrigée et analysée comme indiqué précédemment55.

Mesures de calcium intracellulaire. Les mesures de calcium intracellulaire ont été effectuées comme indiqué précédemment56. En bref, les cellules MCD4 ont été chargées avec 4 μM Fura-2 AM pendant 15 min à 37 degrés dans DMEM/F-12. La solution de Ringer a été utilisée pour perfuser les cellules pendant l'expérience contenant du NaCl 140 mM, du KCl 5 mM, du MgCl 1 mM, de l'HEPES 10 mM, du glucose 5 mM, du CaCl 1,8 mM, pH 7,4. Dans les mesures de fluorescence, les lamelles avec des cellules surchargées ont été montées dans une chambre de perfusion (FCS2 Closed Chamber System. BIOPTECHS. Butler, USA). Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un microscope TE 2000- inversé (microscope Nikon Eclipse, Tokyo. Japon). Le rapport des intensités de fluorescence à 340 et 380 nm a été tracé et calculé en tant que changement de fluorescence. En particulier, la stimulation avec OLE（1 mg/ml） ou NPS2143 （10 μM） a été comparée dans le même type cellulaire à celles obtenues après stimulation avec une dose maximale de l'agoniste à médiation calcique ATP（100 μM） qui a été utilisé comme contrôle interne (100 pour cent).

Le taux de calcium intracellulaire a été mesuré à l'état d'équilibre et calibré comme décrit par Grynkiewicz57. OLE et NPS2143 ont été utilisés à long terme à 0.1 mg/ml et l uM, respectivement, et chaque échantillon a été calibré par l'ajout de 5 μM d'ionomycine en présence de 1 mM d'EGTA（Rm.） suivi de 5 Ionomycine μM dans CaCl 5 mM, (RMA).

Analyse PCR en temps réel des ARNm AQP2 et CaSR chez les rats témoins et traités.Des expériences de PCR en temps réel ont été réalisées pour mesurer l'expression relative de l'ARNm dans le canal collecteur médullaire interne (IMCD) isolé à partir de papilles rénales de rats témoins et traités. Des tranches de rein d'environ 0.5 mm ont été réalisées et équilibrées pendant 10 min dans un tampon contenant 118 mM de NaCl, 16 mM d'HEPES, 17 mM de Na-Hepes, 14 mM de glucose, 3,2 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,8 MgSO4 mM et KH2PO4 1,8 mM (pH 7,4). La papille rénale a été isolée au stéréomicroscope. Les échantillons de rats témoins et traités ont ensuite été hachés avec des ciseaux directement dans du Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). USA), conformément aux recommandations du fabricant (25 C pendant 10 min ; 42 C pendant 60 min ; 85 C pendant 5 min). L'amplification par PCR en temps réel a été réalisée en utilisant TagMan Fast Advanced Master Mix avec les tests CaSR, AOP2 et GAPDH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dans le système de PCR en temps réel StepOne (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA ), définissant les conditions de cyclage thermique telles que spécifiées par le fabricant (95 °C pendant 20 s ; 40 cycles en alternance à 95 °C pendant 1 s et 60 °C pendant 20 s). Les résultats ont été exprimés sous la forme 2- valeurs (quantification relative) avec △ACt=(Ct cible-Ct GAPDH) traité-(Ct cible-Ct GAPDH)Sham1.

évaluation des miARN-137 chez les rats témoins et traités.La teneur en miARN{{0}} dans le canal collecteur médullaire interne du rat témoin et traité a été évaluée à l'aide des dosages avancés de miARN TagMan (has-miR-137 ; ID de test ; 477904 mir ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA .U.A), qui a permis une notification hautement sensible et spécifique des miARN matures à l'aide de la PCR quantitative. Des tranches de rein d'environ 0,5 mm ont été réalisées et équilibrées pendant 10 min dans un tampon contenant 118 mM de NaCl, 16 mM d'HEPES, 17 mM de Na-Hepes, 14 mM de glucose, 3,2 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl2, 1,8 mM de MgSO4 et 1,8 mM KH2PO4(pH7.4). La papille rénale a été isolée au stéréomicroscope. Des échantillons de rats témoins et traités ont ensuite été hachés avec des ciseaux directement dans du Trizol (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour extraire l'ARN total. TaqMan Advanced miRNA cDNA Synthesis Kit （Catalogue n²∶A25576 ; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a été utilisé pour obtenir la synthèse d'ADNc, selon le protocole fourni par le fabricant (réaction de queue Poly (A) ; réaction de ligature ; réaction de transcription inverse ; réaction miR-Amp). L'ARN synthétique (UUAUUGCUUAAGAUACGCGUAG) avec 59- phosphore a été synthétisé par Thermo Fisher Scientific et utilisé pour effectuer une courbe d'étalonnage afin d'interpoler les valeurs des échantillons de miARN et d'obtenir une évaluation précise (en nanogrammes) de la teneur en miR -137 dans samples16, en utilisant GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).

Analyses statistiques.Toutes les valeurs sont rapportées sous forme de moyennes ± SEM L'analyse statistique a été effectuée par ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test de comparaisons multiples de Newman-Keuls avec * p<0.05 considered="" statistically="" different="">

Déclarations, approbation éthique et consentement à participer.Les études animales ont été réalisées en accord avec les directives nationales danoises pour le soin et la manipulation des animaux de laboratoire et les directives publiées des National Institutes of Health. Le comité d'éthique des soins aux animaux de l'Institut de médecine clinique de l'Université d'Aarhus a approuvé les protocoles d'étude, conformément aux licences d'utilisation d'animaux de laboratoire délivrées par le ministère danois de la Justice (numéro d'approbation 2015-15-0201-00658). Les auteurs confirment que toutes les méthodes ont été réalisées conformément aux directives et réglementations en vigueur. De plus, les auteurs confirment que l'étude a été réalisée conformément aux directives ARRIVE.

Références

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