Partie 1 : Polarisation de la microglie M1 réprimée par les actéosides via la voie de signalisation NF-κB inhibée et la récupération de la fonction mitochondriale médiée par l'AMPK

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Résumé:

Arrière plan:La maladie d'Alzheimer (MA)est le type de démence le plus fréquent. Alors queactéoside de l'herbe cistanche(ACT), un composé isolé de Cistanchetubuleux, possède des propriétés neuroprotectrices. Cependant, le mécanisme sous-jacent dans la régulation de la polarisation de la microglie reste mal défini.Méthodes :Ici, le modèle de MA induit par AlCl3- chez les larves de zèbres a été appliqué pour découvrir l'efficacité thérapeutique de l'ACT. Des cellules BV-2 ont été utilisées pour démontrer le rôle de l'ACT sur la polarisation de la microglie. Séquence d'ARN, HPLC-Q-TOF-MS, western blot et docking moléculaire ont été combinés pour con¦rmer son mécanisme.Résultats:L'ACT a significativement amélioré la dyskinésie expérimentale et les troubles du système nerveux chez le zèbre. Par la suite, il a supprimé la polarisation M1 et promu le phénotype M2 dans les cellules BV -2 induites par le LPS. Nous avons d'abord démontré que l'ACT exerçait un impact transcriptomique profond, qui impliquait la régulation des voies de signalisation clés dans l'inflammation, la biosynthèse de l'arginine, ainsi que la biosynthèse du pantothénate et du CoA, en corrélation avec la fonction des mitochondries. LOI(actéoside de l'herbe cistanche) le traitement a réduit la polarisation de la microglie M1 en inhibant la voie de signalisation NF-κB. Et les voies métaboliques ont été confirmées par HPLC-Q-TOF-MS. De plus, l'ACT a corrigé les ROS excessifs pour restaurer la fonction des mitochondries grâce à la régulation à la hausse de la PGC-1 et de l'UCP-2 médiée par l'AMPK, conformément aux changements métaboliques. Curieusement, l'ACT peut se lier directement à la fois au NF-κB et à l'AMPK, comme en témoigne l'amarrage moléculaire.Conclusion :La recherche a fourni un mécanisme infusif de l'ACT et a illustré une nouvelle perspective basée sur le dysfonctionnement mitochondrial pour révéler le lien entre le métabolisme et la polarisation de la microglie.

Arrière plan:

Alzheimerla maladie(MA) est une maladie neurodégénérative courante accompagnée de troubles cognitifs et de dyskinésie[1]. Elle se caractérise par une perte neuronale sévère, des plaques séniles et des enchevêtrements neurobrillaires[2]. La pathogenèse de la MA est multidimensionnelle et liée à la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est entraînée par l'activation des cellules gliales, étroitement liée au développement de la MA [3, 4]. Au cours de la progression et de l'exacerbation de la neuro-inflammation, la microglie est considérée comme le facteur clé. Les microglies sont les principales cellules immunitaires du système nerveux central. Il est étroitement associé à une cascade de processus, contenant le développement du cerveau, maintenant un environnement neutre, ainsi que répondant aux blessures et à la réparation[1]. De plus, la microglie peut être stimulée vers un phénotype M1 et l'expression de cytokines pro-inflammatoires est augmentée lorsque des maladies liées à la neuro-inflammation telles que la MA surviennent [5]. Des études démontrent également que la polarisation vers le phénotype M1 s'accompagne souvent de troubles métaboliques[6], provoquant un déséquilibre du métabolisme énergétique et un dysfonctionnement mitochondrial[7]. Ces changements indésirables sont dérivés de la neurodégénérescence, voire de la MA.

actéoside de l'herbe cistanche(ACT), un glycoside phényléthanoïde, est principalement dérivé de Cistanchetubuleux. De plus en plus de preuves suggèrent que l'ACT possède de nombreuses activités pharmacologiques, notamment des effets neuroprotecteurs[8], anti-inflammatoires[9] et antioxydants[10]. En particulier, il a été rapporté que l'ACT améliore l'apprentissage et les troubles de la mémoire ainsi que la régulation positive du métabolisme énergétique chez les rats induits par la streptozotocine [11]. Il a également été suggéré d'inhiber la mort cellulaire apoptotique neuronale et les dommages mitochondriaux chez les souris expérimentales d'encéphalomyélite auto-immune [12]. Cependant, moins d'études se sont concentrées sur l'effet de l'ACT sur la polarisation de la microglie M1/M2. En particulier, divers mécanismes, tels que la réparation de la fonction des mitochondries et la régulation du métabolisme cellulaire, n'ont pas été réalisés. De plus, le mécanisme de l'ACT qui a contribué à la polarisation de la microglie M1/M2 est resté inexploré.

Le présent rapport visait à étudier l'efficacité thérapeutique de l'ACT ainsi que le mécanisme moléculaire sous-jacent de l'ACT dans la MA. Ici, l'ACT a montré un effet de neuroprotection significatif chez les larves de zèbre AD induites par AlCl3-. De plus, ACT inhibe efficacement la polarisation M1 et favorise le phénotype M2 dans les cellules BV -2 induites par le LPS. Séquençage d'ARN (ARN-Seq) intégré à la méthode métabolomique pour mieux comprendre le mécanisme sous-jacent de l'ACT dans la régulation de la polarisation de la microglie. L'interaction entre le métabolisme et la polarisation de la microglie en termes de fonction mitochondriale a été étudiée. Cette étude apportera un nouveau respect pour la poursuite des recherches sur l'ACT en tant qu'agent thérapeutique potentiel pour le traitement de la MA.

Méthodes :

Regroupement d'animaux et de modèles :

Des zèbres de type sauvage (souche AB, 4 mois) ont été choisis dans cette étude (Nanjing Qi Wu Biotechnology Co., Ltd.). Ils ont été maintenus sous un cycle lumière/obscurité de 14/10 h à 28 degrés, selon la méthode précédente [13]. Des engrais naturels et des embryons normalement développés ont été générés et cultivés jusqu'à 3 jours après la fécondation (dpf) dans un incubateur à illumination. Toutes les expériences sur les zèbres ont été réalisées sous la supervision du Comité d'éthique animale de l'Université pharmaceutique de Chine.

Les larves de zèbre ont été divisées en six groupes et traitées de 3 dpf à 7 dpf : groupe témoin, groupe modèle, groupe modèle plus chlorhydrate de donépézil (DPZ), groupe modèle plus ACT. Le groupe témoin a été maintenu dans le milieu avec 0.2% de DMSO et le groupe modèle a été traité avec 150 μM d'AlCl3 (pH 5,8). Le groupe modèle plus DPZ a été co-traité avec AlCl3 et 8 μM de DPZ. Le modèle plus les groupes ACT ont été co-traités avec AlCl3 et différentes concentrations d'ACT (200, 100, 50 μM). LOI(actéoside de l'herbe cistanche)(pureté HPLC supérieure ou égale à 98 %) a été obtenue auprès de Baoji Herbest Bio-Tech Co., Ltd. (Baoji, Chine). AlCl3·6H2O et DPZ ont été achetés auprès de Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD. (Shangai, Chine).

Analyse comportementale

Les mouvements des larves de zèbres ont été enregistrés avec un analyseur comportemental ViewPoint (Zebralab 2018, ViewPoint Life Sciences Co., Ltd.) à 28 degrés. Brièvement, les paramètres comportementaux et le traitement des résultats étaient cohérents avec la méthode que nous avons établie précédemment [13]. Ici, la vitesse moyenne (AS), le changement de vitesse (ΔS), le taux de récupération de la dyskinésie (DRR) et l'efficacité de la réponse (RE, pourcentage) ont été sélectionnés pour évaluer la récupération de la dyskinésie chez le zèbre.

Après un traitement de 3 dpf à 7 dpf, des larves de zebra¦sh ont été collectées pour mesurer l'activité de l'AChE et de la ChAT. Sur la base du protocole du fabricant, l'activité a été détectée par les kits ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (MLBIO biotechnology Co. Ltd., Shanghai, Chine). Et les concentrations en protéines des différents échantillons ont été déterminées par la méthode BCA.

Les cellules BV-2 ont été ensemencées séparément dans un plat 6-puits (n=6/groupe). Après traitement, le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS froid. Puis immédiatement exposé à l'azote liquide pour supprimer le métabolisme des cellules. Les cellules ont été récoltées avec du méthanol froid à 80 % (1 ml/puits) et la suspension a été transférée dans un tube Eppendorf de 2 ml. Pour faciliter la précipitation des protéines, vigoureusement vortexé pendant 1 min et centrifugé à 13,000 tr/min pendant 15 min à 4 degrés. La suspension cellulaire a été transférée dans un nouveau tube Eppendorf de 2 ml et séchée sous un courant d'azote et stockée à -80 degré jusqu'à l'analyse. Le résidu séché a été reconstitué dans 150 μL d'acétonitrile à 25 % pré-refroidi. Afin d'assurer la stabilité et la précision de l'analyse de séquence, des volumes égaux (10 μL) de chaque échantillon cellulaire ont été combinés en tant qu'échantillons de contrôle qualité (CQ). Lors de la détection des métabolites, ces échantillons ont été injectés tous les six échantillons de cellules pour con¦rmer leur stabilité. Une aliquote de 1 μL a été injectée pour HPLC-Q-TOF-MS.

L'analyse HPLC-Q-TOF-MS a été réalisée sur le système HPLC Agilent 1290 connecté au spectromètre de masse Agilent 6530 Quadripôle Time-of-Flight (Q-TOF) (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis). La séparation a été réalisée sur une colonne ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 µm). La phase mobile était composée de 0,1 % d'acide formique-eau (v/v ; A) et d'acétonitrile (B).

Le débit a été fixé à {{0}},4 mL/min avec la condition d'élution par gradient optimal suivante : 0 à 2 min, 5 % de B ; 2 à 20 min, 5 % à 95 % B (mode ions positifs) ; 0 à 2 min, 5 % B ; 2 à 20 min, 5 % à 95 % B (mode ions négatifs). Les paramètres de fonctionnement du spectromètre de masse ont été définis comme suit : température du gaz, 320 degrés ; gaz de séchage, 10 L/min ; nébuliseur, 35 psi ; VCap, 4000 V; fragment, 120 V.

Les données brutes ont été exploitées sous MassHunter Workstation Software version B.07.00 (Agilent Technologies, Santa Clara, Californie, États-Unis). Les données brutes ont été prétraitées par la plateforme XCMS. L'analyse en composantes principales (ACP) et l'analyse discriminante des moindres carrés partiels (PLS-DA) des données normalisées ont été réalisées avec MetaboAnalyst (https://www.metaboanalyst.ca). Combiné à la littérature, les métabolites différentiels (VIP > 1, T-test P< 0.05)="" were="" identi¦ed="" on="" hmdb="" (https://hmdb.ca).="" finally,="" pathway="" analysis="" was="" conducted="" with="">