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I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* et Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1Institut supérieur de médecine neurale régénérative, Collège des sciences et technologies médicales, Université médicale de Taipei, Taipei 11031, Taïwan

2Institut de biologie moléculaire, Academia Sinica, Taipei 11529, Taïwan

3Institut de médecine clinique, Faculté de médecine, Université nationale Cheng Kung, Tainan 70403, Taïwan

4Centre de recherche en médecine clinique, Hôpital universitaire national Cheng Kung, Faculté de médecine, Université nationale Cheng Kung, Tainan 70403, Taïwan

5Département et Institut universitaire des sciences biomédicales, Faculté de médecine, Université Chang Gung, Taoyuan 33302, Taïwan

6Centre de recherche en neurosciences, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Taïwan

7Contact principal

*Correspondance : kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche peut améliorer la mémoire

SOMMAIRE

La variation phénotypique est une condition préalable fondamentale pour l'évolution des cellules et des organismes par la sélection naturelle. Alors que le rôle de l'expression génique stochastique dans la diversité phénotypique de cellules génétiquement identiques est bien étudié, on ne sait pas grand-chose sur la relation entre l'expression génique stochastique et la variation comportementale individuelle chez les animaux. Nous démontrons qu'un miARN spécifique (miR-466f-3p) est régulé positivement dans l'hippocampe d'une partie de souris consanguines individuelles lors d'une tâche de labyrinthe aquatique de Morris. De manière significative, miR- 466f-3p régule positivement la morphologie, la fonction et l'apprentissage spatial des neurones, etMémoirecapacités des souris. Mécaniquement, miR-466f-3p réprime la traduction de MEF2A, un régulateur négatif de l'apprentissage/Mémoire. Enfin, nous montrons qu'une régulation à la hausse variée de l'hippocampe miR-466f-3p résulte de la phosphorylation randomisée de l'AMP cyclique hippocampique (cAMP)-response element-binding (CREB) chez les individus. Cette constatation de la modulation de l'apprentissage spatial etMémoirevia un axe de signalisation hippocampique randomisé lors de la stimulation neuronale représente une démonstration de la façon dont la variation de l'expression des gènes tissulaires conduit à un comportement animal varié.

INTRODUCTION

La variation phénotypique entre les individus confère un avantage évolutif puisqu'elle fournit la diversité de la population sur laquelle agit la sélection naturelle (Pavlicev et al., 2011). Les antécédents génétiques et les facteurs environnementaux contribuent à générer une telle variation naturelle (Bendesky et Bargmann, 2011). Expérimentalement, des souris consanguines ont souvent été utilisées pour étudier la base moléculaire et cellulaire des phénotypes et comportements moyens afin de minimiser les effets des différences génétiques entre les individus testés (Casellas, 2011). Cependant, la variation de l'abondance des transcrits tissulaires a été montrée entre les souris isogéniques individuelles. Les gènes présentant des niveaux d'expression très variables sont souvent associés à la fonction immunitaire, aux réponses au stress et à la régulation hormonale, c'est-à-dire aux processus sensibles aux signaux environnementaux (Vedell et al., 2011). Certaines de ces études ont également montré que des différences dans l'expression des gènes ou la signalisation cellulaire, avec ou sans l'influence de facteurs environnementaux tels que le léchage maternel, l'apport de nutriments in utero ou la résilience induite par le stress par rapport à la susceptibilité (Bale, 2015 ; Danchin et al ., 2011 ; Lorsch

et al., 2019 ; Pedersen et al., 2011), peuvent entraîner des différences de phénotypes et de comportements (Casellas, 2011 ; Locke et al., 2015 ; Loos et al., 2015 ; Oey et al., 2015).

Apprentissage spatial etMémoireLa formation contrôlée par le cerveau peut être séparée en deux systèmes : (1) la navigation égocentrique utilisant des mouvements personnels et des signaux internes et (2) la navigation allocentrique impliquant principalement l'hippocampe et les structures cérébrales voisines qui est stimulée par des signaux distaux à l'extérieur des organismes (Ekstrom et al., 2014). La capacité d'apprentissage spatial etMémoirepermet à la plupart des espèces animales d'ajuster progressivement leurs comportements pour s'adapter à des environnements spatialement et temporellement variables, ce qui est essentiel à leur survie. Cela peut être évalué chez des animaux de laboratoire en appliquant des paradigmes comportementaux tels que le labyrinthe aquatique de Morris (MWM) (Vorhees et Williams, 2014). Notamment, il a été démontré que des rongeurs consanguins génétiquement identiques présentent une variation phénotypique dans l'apprentissage spatial etMémoire(Tsai et al., 2002), mais les mécanismes sous-jacents de cette variation comportementale restaient inconnus.

La formation de nouveaux souvenirs est un processus complexe nécessitant une transcription génique dépendante de l'activité, la synthèse de nouvelles protéines et

Figure 1. Corrélation entre la variation de l'apprentissage spatial etMémoirecapacité et induction miR-466f-3p

(A) Tâche MWM de souris C57BL/6J consanguines de type sauvage. Panneau de gauche : performances MWM des souris GLN (points) et des souris PLN (carrés). Sur un total de 289 souris testées, 180 ont été classées comme GLN et 109 comme PLN. Panneau de droite : test de la tâche MWM (n=47 et 30 dans chaque groupe). Les durées moyennes passées dans chacun des quatre quadrants et la région de la plate-forme sont comparées dans l'histogramme. P, place de la plate-forme manquante ; T, zone cible sans P ; R, zone droite ; O, zone opposée ; L, zone gauche. (B) Analyse RT-qPCR de l'expression des miARN. Les niveaux d'expression relatifs de six miARN situés dans le cluster miR-466-669 et miR-132-3p, en tant que contrôle positif enrichi en cerveau, ont été analysés et normalisés avec le contrôle interne U6 snRNA de l'hippocampe de souris GLN et PLN (n=9–18 par groupe). Je, miR-466f- 3p ; II, miR-466g ; III, miR-466i-3p ; IV, miR-467b-3p ; V, miR-467f ; VI, miR-669f ; VII, miR-132-3p.

un réseau neuronal spécifique finement réglé commeMémoireengrammes pour établir de nouvelles connexions neuronales et une plasticité soutenue (Asok et al., 2019). Les engrammes hippocampiques, qui sont des populations clairsemées de neurones dans le gyrus denté (DG), représentent des ensembles de neurones affichant une activité accrue aprèsMémoireformation. Alors que les neurones à engramme DG présentent un schéma d'expression génique très distinct (Rao-Ruiz et al., 2019), les mécanismes moléculaires spécifiques à l'engramme sous-jacentsMémoireconsolidation restent largement méconnues. Divers facteurs et voies de signalisation sont connus pour réguler positivement ou négativement l'apprentissage etMémoireprocessus ont été identifiés (Abraham et al., 2019 ; Humeau et Choquet, 2019). Parmi eux, la forme activée de la protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMP cyclique (AMPc) (CREB) stimule la transcription génique en réponse à l'augmentation dépendante de l'activité du Ca2 plus intracellulaire dans les neurones (Kandel, 2012). D'autre part, la voie camp/PKA réprime l'activité transcriptionnelle du facteur 2 de renforcement des myocytes (MEF2) en empêchant l'exportation nucléaire de son co-répresseur, HDAC5, et l'importation nucléaire du co-activateur NFAT (Belfield et al., 2006). De plus, contrairement au CREB, l'activité de MEF2A contraintMémoire(Cole et al., 2012). Outre les facteurs protéiques, les microARN (miARN) sont également impliqués dans la régulation des fonctions neuronales, dont l'apprentissage et la mémoire (McNeill et Van Vactor, 2012). Les miARN sont de petits ARN non codants (22 nt) qui agissent principalement comme régulateurs post-transcriptionnels de l'expression génique via un appariement de bases spécifique à la séquence avec leurs sites de reconnaissance dans les 30 régions non traduites (30 UTR) d'ARNm spécifiques (Daugaard et Hansen, 2017). Les miARN participent à une gamme de voies de signalisation dans les neurones post-mitotiques et interviennent dans les processus cellulaires dépendants de l'activité, notamment la croissance et la ramification dendritiques, la formation de synapses et la maturation. En régulant l'expression des gènes, ils jouent également un rôle important dans les formes durables de plasticité synaptique qui sous-tendentMémoireformation, récupération et consolidation (Chen et Shen, 2013 ; Wang et al., 2012b).

Dans ce qui suit, nous présentons des preuves d'un lien de causalité entre l'expression stochastique des gènes tissulaires et la variation comportementale individuelle chez les animaux. En particulier, nous montrons que l'activation stochastique d'un axe hippocampique CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A module la variation individuelle de l'apprentissage spatial etMémoirecapacité chez les souris consanguines.

RÉSULTATS

Variation individuelle de l'apprentissage spatial etMémoirela capacité est corrélée avec l'induction de miR-466f-3p à partir d'un cluster de miARN spécifique

Identifier les miARN impliqués dans la régulation de l'apprentissage etMémoireformation, nous avons utilisé la tâche MWM pour distinguer les souris C57BL/6J consanguines de type sauvage avec une capacité d'apprentissage et de mémoire bonne ou mauvaise (figure 1A). Nous avons défini les souris qui ont terminé la tâche dans les 30 s lors de la dernière (6e) session comme « bons apprenants » (GLN), tandis que les souris qui n'ont pas pu trouver la plate-forme dans les 30 s lors de la dernière session ont été considérées comme des « mauvais apprenants ». ' (PLN). Comme le montre la figure 1A (panneau de gauche), 62 % des souris appartenaient au groupe GLN (180 souris sur 289), présentant une réduction marquée de la latence d'échappement de 98,1 s (1ère session) à 21,8 s (6ème session). En revanche, la latence d'échappement des 38 % de souris restantes, le groupe PLN (109 souris sur 289), n'a été que modérément réduite entre les première et sixième sessions (de 111,8 s lors de la 1ère session à 82,1 s lors de la 6ème session). . Le test de sonde, indiquant que les souris avaient effectivement appris la tâche au cours des six sessions, a également montré que les souris GLN sont restées plus longtemps dans la région de la plate-forme que les souris PLN (figure 1A, paire de barres de gauche dans le panneau de droite).

Ensuite, nous avons analysé les ARN de l'hippocampe de souris GLN et PLN par hybridation de microréseaux de miARN (n=4 chaque groupe). En général, nous avons observé des différences relativement mineures dans les profils d'expression des miARN de l'hippocampe chez les souris GLN et PLN. Cependant, nous avons noté que les 10 principaux miARN pour lesquels les niveaux d'expression étaient plus élevés chez les souris GLN que chez les souris PLN (données non présentées) étaient tous dérivés du même cluster de miARN spécifique aux rongeurs, miR-466-669, situé dans l'intron 10 de le gène mSfmbt2 (voir ci-dessous). Sur la base de l'analyse de la réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT-qPCR) des niveaux d'expression des miARN sélectionnés dans le cluster, nous avons choisi miR-466f-3p pour une enquête plus approfondie (Figure 1B). L'expression moyenne de ce miARN était 1,5- fois plus élevée dans l'hippocampe des souris GLN par rapport aux souris PLN. Notamment, les niveaux moyens de miR -466 f -3 p de l'hippocampe étaient similaires entre le groupe PLN, le groupe témoin de la cage à domicile (HC) et le groupe témoin de natation (Figure 1C), excluant ainsi les effets liés à l'exercice pendant nageant et soutenant davantage l'idée que miR-466f-3p a été induit pendant l'apprentissage spatial etMémoireformation.

Dans la figure 1C, les données révèlent que les niveaux d'expression de l'hippocampe miR-466f-3p de plus de 42 % des souris GLN étaient au moins 1,5- fois plus élevés que le niveau d'expression moyen de souris témoins HC, alors que les niveaux chez 15 pour cent des souris PLN étaient la moitié de ceux des souris HC. Environ 25 % des souris GLN et 55 % des souris PLN avaient des niveaux similaires de miR-466f{{10}}p (0,8- à 1,2- pli par rapport à HC). Le diagramme de dispersion de la corrélation de Pearson montrant une corrélation positive entre les niveaux miR-466f-3p et la durée en pourcentage sur la plate-forme pendant le test de sonde est présenté à la figure 1D. Nous avons également effectué l'hybridation in situ (ISH) de miR-466f-3p et U6 petit ARN nucléaire (ARNsn) des tranches de cerveau chez les souris GLN et PLN (figure 1E). L'analyse statistique des signaux miR- 466f-3p via ISH a confirmé que l'induction de miR-466f- 3p était en effet plus élevée dans le DG des souris GLN par rapport à celui des

Souris PLN, alors qu'aucune différence n'a été trouvée lorsque les signaux d'ARNsn U6 ont été comparés (histogramme de droite, figure 1E). Bien que les signaux miR-466-3p n'étaient pas égaux parmi les cellules granulaires individuelles dans DG, ils augmentaient toujours de manière significative et omniprésente dans l'hippocampe des souris GLN par rapport aux souris PLN. Par conséquent, l'induction miR-466f-3p ne s'est pas produite uniquement dans une petite partie des cellules, par exemple les neurones engrammes. Ces données indiquent que la régulation à la hausse de miR-466f-3p pendant la tâche MWM est étroitement associée à un meilleur apprentissage spatial etMémoirechez une proportion significative de souris GLN.

Nous avons également analysé les niveaux d'expression moyens de plusieurs miARN spécifiques du cerveau par RT-qPCR. Parmi eux, miR-132-3p a été régulé positivement dans l'hippocampe de souris après la tâche MWM, mais nous n'avons pas observé de différences significatives entre les groupes GLN et PLN (paire de barres VII, figure 1B). Les niveaux d'expression de miR-335-5p et miR-22 étaient similaires parmi les groupes GLN, PLN et HC (Figure S1A). Ainsi, contrairement à miR-466f-3p, l'expression hippocampique de ces miARN lors de l'entraînement MWM n'est pas corrélée à l'apprentissage spatial etMémoirecapacité des souris.

La régulation à la hausse de miR-466f-3p favorise la croissance des neurites et la formation d'épines dendritiques

Pour confirmer que miR-466f-3p était bien exprimé dans les neurones, nous avons effectué un miARN ISH combiné à une coloration par immunofluorescence (IF) de NeuN et MAP2 dans les neurones primaires de l'hippocampe. Les résultats ont montré que, comme d'autres miARN (Cohen et al., 2011 ; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p était principalement exprimé dans la région du soma neuronal, avec quelques signaux supplémentaires dans les dendrites (Figure S2A). Comprendre les bases moléculaires et cellulaires de l'association de miR-466f-3p régulé positivement avec l'apprentissage etMémoireformation, nous avons d'abord surexprimé de manière transitoire miR-466f-3p avec un polypeptide de fusion dsRed sous le contrôle du promoteur de l'ubiquitine du pFUGW- miR-466f-3p- Plasmide dsRed dans les neurones hippocampiques primaires DIV10 (Figure S2B). Grâce à miRNA ISH, nous avons confirmé que le signal miR-466f-3p est plus fort dans le groupe de surexpression de miR-466f-3p par rapport au contrôle vectoriel ou miR mutant{{ 12}}f-3p groupe (flèches, Figure S2B). En parallèle, nous avons également établi une plate-forme pour examiner l'effet de la perte de fonction miR-466f-3p par inhibition miR-466f-3p à l'aide d'une éponge miR située dans le 30 UTR de l'ARNm de l'EGFP exprimé à partir du plasmide pFUGW-miR-sponge-EGFP (Figure S2C). Le rapporteur EGFP dans le plasmide éponge a servi à la fois d'indicateur de l'efficacité de la transfection et de capteur de l'activité cellulaire des miARN (Kluiver et al., 2012). Dans une partie importante des cellules HEK293T transfectées, le signal EGFP a diminué lors de la co-expression avec miR-466f-3p de type sauvage, mais pas avec miR-466f{{32 }}p, en raison de l'inhibition de la traduction de l'ARNm de l'EGFP par la liaison de miR-466f-3p à l'éponge miR dans le 30 UTR (comparer les quatre images de gauche et deux programmes his, Figure S2C) . En revanche, nous n'avons pas observé de diminution du signal EGFP lors de la co-expression de l'éponge témoin codant pour huit copies d'une séquence brouillée du plasmide pFUGW-SCR-éponge-EGFP avec miR-466f-3p ou son mutant (comparer les quatre images de droite et les deux histogrammes).

Comme le montre la figure 2A, l'expression ectopique de miR-466f-3p a entraîné des changements morphologiques des neurones, notamment une croissance accrue des neurites par rapport aux neurones témoins transfectés avec le vecteur pFUGW- exprimant dsRed dsRed ou mutant miR-466f-3plasmide exprimant p pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Les données de quantification ont montré que le nombre moyen de branches dendritiques par neurone n'était pas significativement différent entre le groupe surexprimant miR-466f-3p-surexprimant (barre II) et le contrôle vecteur ou mutant (barres I et III) (à droite histogramme supérieur, figure 2A). Cependant, la longueur moyenne totale des dendrites et la longueur moyenne des dendrites primaires ont augmenté lors de la surexpression de miR-466f-3p (comparer la barre II aux barres I et III, histogramme inférieur droit de la figure 2A). En parallèle, nous avons inhibé miR-466f-3p endogène à l'aide d'une éponge miR. Comme on le voit, il n'y avait pas de différence significative dans le nombre de branches dendritiques entre miR-466f-3p-inhibition et les groupes témoins (comparer la barre IV aux barres I et V, histogramme supérieur droit, figure 2A) , mais le groupe miR-466f-3p-inhibition a affiché une réduction notable de la longueur totale moyenne des dendrites ainsi que des longueurs moyennes des dendrites primaires et secondaires par rapport aux autres groupes (comparer la barre IV aux barres I et V, histogramme inférieur droit de la figure 2A). En outre, la coloration IF a démontré que la surexpression de miR- 466f-3p, mais pas l'inhibition, augmentait également la densité des épines dendritiques (figure 2B, panneaux supérieurs et histogramme inférieur gauche). Nous avons également effectué une co-coloration pour la protéine de densité postsynaptique 95 (PSD -95) et compté la densité des épines dendritiques colocalisées pour établir le nombre exact de synapses excitatrices (Figure 2B, histogramme en bas à droite), ce qui a révélé que miR {{40 La surexpression de }}f-3p a augmenté la densité des épines positives PSD-95-par rapport aux autres groupes témoins. Cependant, l'inhibition de miR-466f-3p n'a pas modifié de manière significative la densité des épines positives PSD-95- par rapport à celle des groupes témoins (Figure 2B, histogramme en bas à droite). Ensemble, ces données indiquent qu'en l'absence de stimulation neuronale, l'inhibition de miR-466f-3p seule n'affecte pas les densités des synapses excitatrices ou des épines dendritiques totales.