Pingping Zou

Pingping Zoua,†, Yuelin Songb,†, Wei Leia, Jun Lib, Pengfei Tua,b,

Yong Jiang,⁎

acétate Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, Chine

Reçu le 17 mai 2017 ; révisé le 20 juin 2017 ; accepté le 17 juillet 2017

Résumé: Cistanche désertique(CD) est l'une des deux plantes sources faisant autorité deCistanches Herba, une plante médicinale bien connue. Ici, la spectroscopie RMN 1H a été utilisée pour caractériser le profil chimique et distinguer les différentes parties, ainsi que pour proposer un nouveau flux de travail de traitement pour le CD. L'attribution du signal a été réalisée par de multiples techniques spectroscopiques RMN unidimensionnelles et bidimensionnelles en combinaison avec des bases de données disponibles et des composés authentiques. Les parties supérieures de la plante ont été distinguées des parties inférieures en combinant l'ensemble de données spectroscopiques RMN 1H avec une analyse statistique multivariée. Une nouvelle méthode de traitement qui associe la cuisson à la vapeur à la lyophilisation s'est avérée supérieure à la cuisson à la vapeur couplée au séchage au four ou à la lyophilisation directe via une caractérisation métabolomique holistique basée sur la RMN 1H. Glycosides phényléthanoïdes, principalement échinacoside etactéoside, ont été éliminés et confirmés comme les marqueurs chimiques responsables de la supériorité du nouveau flux de travail de traitement, tandis que les métabolites primaires en série, en particulier les glucides et les métabolites du cycle de l'acide tricarboxylique, ont été trouvés comme les molécules primaires régissant la discrimination entre les parties supérieure et inférieure de la plante. Collectivement, la spectroscopie RMN 1H s'est avérée être un outil analytique polyvalent pour caractériser le profil chimique et guider l'exploitation approfondie de CD en fournissant des informations qualitatives et quantitatives complètes.

MOTS CLÉS:Cistanchedésertique; métabolomique basée sur la RMN 1H ; flux de travail de traitement ; Différents composants;Glycoside de phényléthanoïde; Métabolites du cycle de l'acide tricarboxylique ;Échinacoside; Actéoside

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1. Introduction

Cistanches Herba(CH, nom chinois : Roucongrong), initialement archivé enLa matière médicale chinoise de Shen Nong, a été largement considérée comme l'une des plantes toniques et médicinales comestibles les plus connues, et honorée comme "Ginseng des déserts"^1,2. En tant que l'une des deux plantes sources officielles de CH,Cistanche désertique(CD, Orobanchaceae) est une plante holoparasite et principalement distribuée dans le nord et le nord-ouest de la Chine^2,3. Il a été largement utilisé pour les traitements de l'insuffisance rénale caractérisée par l'impuissance, les douleurs dans les reins et les genoux, la stérilité féminine et la constipation dans les pratiques médicales traditionnelles chinoises pendant des siècles.^3–5. Cependant, les sources sauvages de CD sont au bord de l'extinction ces dernières années en raison de la surexploitation, et elle a été répertoriée comme l'une des plantes de classe II nécessitant une protection en Chine.¹. De plus, le CD offre une contribution importante à la lutte contre le désert. Par conséquent, il est essentiel mais difficile d'utiliser plus efficacement ce matériau à base de plantes.

Des études scientifiques surCistancheusines créées dans les années 1980⁶. Les investigations phytochimiques ont révélé l'existence de divers types chimiques,e.g., glycosides phényléthanoïdes (PhG), iridoïdes, lignanes, acides gras, alditols et glucides, dans CD⁷. Parmi eux, les PhG sont les plus fréquemment mentionnés en raison de leur large spectre d'activités biologiques, y compris l'anti-oxydation, l'anti-âge, l'anti-fatigue, l'anti-inflammation, l'amélioration de l'immunité corporelle, l'amélioration de l'apprentissage et de la mémoire des souris atteintes de la maladie d'Alzheimer, etc.¹. Récemment, les PhG attirent de plus en plus l'attention en tant que nouveaux candidats-médicaments potentiels pour le traitement des maladies neurodégénératives. En particulier, un amalgame des PhG totaux trouvés dans le CH a été développé en tant que nouveau médicament, enregistré comme totalCistancheglycosidegélule (Memoregain^®) pour le traitement de la démence vasculaire⁸. L'échinacoside, le constituant le plus abondant et le plus efficace des PhG totaux, présente des effets anti-apoptotique sur les cellules neuronales SHSY5Y suite à l'apoptose induite par le TNF et inverse les déficits chez les souris atteintes de la maladie de Parkinson⁹. De plus, un autre composé actif primaire, l'actéoside (également connu sous le nom de verbascoside) est capable d'antagoniser l'apoptose dans les neurones¹⁰pour se défendre contre la neurotoxicité dans les cellules PC12 induite par le 1-méthyl-4-phénylpyridium ou le glutamate¹¹, et pour améliorer les déficits de mémoire induits par la scopolamine².

Semblable àCordycepsetGinseng, le CD a été largement consommé et apprécié comme aliment de santé. Les avantages réels et perçus du DC sont susceptibles de jouer un rôle déterminant pour le prix du médicament brut. Compte tenu du grand nombre de médicaments bruts de CD, les tranches sont plus populaires sur le marché. En général, l'inactivation enzymatique et la privation d'eau sont les deux étapes clés lors du traitement des tranches médicinales. Les méthodes de séchage conventionnelles du CD comprennent l'isolation, le séchage au four, le salage et le stockage en cave. Cependant, les produits issus de ces procédés souffrent généralement d'un mauvais aspect et d'une faible teneur en PhG, ce qui entrave l'application et la consommation à grande échelle de CD. En 2007, notre groupe a proposé une nouvelle technique de traitement des CD qui préservait considérablement le contenu de l'échinacoside etactéosideen tranches¹⁴. Cependant, étant donné que les produits de ce procédé souffrent toujours d'une apparence désagréable, nous décrivons actuellement une méthodologie de traitement pour améliorer l'apparence et préserver davantage le contenu de PhG dans les matériaux traités.

Des outils analytiques en série ont jusqu'à présent été appliqués pour l'analyse chimique des CD, y compris la chromatographie en couche mince, la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) couplée à divers détecteurs, tels que le détecteur à barrette de diodes (DAD), le détecteur à diffusion de lumière par évaporation (ELSD), détecteur de capture d'électrons (ECD) et spectromètre de masse en tandem (MS/MS). Les PhG, en particulier l'échinacoside et l'actéoside, ont été le plus fréquemment adoptés comme marqueurs de qualité¹. L'empreinte digitale de cette plante médicinale a également été développée en utilisant HPLC-DAD et HPLC-DAD-MS/MS^15,16. Néanmoins, il reste un défi d'évaluer la qualité du CD en raison de son profil chimique extrêmement complexe. D'une manière générale, les approches ciblant plusieurs analytes ne sont pas en mesure d'offrir une vision chimique holistique des extraits bruts, bien que de nombreuses informations qualitatives et quantitatives puissent être obtenues à partir de LC-MS/MS. De plus, les stratégies analytiques liées à la CLHP peuvent être limitées par de grandes quantités de solvants, une préparation fastidieuse des échantillons et/ou des procédures chronophages. Par conséquent, un nouvel outil analytique adapté à l'objectif, capable de fournir des informations complètes sur le pool de composés, est nécessaire pour une analyse chimique optimale. Heureusement,¹La spectroscopie RMN H a été démontrée comme un outil "tout en un" attrayant, capable d'offrir non seulement un ensemble de données qualitatives, mais également des informations quantitatives pour une large gamme de métabolites primaires et secondaires avec une préparation simple des échantillons et une acquisition rapide.^17–20. Jusqu'à présent, de larges applications de¹La spectroscopie RMN H a été lancée pour la détermination simultanée, le profilage chimique et la métabolomique de matrices complexes.

Bien que plusieurs recherches aient été menées sur ce précieux médicament à base de plantes, son profil chimique global est largement méconnu. Parce que CD est une plante parasite, les parties inférieures devraient être responsables de la transmission des substances nutritives, principalement des métabolites primaires, de l'hôte vers les parties supérieures, alors que le métabolisme énergétique vigoureux, comme la fleur, se produit généralement dans les parties supérieures. Par conséquent, il est raisonnable de supposer que des différences se produisent pour le métabolome de différentes parties. Par conséquent, dans la présente étude, nous visons 1) à caractériser de manière exhaustive le profil chimique de CD en utilisant¹Spectroscopie RMN H couplée à diverses mesures RMN bidimensionnelles (2D); 2) de clarifier les différences entre les parties supérieure et inférieure, et 3) de proposer un nouveau workflow de traitement à travers¹Etude métabolomique basée sur la RMN H. Les résultats obtenus devraient fournir des lignes directrices solides pour une meilleure exploitation de cette herbe médicinale, en particulier pour l'emploi de différentes parties et techniques de traitement.

2.expérimental

2.1. Matières végétales

Douze lots de matériaux frais (CD1–CD12, tableau S1, informations supplémentaires) ont été collectés dans les régions autonomes de Mongolie intérieure, du Xinjiang et du Ningxia en Chine. Les origines botaniques de toutes les matières brutes ont été authentifiées comme

Métabolomique basée sur la RMN 1H deCistanche désertique 649C. deserticolapar l'un des auteurs, le professeur Pengfei Tu. Tous les spécimens de référence sont déposés à l'herbier du Centre de recherche moderne pour la médecine traditionnelle chinoise, Université de Pékin (Pékin, Chine).

2.2. Produits chimiques et réactifs

Méthanol-d4 (CD3OD, abondance de deutérium, 99,8 % atomique D), eau deutérée (D2O, abondance de deutérium, 99,8 % atomique D) et sodium 3-triméthylsilyl [2,2,3,3-d4 ] propionate (TSP-d4) ont été obtenus auprès de Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, USA). Le méthanol de qualité analytique a été acheté auprès de Beijing Chemical Works (Pékin, Chine).

Les composés authentiques, y compris l'échinacoside, l'actéoside et le mannitol, ont été purifiés à partir de CD dans notre laboratoire auparavant14, et le saccharose, le -galactose et le -glucose ont été fournis par Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Les puretés de toutes les références ont été déterminées à plus de 98 % par des analyses HPLC–UV et RMN 1H.

2.3. La préparation des échantillons

Tous les matériaux bruts (CD1-CD11) à l'exception de CD12 ont été coupés dans les parties supérieures (GU) et les parties inférieures (GD) au milieu des tiges entières, et toutes les parties ont été coupées en fines tranches (environ 6- mm -épais chacun). Par la suite, toutes les tranches de CD1 – CD12 ont été successivement cuites à la vapeur pendant 10 min et séchées au four à 6{{40}} degré pendant 48 h pour donner des échantillons de type a. Deux autres méthodes de traitement, y compris la lyophilisation directe et la cuisson à la vapeur 10-min suivie d'une lyophilisation séquentielle, ont été appliquées pour certains échantillons sélectionnés, y compris CD1-GU, CD4-GU, CD4-GD, CD11-GD et CD12, pour permettre deux ensembles supplémentaires d'échantillons traités (échantillons de type b et c). Les descriptions détaillées de tous les échantillons sont illustrées dans le tableau S1. Avant l'extraction, toutes les tranches traitées ont été broyées en poudres avec un broyeur à échantillons (modèle YF102, Ruian Yongli Pharmacy Machinery, Chine) et tamisées à travers un tamis de 80 mesh. Les matières végétales pulvérisées ont ensuite été pesées avec précision (environ 200 mg pour chacune) et extraites avec 50- fois de méthanol aqueux à 50 % (p/v) dans un bain-marie à ultrasons (25 degrés) pendant 40 min. Ensuite, 50% de méthanol aqueux a été ajouté pour compenser la perte de poids lors de l'extraction. Chaque extrait a été centrifugé à 10,000×g à 10 degrés pendant 10 min et filtré à travers une membrane de 0,22 μm. Des aliquotes (2 ml) du surnageant ont ensuite été évaporées et encore séchées en utilisant un séchage sous vide à 30 degrés pendant 30 min. Les résidus séchés de chaque échantillon ont été reconstitués à l'aide d'un mélange de 0,5 ml (1:1, v/v) de CD3OD et de tampon phosphate dans du D2O contenant 0,05 % de TSP-d4 (pH 7,4), puis la solution a été transférée dans un tube de 5 mm (id) Tube RMN (Norell ST500-7) pour les dosages RMN. Chaque échantillon a été analysé en triple exemplaire.

2.4. Mesures RMN

Tous les spectres RMN 1H, RMN 13C et RMN 2D ont été enregistrés sur un spectromètre Varian Unity Plus 500 MHz (Varian Inc., Palo Alto, CA, USA) à une fréquence proton de 499,91 MHz équipé d'un Cryosonde TCI et système de gradient Z. Des paramètres identiques ont été appliqués aux extraits et aux composés de référence pour obtenir des spectres comparables. Pour les mesures RMN 1H, 256 scans ont été acquis avec les paramètres suivants : largeur de spectre, 8012,6 Hz (16 ppm) ; largeur d'impulsion, 11,05 μs (angle de retournement 90 degrés) ; temps d'acquisition, 2,04 s ; délai de relaxation (d1), 2 s ; et température, 298 K. CD3OD a été utilisé pour verrouiller la fréquence de champ, et les déplacements chimiques de tous les spectres ont été alignés en utilisant le signal de TSP-d4 à δ 0.00. Une procédure humide a été adoptée pour supprimer l'intensité du signal H2O qui résidait autour de δ 3,3021. Une fonction exponentielle avec un facteur d'élargissement de ligne (LB) de 0,3 Hz a été appliquée et les données ont été remplies de zéros pour donner au moins cinq points de données au-dessus de la demi-largeur pour chaque résonance afin de garantir une intégration précise et fiable. Les signaux de désintégration par induction libre (FID) ont été transformés par Fourier (FT) et tous les spectres ont été mis en phase manuellement et corrigés à l'aide d'un programme de base polynomial automatisé.

Pour faciliter la caractérisation chimique et l'attribution des signaux,

RMN 13C et diverses analyses RMN 2D, telles que 1H-1H

la spectroscopie de corrélation (1H-1H COSY), la spectroscopie de cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC) et la spectroscopie de corrélation de liaisons multiples hétéronucléaires (HMBC) ont également été acquises pour un échantillon représentatif (CD1-GUI) à l'aide de ces programmes par défaut. La largeur spectrale pour COSY était δ 0.5–10.0 dans les deux dimensions et des incréments de 128t1 pour chaque t1. Seize transitoires utilisant un délai de relaxation de 1,00 s ont été ajoutés avec 822 données complexes.

Les constantes optimales de couplage hétéronucléaire à une liaison et à liaison n pour HSQC et HMBC étaient de 146 et 8 Hz, respectivement. Les plages ont été définies comme –0.5–10.0 ppm dans la dimension F2 et 0–200 ppm dans la dimension F1, respectivement.

2.5. Analyse statistique multivariée de l'ensemble de données spectroscopiques RMN

Les spectres RMN 1H ont été traités à l'aide du logiciel MestReNova (version 5.2.5, Mestrelab Research, Saint Jacques de Compostelle, Espagne). Chaque spectre a été mis à l'échelle de l'intensité totale et réduit à des régions intégrées de largeur égale (0.02 ppm) parmi la région de δ 0,50–9,50 après exclusion des régions de δ 4,70–

5.02 et δ 3,26–3,36 pour omettre les signaux résiduels de l'eau et du méthanol, respectivement. L'analyse en composantes principales (ACP) avec échelle de Pareto (Par) ainsi que l'analyse discriminante orthogonale des moindres carrés partiels (OPLS-DA) avec échelle de variance unitaire (UV) ont été réalisées avec le logiciel SIMCA-P 12.0 (Umetrics, Umeå, Suède).

2.6. Détermination simultanée de l'échinacoside et de l'actéoside par HPLC-UV

Pour valider les résultats des trois techniques de traitement, un système HPLC série Agilent 1260 composé d'un dégazeur, d'une pompe quaternaire, d'un échantillonneur automatique, d'un four à colonne et d'un détecteur à barrette de diodes (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, USA) ont été utilisés pour la détermination simultanée de l'échinacoside et de l'actéoside dans tous les échantillons de type a, b et c. Une colonne Agilent Zorbax SB-C18 (250 mm x 4,6 mm, granulométrie 5 μm, Agilent Technologies) protégée par la colonne de garde correspondante (10 mm x 4,6 mm, granulométrie 5 μm) a été choisie pour réaliser les séparations chromatographiques. Le protocole de préparation des échantillons, la phase mobile et le programme d'élution ont suivi les descriptions archivées dans la pharmacopée chinoise (édition 2010)3 avec des modifications mineures. En bref, l'extraction assistée par ultrasons a été réalisée pendant 30 min en utilisant 50 % de méthanol aqueux ; Une solution aqueuse à 30 % de méthanol a été adoptée comme phase mobile pour l'élution isocratique à un débit de 1,0 mL/min, et le four à colonne a été maintenu à

30 degrés. La longueur d'onde de détection a été fixée à 330 nm et le volume d'injection a été fixé à 10 μL.

3. Résultats et discussion

3.1. Optimisation des paramètres d'extraction et spectroscopiques

Pour obtenir des spectres RMN 1H de haute qualité pour tous les échantillons, divers paramètres ont été soigneusement optimisés à l'aide d'un échantillon représentatif (CD1-GUI). Premièrement, le solvant d'extraction a été sélectionné parmi 30 % de méthanol aqueux, 50 % de méthanol aqueux et du méthanol. Les résultats ont indiqué qu'une réponse globale plus importante était obtenue avec 50 % de méthanol aqueux par rapport aux deux autres, ce qui correspond bien au protocole d'extraction authentifié dans la pharmacopée chinoise (édition 2015)3. L'extraction assistée par ultrasons a été choisie en raison de son fonctionnement pratique à des rendements comparables à ceux de l'extraction à reflux chaud et de l'extraction Soxhlet (données non présentées). Par la suite, la durée assistée par ultrasons a été comparée entre 40 et 60 min, et le bain d'eau ultrasonique de 60 min n'a pas montré une plus grande puissance d'extraction que 40 min ; par conséquent, 40 minutes ont été fixées pour l'appareil à ultrasons pour gagner du temps.

D'autre part, {{0}}.5 mL de tampon CD3OD–phosphate dans D2O (1:1, pH 7,4) a été comparé à 0.5 mL de CD3OD–D2O (1 : 1), et les résultats ont montré que la fortification avec un tampon phosphate pouvait empêcher la variation et la migration du profil spectral. Une aliquote de 2,0 ml de l'extrait a été successivement concentrée, reconstituée et soumise à une analyse RMN pour permettre une réponse appropriée pour la plupart des signaux. De plus, la méthode par voie humide s'est avérée meilleure qu'un programme de présaturation pour réduire l'intensité maximale de l'eau résiduelle (autour de δ 4,8) dans le spectre. Nous avons également constaté que l'incrémentation du nombre de balayage était bénéfique pour l'amélioration du rapport signal-bruit (S/N), ce qui était très utile pour la détection sensible (en particulier pour celles des composants de trace). Cependant, étant donné que cette approche était préjudiciable à une mesure rapide, 256 scans ont finalement été appliqués pour chaque analyse RMN 1H pour obtenir une sensibilité acceptable.

3.2. Affectation des signaux du spectre RMN 1H

L'identification des composants chimiques dans le CD a été réalisée en analysant conjointement les spectres RMN 1H, RMN 13C et RMN 2D (Fig. 1 et informations supplémentaires Fig. S1 à S10) et en comparant avec des échantillons de composés authentiques, ainsi qu'en se référant à bases de données, telles que MMCD . Les attributions plausibles des signaux en RMN 1H sont données à la Fig. 1. Les valeurs de déplacement chimique pour les identités putatives sont résumées dans le tableau S2 (informations supplémentaires).

Les caractéristiques structurales des PhG du genre Cistanche ont été décrites dans la littérature1. En raison de la grande similitude structurelle entre les PhG, par exemple, l'échinacoside par rapport à l'actéoside, les signaux de protons des fragments phényléthanoïdes se chevauchaient largement dans le spectre RMN 1H. Ce chevauchement a posé un problème analytique difficile pour discriminer de manière fiable entre ces signaux. Dans la présente étude, les signaux appartenant à l'échinacoside et à l'actéoside, qui sont les principaux ingrédients de la plante d'origine, ont été attribués sans ambiguïté à l'aide de composés de référence et de divers spectres RMN (tableau S2, fig. 1 et fig. S1 à S6). Le signal de diagnostic à δ 7,73 (d, J 16.0 Hz) indiquait la distribution de Castano-

côté B/D ou d'autres PhG à substitution féruloyle (Tableau S2 et Fig. 1)22. De plus, des PhG de type cis (PhG de type cis coumaroyl ou caffeoyl substitué) ont également été observés dans l'extrait sur la base de la présence de δ 6,95 (d, J 12.0 Hz) dans le spectre (Tableau S2 et Fig. . 1).

Plusieurs signaux évidents ont été détectés dans la région de δ 8.0–9.5. Les signaux à δ 9,15, 8,88 et 8,09 ont été provisoirement attribués au nicotinamide (Tableau S2 et Fig. 1) et à la RMN 13C ainsi qu'au 2D

Les spectres RMN (Fig. S4 à S6) ont également soutenu cette attribution. Le signal à δ 8,48 a été attribué de manière plausible à l'acide formique, tandis que les signaux à δ 8,13 et 8,11 ont été générés à partir de l'adénosine et de l'adénine, respectivement (tableau S2 et figure 1). Les signaux glucidiques sont généralement situés dans la région comprise entre δ 3.00 et 5.50. De toute évidence, le saccharose était le disaccharide le plus abondant dans CD, présentant des résonances significatives à δ 4. 0 4, 4, 18 et 5, 41 (tableau S2 et figures 1 et S7). Des signaux évidents appartenant aux protons anomères de -galactose, -glucose et -glucose ont résonné à δ 5, 24, 5, 2 0 et 4, 60, respectivement (tableau S2, figures 1 et S8, S9). La présence de mannitol a été révélée par l'observation du signal à δ 4.00 ainsi que par comparaison avec le composé de référence (tableau S2, figures 1 et S10). Le signal de diagnostic du 1-O-éthyl-glucoside a été observé à 1,16 ppm en se référant au HMDB. Acides aminés, dont leucine (0,93 ppm), isoleucine/valine (0,98 ppm), thréonine (1,27 ppm), alanine (1,49 ppm), lysine (1,71 ppm), glutamine (2,30 ppm), acide asparaginique (2,96 ppm), proline (4, 09 ppm), la tyrosine (7, 12 ppm) et la phénylalanine (7, 33 ppm) ont été provisoirement attribuées en comparant leurs comportements spectroscopiques diagnostiques respectifs avec ceux archivés dans HMDB (tableau S2 et figure 1). Les iridoïdes et les lignanes ont été mentionnés comme les homologues chimiques importants de la CD. Dans le spectre RMN 1H représentatif (Fig. 1), les signaux du syringaresinol (un dérivé de lignane) et de l'acide 8-épiloganique (un dérivé iridoïde) ont été observés à δ 7, 02 et 0, 98, respectivement. De plus, les signaux multiplets allant de δ 6, 56 à 6, 64 pourraient être provisoirement attribués aux agrumes A, à l'alaschanioside A ou au glucoside d'alcool déhydéodiconiféryle (tous les dérivés de lignanes), tandis que les signaux parmi δ 6, 18 à 6, 33 pourraient également être générés par des iridoïdes (tableau S2 et Fig. 1). De plus, les occurrences de certains acides carboxyliques aliphatiques dans la CD, y compris l'acide fumarique, l'acide maléique, l'acide malique, l'acide isocitrique, l'acide citrique, l'acide cétoglutarique, l'acide pyruvique, l'acide succinique, l'acide acétique et un autre acide gras, ont été provisoirement caractérisées par la observation des signaux de diagnostic à δ 6, 54, 6, 02, 4, 27, 3, 04, 2, 73, 2, 52, 2, 49, 2, 42, 1, 97 et 1, 33, de manière séquentielle (tableau S2 et figure 1). De plus, certains signaux, tels qu'un signal multiplet autour de 3,80 ppm et un singulet à 1,97 ppm22, ont été considérés comme les caractéristiques des groupes méthoxy et acétyle (tableau S2 et figure 1), respectivement, qui sont les substituts courants des dérivés phényles. , en particulier les PhG dans ce cas. Pendant ce temps, le signal à 1,06 ppm pourrait être provisoirement attribué au résidu de rhamnose. Il est bien connu que la spectroscopie RMN 1H peut fournir des informations quantitatives directes car l'intensité du signal protonique est proportionnelle à la concentration molaire de l'analyte19. Par conséquent, la comparaison quantitative préliminaire pourrait être effectuée pour les ingrédients du CD. De toute évidence, les glucides, en particulier le saccharose, ont donné les réponses les plus élevées dans le spectre représentatif (Fig. 1). En tant que plante holoparasite qui pousse sous terre pendant presque tout un cycle de vie, la photosynthèse n'est pas nécessaire et n'est pas disponible pour le CD ; par conséquent, il n'est pas surprenant qu'aucun métabolite primaire impliqué dans la photosynthèse, tel que le participant au cycle de Kelvin (également connu sous le nom de cycle C3), n'ait été trouvé dans le spectre23. Au contraire, une richesse de molécules participant au cycle de l'acide tricarboxylique (cycle TCA, également connu sous le nom de cycle de l'acide citrique et cycle de Krebs) a été détectée, telles que l'acide citrique, l'acide cétoglutarique, l'acide pyruvique et l'acide succinique, indiquant que le métabolisme du carbone (CCM) se produit dans la plante d'origine. D'autre part, les PhG ont été observés comme la famille chimique dominante parmi divers métabolites secondaires, tandis que les lignanes et les iridoïdes n'ont fourni que des contributions mineures pour l'ensemble du profil spectral.

3.3. Dosage de précision de la spectroscopie RMN 1H

La précision spectroscopique joue un rôle clé dans la fiabilité de la caractérisation métabolomique. Dans l'étude actuelle, la précision de l'ensemble de la méthodologie a été testée en préparant un échantillon représentatif (CD1-GUI) en quintuple et en l'analysant ensuite pendant deux jours consécutifs. Les spectres obtenus présentaient une grande similitude globale en superposant tous les spectres, suggérant que le protocole de préparation de l'échantillon et la mesure RMN 1H étaient reproductibles et que l'échantillon pouvait rester stable en deux jours au moins.

3.4. Discrimination des parties supérieures et inférieures de la plante

Jusqu'à présent, aucune preuve n'a démontré que les parties supérieures du CD sont équivalentes aux parties inférieures en ce qui concerne le profil chimique et les propriétés pharmacologiques. Dans le but de clarifier si l'accumulation de métabolites primaires ou secondaires s'est produite dans certaines parties du CD, les tiges succulentes entières ont été coupées dans les parties supérieure et inférieure, qui ont ensuite été traitées, extraites et mesurées à l'aide de la spectroscopie RMN 1 H. La figure 2 montre les spectres représentatifs des deux parties. Dans l'ensemble, la plupart des signaux dans les parties inférieures étaient plus élevés que ceux des parties supérieures. Dans la plage de δ 6.0–9.5, aucun signal unique n'a pu être trouvé dans l'une ou l'autre des parties ; cependant, l'intensité globale de ces signaux dans les parties inférieures était légèrement supérieure à celle des parties supérieures, suggérant que les dérivés aromatiques pourraient être enrichis dans le domaine proche du point parasite23. Les parties inférieures étaient également riches en acides gras, certains acides aminés et certaines autres substances de stockage d'énergie en raison de la réponse globale du signal de la région aliphatique (δ 0.5–3.{{10} }) dans les parties inférieures était supérieure à celle des parties supérieures. De plus, certaines différences évidentes ont pu être observées dans la région du sucre (δ 3.0–5.0), et la plupart des signaux se situent dans la plage de δ 3.0– 5.0 pour les parties supérieures étaient plus élevées que celles des parties inférieures, indiquant que les glucides, notamment les oligosaccharides, pouvaient s'accumuler dans les parties supérieures. Afin de mettre en évidence les différences entre les parties supérieures et les parties inférieures et également d'identifier les principaux contributeurs en charge de leur discrimination, une analyse de données multivariée a été appliquée pour traiter le jeu de données spectroscopiques des différentes parties. Une approche non supervisée appelée PCA, qui n'utilise que les informations d'une matrice, a été initialement appliquée afin de classer tous les échantillons selon les spectres RMN 1 H caractéristiques. Cependant, un chevauchement important s'est produit pour ces deux parties différentes (données non présentées). Par la suite, OPLS-DA, une approche supervisée, a été lancée pour affiner la séparation entre les différents groupes ainsi que pour comprendre les variables portant les informations de séparation de classe. OPLS-DA a réalisé une bonne séparation des différentes parties du CD. Les figures 3A et B montrent respectivement le tracé des scores et le tracé en S de l'OPLS-DA. La qualité globale de l'ajustement (R2Y¼{{30}}.910) et le coefficient global de validation croisée (Q2Y¼0.981) étaient proches de 1,0. Par conséquent, le modèle de séparation original était statistiquement solide avec une prévisibilité élevée. De toute évidence, les parties supérieures pouvaient être distinguées des parties inférieures lorsque les échantillons étaient marqués avec deux groupes, et le S-plot donnait les signaux qui contribuaient potentiellement à la différenciation. Dans l'ensemble, plus de points ont été distribués dans la région correspondant aux parties inférieures du diagramme en S, où des teneurs plus élevées en acides gras (δ 1, 32 à 1, 35) et des facteurs de cycle TCA (tels que l'acide succinique à δ 2, 42) ont été distribués; cependant, la partie supérieure (groupe de droite sur la Fig. 3A) était riche en certains glucides (principalement δ 3,70–4,10, Fig. 3B). Les biomarqueurs potentiels fournis par le S-plot étaient fortement cohérents avec la comparaison des spectres des deux parties par observation directe et superposition. Il est bien défini que les métabolites sont synthétisés de manière spécifique aux tissus, aux organes et au développement par des enzymes de biosynthèse spécifiques, puis stockés, parfois à des teneurs élevées dans les domaines producteurs, correspondant à leurs diverses fonctions pour la plante entière. Par exemple, les types et les teneurs en ginsénosides présentent des variations significatives parmi les rhizomes, les racines, les feuilles et les adeptes de Panax notoginseng24. En ce qui concerne CD, du point de vue qualitatif, les profils de métabolites secondaires présentaient une grande similitude entre les parties supérieures et les parties inférieures. Étant donné que les parties inférieures des plantes entières jouent le rôle de transmission des substances nutritives, dont la plupart sont des métabolites primaires, par exemple des glucides, de l'hôte, Haloxylon ammodendron, aux points de métabolisme vigoureux, indiquant que des métabolites primaires plus abondants devraient se produire dans le parties inférieures. De plus, une hydrolyse extensive des polysaccharides en oligosaccharides puis en monosaccharides, qui pourraient finalement être biotransférés dans certains acides carboxyliques aliphatiques, devrait se produire de manière extensive dans les parties supérieures. Étant donné que 50 % de méthanol aqueux a été utilisé pour l'extraction dans cette étude et qu'il était capable d'extraire des molécules basses hydrophiles au lieu de macromolécules (par exemple, des polysaccharides), il n'est pas surprenant de noter que l'accumulation de facteurs de cycle TCA et d'acides gras a été démontrée dans le bas. les pièces. Cependant, certains oligosaccharides, les produits hydrolytiques des polysaccharides, se sont révélés être enrichis dans les parties supérieures. En revanche, des différences mineures ont été observées pour les PhG entre les différentes parties du point de vue quantitatif, et globalement, une légère accumulation de PhG a été observée au niveau des parties inférieures23,25. Il a été rapporté que le phloème de l'haustorium est probablement l'organe synthétique secondaire des PhG dans CD23; par conséquent, les parties inférieures, proches du point parasitaire, devraient être riches en PhG.

3.5. Proposition d'une nouvelle méthode de traitement pour CD

De toute évidence, les tranches médicinales appartenant aux échantillons de type c étaient supérieures en termes de bonne apparence, de couleur blanc cassé, de lumière et de texture nette. La figure 4 montre les spectres RMN 1H représentatifs pour ces trois types d'échantillons. Suite à des mesures parallèles, cependant, différents profils spectraux ont été obtenus pour ces tranches médicinales traitées. Grâce à l'observation directe et à la superposition, des différences évidentes ont pu être observées. Premièrement, dans la région de δ 6.00–8.00, où figuraient principalement les signaux appartenant aux PhG et à certains autres dérivés phénoliques, les réponses des échantillons de type c (Fig. 4C) étaient bien supérieur aux deux autres types. Deuxièmement, les réponses de la plupart des glucides et des participants au TCA dans les échantillons de type b (Fig. 4B) étaient presque équivalentes à celles des échantillons de type c (Fig. 4C) mais beaucoup plus élevées que celles des échantillons de type a (Fig. 4A) . Troisièmement, les teneurs en glucose (δ 5,20 pour -glucose et δ 4,60 pour -glucose) dans les échantillons de type b (Fig. 4B) étaient légèrement supérieures à celles des échantillons de type c (Fig. 4C). Enfin, plus d'acides gras ont été détectés dans les échantillons de type a et c que dans les échantillons de type b (Fig. 4). Surtout, les dérivés de phénol les plus abondants, tels que celui-ci, qui ont été largement considérés comme les ingrédients efficaces du CD, ont été trouvés dans les échantillons traités par une nouvelle méthode (échantillons de type c), en comparaison de a- et b- types d'échantillons. De plus, des métabolites primaires abondants, tels que des glucides, des participants au TCA et des acides gras, ont également été trouvés dans des échantillons de type c. Par la suite, les comparaisons de tous les échantillons par le biais d'une analyse de données multivariée ont été effectuées dans le but de mettre en évidence les similitudes ainsi que les différences entre ces trois types de tranches médicinales. PCA avec mise à l'échelle Par et OPLS-DA avec mise à l'échelle UV a été réalisée pour traiter l'ensemble de données spectroscopiques RMN, successivement (données non présentées). Une séparation significative n'a pas été obtenue avec l'ACP ; cependant, les tracés de score de l'OPLS-DA pour ces trois groupes (points verts, bleus et rouges sur la figure 5A) ont montré une classification claire, indiquant que ces trois groupes d'échantillons étaient significativement différents en ce qui concerne leurs profils métaboliques. La

dégradation des PhG initiée soit par les enzymes de la plante d'origine, soit par le stockage à haute température. En conséquence, les tranches traitées (échantillons de type c) à l'aide de la nouvelle méthode étaient avantageuses à la fois en termes d'aspect agréable et de teneurs en composés efficaces plus élevées. Pour valider les résultats susmentionnés pour les trois techniques de traitement, la méthode HPLC-UV qui a été bien développée et authentifiée dans la pharmacopée chinoise (édition 2015)3 a été utilisée pour déterminer simultanément les teneurs en échinacoside et en actéoside, qui ont joué un rôle important pour distinguer les trois types de produits transformés ci-dessus. Les teneurs moyennes en échinacoside dans les échantillons de type a, b et c étaient de 8,33, 4,10 et 16,19 mg/g, respectivement, tandis que les teneurs en actéoside étaient de 1,57, 1,14 et 3,66 mg/g, respectivement. De toute évidence, les teneurs en PhG des matériaux de type c étaient 2 à 4 fois plus élevées que celles des échantillons de type a et b, ce qui concorde bien avec les résultats métabolomiques basés sur la RMN 1 H. Parmi les techniques analytiques disponibles généralement employées dans les études métabolomiques, les méthodes basées sur la RMN et la SM ont généralement été reconnues comme des alternatives favorables. La spectroscopie RMN, en particulier la RMN 1H, possède des supériorités inégalées sur d'autres techniques, telles que la non-sélectivité, la préparation pratique des échantillons et la facilité de détection simultanée de divers groupes de métabolites dans un temps de mesure relativement court. Jusqu'à présent, la métabolomique basée sur la RMN 1 H a été utilisée pour authentifier les plantes17 afin de comparer les herbes analogues18, de différencier l'habitat26 et de caractériser la dégradation des herbes26. Ici, la RMN 1 H a été appliquée pour distinguer les différentes parties du CD, et également pour proposer un nouveau flux de travail de processus, indiquant que la spectroscopie RMN 1 H est un outil analytique flexible et robuste pour offrir des directives significatives pour l'exploitation du CD ainsi que d'autres plantes médicinales en fournissant des informations qualitatives et quantitatives complètes sur des matrices d'extraits complexes.