Partie 1 : l'échinacoside induit la mort apoptotique des cellules cancéreuses en inhibant l'enzyme désinfectante du pool de nucléotides MTh1

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Résumé:L'inhibition de l'enzyme de désinfection du pool de nucléotides MTH1 provoque des dommages oxydatifs importants à l'ADN et l'apoptose dans les cellules cancéreuses et peut donc être utilisée comme stratégie anticancéreuse. Comme les produits naturels ont été une riche source de produits chimiques médicinaux, dans la présente étude, nous avons utilisé la réaction enzymatique catalysée par MTH 1- comme un test de dépistage à haut débit pour rechercher des composés naturels capables d'inhiber MTH1.Échinacoside, un composé dérivé des plantes médicinalesCistancheet l'échinacée, ont inhibé efficacement l'activité catalytique de MTH1 dans un essai in vitro. Traitement de diverses lignées cellulaires cancéreuses humaines avecÉchinacosidea entraîné une augmentation significative du niveau cellulaire de guanine oxydée (8-oxoguanine), tandis que le niveau d'espèces réactives de l'oxygène cellulaire est resté inchangé, indiquant queÉchinacosideégalement inhibé l'activité de MTH1 cellulaire. Par conséquent, le traitement à l'échinacoside a induit une augmentation immédiate et spectaculaire des marqueurs de dommages à l'ADN et une régulation positive de l'inhibiteur p21 de G1/S-CDK, qui ont été suivies d'une mort cellulaire apoptotique marquée et d'un arrêt du cycle cellulaire dans les cellules cancéreuses, mais pas dans les cellules non cancéreuses. Ensemble, ces études ont identifié un composé naturel comme inhibiteur de MTH1 et suggèrent que les produits naturels peuvent être une source importante d'agents anticancéreux.

Mots clés: Échinacoside, MTH1, 8-oxoG, dommages à l'ADN, apoptose, arrêt du cycle cellulaire

Cistanchel'extrait aanticancéreuxavantages pour la santé

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Introduction

Le pool cellulaire et mitochondrial de nucléoside triphosphate (NTP) et de désoxynucléoside triphosphate (dNTP) est une cible importante de diverses espèces réactives de l'oxygène (ROS)1–3. incorporé dans l'ADN nouvellement synthétisé pour provoquer des aberrations génétiques s'il n'est pas fixé.6 Par exemple, la principale base oxydée du pool de nucléotides, la 8-oxoguanine (8-oxoG), peut s'apparier avec la cytosine et l'adénine. Lorsqu'il est inséré dans l'adénine opposée pendant la réplication de l'ADN, il peut potentiellement provoquer une transversion T : A=G : C,7 qui est l'une des mutations les plus courantes trouvées dans les cancers humains.8,9 Bien que la plupart des dNTP libres oxydés sont éliminés par les enzymes de désinfection du pool de nucléotides, des études antérieures ont révélé que le pool de nucléotides est toujours une source importante de bases oxydées dans les molécules d'ADN et un contributeur important aux dommages oxydatifs de l'ADN.3,10 l'enzyme la plus importante pour la désinfection des nucléotides Néanmoins, même sous la surveillance des enzymes de désinfection des pools de nucléotides, une partie importante des dNTP oxydés sont incorporés dans l'ADN, et les bases des molécules d'ADN peuvent également être oxydées directement par les ROS.6 Les cellules s'appuient alors sur des stratégies plus élaborées impliquant divers Les ADN glycosylases, telles que OGG1 et MUTYH, et les processus de réparation de l'ADN, y compris la réparation par excision de bases (BER) et la réparation des mésappariements (MMR), pour réparer les bases problématiques dans les molécules d'ADN.10,16,17 BER a nd MMR répare normalement de nombreuses bases oxydées dans l'ADN par jour et joue ainsi un rôle important dans la protection de l'intégrité et de la stabilité du génome.

Dans les cellules soumises à un stress oxydatif élevé, une incorporation accrue de nucléotides oxydés dans l'ADN peut submerger la capacité de réparation cellulaire et déclencher une réponse aux dommages de l'ADN (DDR).18 La signalisation DDR persistante entraînera un arrêt du cycle cellulaire, une sénescence cellulaire prématurée ouapoptose, établissant ainsi une barrière pour la tumorigenèse.19 Pourtant, bien que les cellules cancéreuses affichent une tension oxydative fortement accrue et génèrent une charge potentiellement mortelle de nucléotides oxydés,20 elles peuvent survivre à la sénescence ouapoptose.21 Un grand nombre d'études ont montré que le MTH1, en éliminant efficacement le 8-oxodGTP et le 2-OH-dATP dangereusement abondants dans les cellules tumorales, joue un rôle clé dans le développement du cancer.22 Le MTH1 était surexprimée dans différents types de cancer,23–25 et les niveaux de 8-oxoG, et l'étendue des lésions oxydatives de l'ADN était plus faible dans les tumeurs que dans les tissus normaux environnants.26–28 Sur le plan fonctionnel, la surexpression de MTH1 a considérablement réduit le nombre de mutations d'ADN observées dans les fibroblastes embryonnaires de souris déficients en MMR10 et a permis aux cellules de surmonter la sénescence cellulaire prématurée et l'apoptose induites par Ras oncogènes ;29 alors que la suppression de MTH1 a empêché le développement d'un cancer chez les souris déficientes en OGG1-30 et a favorisé DDR induite par les ROS et sénescence cellulaire dans les cellules transformées par Ras.3,29,31 Ainsi, bien que MTH1 joue un rôle protecteur en empêchant les mutations induites par les ROS dans les cellules saines, ces études ont montré que MTH1 est particulièrement nécessaire à l'émergence et à la survie. de cellules cancéreuses. Des études récentes ont fourni plus de preuves à l'appui du rôle de MTH1 dans le développement du cancer.31–34 La suppression de MTH1 par l'ARNi ou des inhibiteurs de petites molécules dans diverses lignées cellulaires cancéreuses a entraîné une incorporation nettement accrue de 8-oxo d G dans l'ADN génomique , entraînant des dommages importants à l'ADN, la mort cellulaire apoptotique et une réduction de la survie des cellules cancéreuses.32,33 Dans les études de xénogreffes de souris, l'inhibition de MTH1 a efficacement supprimé la croissance des explants cancéreux. Il est important de noter que la suppression de MTH1 n'a pas eu d'impact sur la croissance et la survie des cellules normales, probablement parce que les cellules normales ont des ROS plus faibles et sont donc moins dépendantes de MTH1 pour leur survie.32,33 Ces résultats suggèrent que l'inhibition de MTH1 est une nouvelle stratégie prometteuse pour lutter contre le cancer.

Les produits naturels ont été une riche source de composés médicinaux.35 De nombreux traitements modernes, y compris les médicaments anticancéreux, ont été dérivés de préparations à base de plantes ou de plantes.36–39 à caractériser, en grande partie en raison des difficultés à contrôler leurs compositions pour définir sans ambiguïté leur efficacité et leurs mécanismes d'action.40 De nouvelles approches permettant la détection des composés actifs et l'analyse des mécanismes moléculaires sont nécessaires. À cet égard, le criblage in vitro à haut débit guidé par cible peut être déterminant pour trouver des composés médicinaux définis de manière mécanique à partir de ressources naturelles. Dans la présente étude, nous avons utilisé la réaction enzymatique catalysée par MTH1- comme test in vitro à haut débit pour rechercher des composés naturels qui peuvent inhiber MTH1. Étonnamment, la projection a révélé queÉchinacoside, un produit naturel qui est surtout connu pour sa puissante activité antioxydante, est capable d'inhiber MTH1.

Échinacosideen cistanche peutanti-apoptose

matériaux et méthodes

Matériaux

Des composés naturels à base de plantes ont été achetés auprès de Yuanye Biological Technology Co., Shanghai, République populaire de Chine. Le nom, le numéro de catalogue, le numéro d'enregistrement du Chemical Abstracts Service (CAS) et la pureté de chaque composé sont répertoriés dans le tableau S1. Des solutions mères des composés ont été préparées dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à 100 % (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, États-Unis) et des solutions de travail ont été préparées dans un tampon d'essai ou un milieu de culture cellulaire complet. La même solution sans le composé à tester mais contenant la même quantité de DMSO a été utilisée comme véhicule témoin. Le (S)-crizotinib a été acheté chez Selleck Chemicals, Houston, TX, USA.

dépistage in vitro

Le test enzymatique in vitro utilisé pour cribler les composés naturels à base de plantes a suivi les procédures décrites par Gad et al. acétate (pH 8.0), 40 mM de NaCl, 10 mM d'acétate de Mg, 0,005 % de Tween 20 et 1 mM de DTT. Ensuite, 0,5 nM de MTH1 humain recombinant (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), 100 μM de dGTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) et 0,2 U/mL de pyrophosphatases inorganiques (Thermo Fisher Scientific) ont été ajoutés, et les plaques ont été incubées sur un agitateur à plaques pendant 1 heure à température ambiante. Le volume de réaction final était de 100 μL dans une plaque à puits 96-. À la fin de la réaction, du vert malachite (J&K Scientific, Pékin, République populaire de Chine) a été ajouté,41, et les plaques ont été incubées à température ambiante pendant 15 minutes supplémentaires. L'absorbance à 630 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques BioRad 680 (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA). Les valeurs de concentration inhibitrice (IC50) ont été déterminées par analyse de régression non linéaire à l'aide du logiciel GraphPad Prism.

culture de cellules

L'ostéosarcome humain MG-63, l'hépatocarcinome SK-HEP-1, le cancer du sein MCF7, le cancer colorectal SW480, le rein embryonnaire HEK293 et ​​les lignées cellulaires de fibroblastes NIH/3T3 de souris provenaient de l'American Type Culture Collection, et la normale humaine la lignée de cellules hépatiques L-O2 a été achetée auprès de KenGen Biotech, Nanjing, République populaire de Chine. Ces cellules ont été maintenues à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2, en suivant les instructions données par les prestataires. Aucune déclaration d'éthique n'était requise de la part du comité d'examen institutionnel pour l'utilisation de ces lignées cellulaires.

Mesure de l'{{0}}oxo intracellulaire Les niveaux d'8-oxoG intracellulaire ont été mesurés par coloration avec de l'avidine conjuguée à la Cy3-42. Au total, 1 × 104 cellules ont été ensemencé sur une lamelle ronde dans des plaques 12-puits. Le lendemain, les cellules ont été traitées avec de l'échinacoside 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ou 80 μM pendant 5 heures, 12 heures ou 24 heures, puis fixées avec de la glace. -méthanol froid pendant 20 minutes, suivi d'une incubation dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) avec 0,1 % de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) pendant 15 minutes. Les échantillons ont été bloqués dans du TBS avec 0,1 % de Triton X-100 et 15 % de sérum bovin fœtal pendant 1 heure à température ambiante, puis colorés avec de l'avidine conjuguée au Cy3- (0,5 ug/mL) (Rockland Immunochemicals, Limerick, PA, USA) dans une solution de blocage pendant 1 heure à 37 degrés. Après lavage dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 3 fois pendant 5 minutes, les lamelles ont été scellées sur des lames de verre avec un milieu de montage anti-insectes avec du 4′,6-diamidino-2-phénylindole (Vector Laboratories, Burlingame, CA , ETATS-UNIS). Les images ont été prises et analysées par un microscope confocal Zeiss LCM 510.

Mesure de Ros intracellulaire Les taux de ROS intracellulaires ont été mesurés par cytométrie en flux à l'aide d'un kit de dosage de ROS à base de cellules (Beyotime Biotechnology, Haimen, République populaire de Chine). Les cellules cultivées dans des plaques à six puits ont été traitées avec 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ou 80 μM d'échinacoside pendant 5 heures, 12 heures ou 24 heures, lavées deux fois avec du PBS et incubées avec 10 diacétate de dichlorofluorescéine μM pendant 30 minutes à 37 degrés. Les cellules ont ensuite été trypsinisées et analysées par le cytomètre en flux FACSCaliber (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). Les niveaux de ROS intracellulaires ont été exprimés comme l'intensité moyenne de fluorescence de la dichlorodihydrofluorescéine des cellules. Les nombres indiqués étaient des moyennes de trois expériences indépendantes.

Coloration immunofluorescente

Les cellules cultivées sur des lamelles ont été traitées avec {{0}} μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM ou 80 μM d'échinacoside pendant 5 heures, 12 heures ou 24 heures, puis lavées une fois avec du PBS, fixées avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 20 minutes et bloqué dans du TBS avec 0,1 % de Triton X-100 et 15 % de sérum bovin fœtal pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules fixées ont été colorées pendant 2 heures à température ambiante avec un anticorps primaire contre 8-oxoG (souris monoclonale anti-8-oxoG, Abcam), 53BP1 (lapin anti-53BP1 ; Bethyl Laboratories, Montgomery , Texas, États-Unis), ou caspase active-3 (anti-caspase de lapin-3, Bioss, Pékin, République populaire de Chine), suivie d'une coloration avec un Alexa 488-antisouris d'âne conjugué ( Abcam) ou Cy3-anticorps secondaire de chèvre anti-lapin (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) pendant 1 heure à température ambiante. Après lavage dans du PBS 3 fois pendant 5 minutes, les lamelles ont été scellées sur des lames de verre dans du milieu de montage VECTASHIELD avec DAPI (Vector Laboratories). Les images ont été prises par un microscope confocal Zeiss LCM 510.

test de formation de colonies

La veille du traitement, les cellules ont été ensemencées dans une plaque à six puits à une concentration de 1 × 104 cellules par puits. Ils ont ensuite été traités avec 0 μM, 60 μM ou 80 μM d'échinacoside pendant 7 jours. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été fixées avec du méthanol glacé et colorées avec une solution de cristal violet (Sigma-Aldrich) (0,5 % dans du méthanol à 25 %). Les images ont été photographiées après séchage des plaques pendant une nuit. Les cristaux de cristal violet ont été dissous en ajoutant 70 % d'éthanol et l'absorbance à 595 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques BioRad 680. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism.

Test MTT

Un jour avant le traitement, les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à une concentration de 1 × 104 cellules par puits, suivies d'un traitement avec des dilutions en série d'échinacoside pendant 24 heures ou 48 heures, ou avec 60 μM d'échinacoside pendant 5 heures, 12 heures. , ou 24 heures. Le milieu a été retiré et les cellules ont été lavées avec du PBS, puis 20 μL de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,{{15} Une solution de bromure de diphényltétrazolium (MTT) (5 mg/mL dans du PBS, pH 7,2) (Thermo Fisher Scientific) a été ajoutée à chaque puits. Les plaques ont été incubées à 37 degrés pendant encore 4 heures. Au final, la solution de MTT a été retirée et 150 μL de DMSO ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont été incubées sur un agitateur de plaques pendant 10 minutes et l'absorbance à 570 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques BioRad 680. Chaque expérience a été menée deux fois en triple. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism. Les valeurs IC50 ont été déterminées en utilisant une analyse de régression non linéaire.

analyse du cycle cellulaire

Les cellules dans des plaques à six puits ont été traitées avec 0 μM, 6{{10}} μM ou 80 μM d'échinacoside pendant 24 heures, récoltées avec de la trypsine (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) , lavé deux fois avec du PBS, puis fixé avec de l'éthanol glacé (70 %) pendant 2 heures à -20 degrés. Les cellules fixées ont été lavées deux fois dans du PBS froid et remises en suspension dans 300 μL de PBS fraîchement préparé avec 0,1 % de Triton X-100, 0,2 mg/mL de RNase A sans DNase (Sigma-Aldrich), 10 ug/mL d'iodure de propidium ( PI) (Hoffman-La Roche SA, Bâle, Suisse). Après incubation à 37 degrés dans l'obscurité pendant 20 minutes, les cellules ont été filtrées à travers une maille en nylon Falcon (BD Biosciences), chargées sur le cytomètre en flux FAC-SCalibur et analysées à l'aide du logiciel ModFit (BD Biosciences).

Analyse de la fragmentation de l'ADN

Les cellules cultivées dans des plaques à six puits ont été traitées avec de l'échinacoside 0 μM, 60 μM ou 80 μM pendant 24 heures et fixées dans du paraformaldéhyde glacé à 4 % (Sigma-Aldrich) pendant 20 minutes. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été scellées dans du milieu de montage VECTASHIELD avec du DAPI (Vector Laboratories). La morphologie nucléaire a été photographiée avec un microscope à fluorescence Olympus. Pour détecter la fragmentation de l'ADN sur des gels d'agarose, l'ADN a été extrait à l'aide du kit de micro-ADN QIAamp (Qiagen NV, Venlo, Pays-Bas) et l'électrophorèse a été réalisée sur des gels d'agarose à 2 % contenant 0,1 ug/mL de bromure d'éthidium.

Analyse de l'apoptose par cytométrie en flux Les cellules apoptotiques ont été examinées à l'aide d'un kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC (Bestbio, Shanghai, République populaire de Chine), en suivant les instructions du fabricant. Les cellules cultivées dans des plaques à puits 96- ont été traitées avec 0 μM, 15 μM, 30 μM, 60 μM, 80 μM ou 160 μM d'échinacoside pendant 2 heures, 5 heures, 12 heures ou 24 heures, lavé deux fois avec du PBS, puis remis en suspension dans un tampon de liaison. Ensuite, 5 μL d'annexine V-FITC et 5 μL de PI (Roche) ont été ajoutés séquentiellement, et les cellules ont été incubées pendant 15 minutes dans l'obscurité à température ambiante. Les cellules ont été chargées sur le cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences) et les données ont été analysées à l'aide du logiciel Cell Quest (BD Biosciences).

Analyse Western blot

Les cellules cultivées dans des plaques à six puits ont été traitées avec 0 μM, 6{{10}} μM ou 80 μM d'échinacoside pendant 5 heures, 12 heures ou 24 heures, lavé deux fois avec du PBS et gratté la plaque en utilisant 100 μL de tampon de radioimmunoprécipitation (150 mM NaCl, 1,0 % IGEPAL CA-630, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium , et Tris 50 mM, pH 8,0) (Sigma-Aldrich) contenant 1 mM de fluorure de phénylméthane sulfonyle. Les échantillons ont été centrifugés à 12,000× g pendant 20 minutes à 4 degrés. Les concentrations de protéines dans les surnageants ont été déterminées par le réactif de Bradford (Dingguo, Changchun, République populaire de Chine). Les échantillons ont été dénaturés à 95 degrés pendant 10 minutes et séparés sur un gel d'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide à 12 %. Après l'électrophorèse, les protéines ont été transférées sur des membranes de fluorure de polyvinylidène (Millipore), suivies d'un blocage dans une solution saline tamponnée au Tris avec du Tween 20 (Tris 10 mM, pH 7,5 ; NaCl 100 mM ; 0,1 % de Tween 20) contenant 5 % (p/v) lait écrémé pendant 1 heure à température ambiante. Les transferts ont été sondés avec des anticorps primaires contre p21 (Abcam), poly (ADP-ribose) polymérase (Bioss) ou caspase activée -3 (Bioss), suivis d'anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Les signaux ont été développés à l'aide du kit de détection Western Blot amélioré par chimiluminescence (Transgen Biotech, Changchun, République populaire de Chine). Les expériences ont été répétées trois fois.

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Mesure des mitochondries

potentiel membranaire

Le potentiel de membrane mitochondriale a été mesuré à l'aide du colorant JC{{0}} (Biotechnologie), en suivant les instructions du fabricant. Les cellules cultivées dans des plaques à six puits ont été traitées avec 0 μM, 60 μM ou 80 μM d'échinacoside pendant 5 heures, 12 heures ou 24 heures, lavées deux fois dans du PBS puis incubées avec JC -1 pendant 20 minutes. Les images ont été prises à l'aide d'un microscope à fluorescence Olympus.

analyses statistiques

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism. La signification a été calculée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle, et P0.05 a été considéré comme statistiquement significatif. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type.

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