Partie 1 : Des extraits de Cistanche Deserticola peuvent antagoniser l'immunosénescence et prolonger la durée de vie des souris Senescence-Accelerated Mouse Prone 8 (SAM-P8)

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Ke Zhang,1 Xu Ma,1 Wenjun He,1 Haixia Li,1 Shuyan Han,1 Yong Jiang,1

Hounan Wu,2 Li Han,3 Tomohiro Ohno,3 Nobuo Uotsu,3 Kohji Yamaguchi,3 Zhizhong Ma,1,4 et Pengfei Tu1

1 Department of Natural Medicines, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, No. 38 Xueyuan Road, Beijing 100191, Chine

2 Medical and Healthy Analytical Center, Peking University, No. 38 Xueyuan Road, Beijing 100191, Chine

3 Faculté de recherche fondamentale, Institut de recherche Fancl, FANCL Corporation, 12-13 Kamishinano, Totsuka-ku, Yokohama, Kanagawa 244-0806, Japon

4 Département d'intégration de la médecine traditionnelle chinoise et occidentale, École des sciences médicales fondamentales, Université de Pékin, No. 38 Xueyuan Road, Beijing 100191, Chine

La correspondance doit être adressée à Zhizhong Ma; zhma@bjmu.edu.cn et Pengfei Tu ; pengfeitu@bjmu.edu.cn Reçu le 19 juillet 2013 ; Révisé le 23 octobre 2013 ; Accepté le 11 novembre 2013 ; Publié le 9 janvier 2014 ; Rédacteur académique : Adair Santos

1. Introduction

Cistanche désertique, l'un des médicaments/produits de santé traditionnels chinois à base de plantes les plus populaires, a été décrit dans un certain nombre de pharmacopées chinoises historiques à base de plantes comme ayant des propriétés anti-âge. Par conséquent, il a été largement utilisé en Chine pour traiter divers troubles liés à l'âge, notamment la démence sénile, l'impuissance, l'infertilité, les infections chroniques et les troubles hématopoïétiques chez les personnes âgées [1]. Les approches chimiques modernes ont permis d'isoler deux principaux types de composés, les glycosides phényléthanoïdes et les oligosaccharides, en tant que principaux ingrédients actifs de Cistanche deserticola [1]. Au cours de la dernière décennie, Cistanche deserticola et ses extraits ont fait l'objet d'études intensives et se sont révélés capables de protéger les neurones des lésions induites par les neurotoxines [2], d'inhiber l'hépatotoxicité induite par le tétrachlorure de carbone [2] et de favoriser la récupération des cellules de la moelle osseuse à partir de Dommages radio-induits par le Co [3]. Il a également été démontré qu'il a des effets anti-inflammatoires, antioxydants et anti-âge [4]. Cependant, si Cistanche deserticola peut augmenter la durée de vie et quels sont les mécanismes moléculaires sous-jacents [3] associés à saanti-âgepropriétés n'ont pas été rigoureusement testées.

Extraits de Cistanche deserticola anti-âge

L'immunosénescence, c'est-à-dire l'altération du système immunitaire avec l'âge, constitue le contexte dans lequel une susceptibilité accrue aux infections, au cancer, aux maladies neurodégénératives et aux maladies auto-immunes chez les personnes âgées a été notée [5]. Des interventions thérapeutiques, telles que la restriction calorique [6] et la supplémentation en vitamine E, se sont révélées efficaces pour retarder la progression de l'immunosénescence et donc réduire la morbidité de certaines maladies liées à l'âge, ainsi que pour prolonger la durée de vie des humains et des rongeurs. [7, 8]. Cependant, les études dans ce domaine sont compliquées par le fait que le vieillissement est associé au paradoxe d'un déficit immunitaire et d'une inflammation chronique simultanés [9]. Cela signifie que la simple stimulation de la pro-libération lymphocytaire ou anti-inflammatoire ne représente pas des interventions thérapeutiques idéales pour faire face au vieillissement et aux conditions liées à l'âge [10]. Par conséquent, dans la recherche d'interventions médicales capables de prévenir ou d'atténuer les affections liées à l'âge, notamment les infections, le cancer, les maladies auto-immunes, l'athérosclérose et les maladies neurodégénératives qui sont les principales causes de décès et d'invalidité, et la réparation des défauts du système immunitaire doit s'accompagner d'une inhibition de réponses inflammatoires.

La souris à sénescence accélérée [11] est un modèle de souris consanguine, dérivée de la souche AKR/J, largement utilisée dans les études du vieillissement. La sous-souche P8 (SAM-P8) de ces souris a une durée de vie nettement raccourcie par rapport à la sous-souche R1 (SAM-R1), qui montre également un processus de vieillissement plus lent [12]. Parallèlement à leur vieillissement prématuré, les souris SAM-P8 présentent également une sénescence neurologique accrue, une immunosénescence et des déficits hématopoïétiques liés à l'âge qui imitent étroitement les caractéristiques typiques du vieillissement humain [13, 14]. L'analyse des mécanismes sous-jacents responsables du processus de vieillissement accéléré et des troubles liés à l'âge indique que le dysfonctionnement mitochondrial [15], le stress oxydatif et l'augmentation du taux de mutation somatique de l'ADN semblent tous être impliqués [16, 17]. Ce système de souris, avec son fond génétique homogène, fournit donc un excellent modèle expérimental pour étudier le vieillissement et les thérapeutiques anti-âge [12] déposé dans l'herbier de l'École des sciences pharmaceutiques de l'Université de Pékin, en Chine.

cistanche peut anti-âge

2. Matériels et méthodes

2.1. Matériaux.

FraisCistanche deserticola YC MAa été collecté dans diverses régions du nord-ouest de la Chine, notamment les régions autonomes du Xinjiang, du Neimenggu et du Ningxia. Les échantillons utilisés pour préparer les extraits ont été authentifiés par le professeur Pengfei Tu, spécialiste de la pharmacognosie au Département des médecines naturelles, École des sciences pharmaceutiques, Université de Pékin. Le spécimen de référence de Cistanche deserticola (numéro CD-2007-03-08) utilisé avait le Science Center (Pékin, Chine). Cette étude a été approuvée par le Comité de recherche sur les animaux de l'Université de Pékin et réalisée conformément aux directives pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire à l'Université de Pékin. Le numéro de certification de ces souris était SCXK2001-2008. Les souris ont été gardées dans des cages métaboliques standard dans des conditions environnementales

C, humidité de 45 à 60 % et cycle lumière/obscurité de 12 h) et a permis un libre accès à la nourriture et à l'eau. Après 2 semaines d'acclimatation, les animaux ont été divisés en cinq groupes : 3 groupes de traitement ECD, un groupe témoin SAM-R1 et un groupe témoin sans traitement SAM-P8. Le régime alimentaire des 3 groupes de traitement a été complété par un régime mélangé avec différentes concentrations d'ECD : rendement de doses moyennes faibles (50 mg/kg), moyennes (150 mg/kg) et élevées (450 mg/kg) d'ECD par jour. . Les groupes témoins SAM-R1 et SAM-P8 sans traitement ont été nourris avec le même régime sans ECD. La mesure de la prise alimentaire de tous les animaux a été effectuée tous les trois jours tout au long de l'expérience. Pression artérielle et mois cardiaques pendant la durée de l'expérience pour déterminer l'état de santé des souris. La durée de vie de chaque souris était Des lymphocytes apoptotiques et nécrotiques viables ont été quantifiés à l'aide du kit Annexin V-FITC (Beijing Biosea Biotechnology Co., Ltd., Pékin, Chine). Les lymphocytes ont été soumis à une double coloration avec de l'annexine V marquée conjuguée à l'isothiocyanate de fluorescéine (Annexine V-FITC) et du propide en suspension dans 200 pi de tampon de liaison (HEPES/NaOH 10 mM,

2.2 Préparation d'extraits de Cistanche deserticola (ECD) et analyse HPLC.

Cistanche deserticola séchée à l'air et tranchée(2,0 kg) a été réduite en poudre et extraite deux fois avec de l'éthanol à 70 % pendant 1 heure. Les ratios plante/éthanol utilisés étaient de 1/6 (p/p) dans la première extraction et de 1/4 (p/p) dans la seconde. Les deux extraits ont été combinés et filtrés avant d'être concentrés à une densité relative de 1,10-1,15 sous pression réduite à 60 C. Ce concentré a ensuite été séché sous vide et la poudre résultante était l'extrait de Cistanche deserticola (ECD) utilisé tout au long de cette étude. .

Les composants de l'ECD ont été analysés par HPLC comme décrit précédemment [1]. En bref, 100 mg de poudre ECD a été dissous dans 10.0 mL H O et après filtration injecté dans la HPLC. L'analyse HPLC a été effectuée sur un système de chromatographie liquide Agilent 1100 (Agilent Co., USA). La phase mobile consistait en un mélange de méthanol (A) et d'acide méthanoïque à 0,10 % (B). Un programme de chromatographie en gradient a été utilisé ; c'était 26,5 % (A) et 73,5 % (B) en 0 à 7 min, 26,5 à 29,5 % (A) et 73,5 à 70,5 (B) en 8 à 10 min, et 29,5 % (A) et 70,5 % (B ) en 20–27 min. Le débit a été maintenu constant à 1,0 mL/min, le volume d'injection était de 10 mL et la température de la colonne a été maintenue à 25 C. Un détecteur UV réglé à 330 nm a été utilisé pour surveiller le débit de la colonne et générer des chromatogrammes.

Cistanche deserticola séchée et tranchée

Glycosides phényléthanoïdes et oligosaccharides de cistancheont été identifiés à partir de leurs temps de rétention et de leurs spectres d'absorption. La quantification a été effectuée par des courbes d'étalonnage standard externes. Le rendement deextraits de Cistanche deserticola(ECD) était d'environ 3,33 % et la teneur en phényléthanoïdes était de 17,94 %. L'actéoside et l'échinacoside étaient deux constituants majeurs de cette fraction, leur teneur étant respectivement de 3,80 % et 8,25 %. Les oligosaccharides représentent 82 % de l'ECD total. Les concentrations des principaux composants actifs de l'ECD sont présentées dans le tableau 1.

2.3 Analyse de la durée de vie des animaux.

Cette étude s'est attachée à déterminer siextraits de Cistanche deserticolasont capables de prolonger la durée de vie des souris SAM-R1 ont été achetés auprès du Centre d'élevage et de recherche d'animaux de laboratoire des souris SAM-P8 de l'Université de Pékin et d'inverser leur statut d'immunosénescence.

2.4. Analyses statistiques.

Les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes SD Les comparaisons entre les différents groupes ont été effectuées par ANOVA unidirectionnelle avec un test post hoc. Dans l'étude sur la durée de vie, les données ont été soumises à une analyse de survie de Kaplan-Meier, qui comprenait l'utilisation des tests Log-rank (Mantel-Cox) et Gehan-Breslow-Wilcoxon. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du package statistique pour les sciences sociales pour Windows (SPSS, solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) contenant 0.01 % d'azoture de sodium et soumise à une analyse FCM. Les sous-populations de lymphocytes ont été analysées par flux cytométrie à l'aide d'un cytomètre en flux FACS Calibur (BD Biosciences, San Diego, CA, USA) et du logiciel d'analyse BD CellQuest. Chicago, IL) et a comme étant significatif.

Glycosides phényléthanoïdes et oligosaccharides de cistanche

3. Résultats

Une valeur inférieure à 0.05 a été considérée.Évaluation de la viabilité cellulaire des lymphocytes T périphériques par annexine V-FITC et double coloration PI et analyse FACS. Après supplémentation alimentaire de souris SAM-P8 avec trois doses d'ECD pendant 4 semaines, les animaux ont été attachés pendant 12 heures puis anesthésiés, et le sang a été prélevé et analysé.

3.1. Analyse des composants actifs potentiels dans les extraits de Cistanche deserticola (ECD). Comme le montre le tableau 1, l'ECD est composé principalement de deux types de composés, les glycosides phényléthanoïdes et les oligosaccharides. Dans les glycosides phényléthanoïdes, l'échinacoside, l'actéoside et l'acide 8-épiloganique ont été identifiés, tandis que dans les oligosaccharides, seul le galactitol a été identifié.

3.2.TheImpactofCistancheddeserticolakbdO4ctsur la durée de vie moyenne des souris SAM-P8. Pour cette étude et les études ultérieures, des souris SAM-P8 mâles âgées de huit mois ont été divisées en 4 groupes. Parmi eux, un groupe de souris a été nourri avec un régime normal sans ECD, les 3 autres groupes ont ingéré séparément les régimes qui contiennent des proportions différentes d'ECD. Des souris de la sous-souche SAM-R1, qui ont un processus de vieillissement et une durée de vie normaux, ont été utilisées comme groupe témoin dans toutes les expériences.

Par rapport au groupe témoin SAM-R1, la durée de vie moyenne des souris SAM-P8 a été considérablement raccourcie (Figure 1 (a);<0.001). although="" supplementation="" of="" diet="" with="" the="" low="" dose(50mg/kg)of="" ecd="" failed="" to="" produce="" a="" significant="" increase="" in="" life="" spanofsam-p8mice,="" at="" the="" medium="" (150="" mg/kg)and="" high(450="" mg/ml)="" supplementary="" doses="" there="" was="" a="" dose-dependent="" increase="" in="" life="" span="" (figures="" 1(a)and=""><0.05 0.0thatwasconfirmedby="" kaplan-meier="" survival="" analysis,="" which="" included="" use="" of="" both="" the="" log-rank="" (mantel-cox)="" and="" gehan-breslow-wilcoxon="">

3.3. Inversion de l'immunosénescence chez les souris SAM-P8 par des extraits de Cistanche deserticola (ECD). Une diminution des lymphocytes T naïfs périphériques et une augmentation concomitante des lymphocytes T mémoire périphériques sont des caractéristiques importantes de l'immunosénescence qui sont largement considérées comme les principales causes sous-jacentes des anomalies immunologiques liées à l'âge. Cette immunosénescence dans SAM-P8 par rapport à SAM-R1

aniftalsv0assez évident lorsque l'analyse FACS devait dénombrer (CD3 plus CD44wCD4Bigh)lymphocytes comme indicateur de lymphocytes T naïfs et(CD3 plus CD44gh CD45 BR lymphocytes un indicateur san de lymphocytes T mémoire. Ainsi, dans le sang périphérique( Figure 2) et des populations de cellules spléniques (figure 3) des niveaux réduits de cellules T naïves et des niveaux accrus de cellules T mémoire ont été observés chez les souris SAM-P8. La supplémentation du régime alimentaire des souris SAM-P8 avec ECD s'est avérée capable d'inverser ces indicateurs d'immunosénescence à une dose- manière dépendante à la fois dans les populations de sang périphérique (Figure 2) et de cellules spléniques (Figure 3).En tant qu'indicateur supplémentaire de l'inversion de l'immunosénescence par la supplémentation ECD du régime alimentaire, le niveau de cellules naturalkiller [18], un marqueur cellulaire majeur du système immunitaire inné Cela a montré que la supplémentation en régime ECD entraînait une augmentation dose-dépendante des cellules NK (CD3 plus CD49 plus) dans les populations de lymphocytes du sang périphérique (Figure 4) et des cellules spléniques (Figure 5).

3.4. Des extraits de Cistanche deserticola renforcent l'intensité de fluorescence relative des cellules Sca-1 positives chez les souris SAM-P8. L'antigène des cellules souches-1(Sca-1) est l'un des biomarqueurs les plus importants des cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans les populations de cellules de la moelle osseuse. Les cellules Sca-1 positives représentent également des progéniteurs lymphocytaires qui ont été nouvellement exportés de la moelle osseuse vers le sang périphérique où ils subissent.

Figure 2 : Analyse FACS de l'effet de la supplémentation alimentaire avec ECD sur les lymphocytes T naïfs et mémoire dans le sang périphérique. Des souris SAM-P8 mâles et des souris SAM-RI témoins âgées de huit mois ont été divisées en 5 groupes. Les 3 groupes de traitement d'animaux SAM-P8 ont été nourris pendant quatre semaines avec des régimes complétés par des doses faibles (100 mg/kg), moyennes (500 mg/kg) et élevées (2500 mg/kg) d'ECD, et les deux animaux témoins

par déclenchement sur CD3 plus Tcels. Après un jeûne de 12 heures, du sang périphérique a été prélevé sur des sous-ensembles de cellules T RB anesthésiés et soumis à une analyse FACS, comme décrit à la section 5. dans le sang périphérique des différents groupes d'animaux. (c) Histogramme montrant le pourcentage de lymphocytes T à mémoire dans le sang périphérique des différents groupes d'animaux. Les barres représentent la moyenne ± ET (dans chaque groupe,=10).<0.05sam-p8versus>

Figure 3 : Analyse FACS de l'effet de la supplémentation alimentaire avec ECD sur les lymphocytes T naïfs et à mémoire dans la rate. Des souris mâles SAM-P8 et témoins SAM-RI âgées de huit mois ont été divisées en 5 groupes. avec des doses faibles (100 mg/kg), moyennes (500 mg/kg) et élevées (2 500 mg/kg) d'ECD et les deux groupes d'animaux témoins en gating sur CD3 plus les cellules T. Les lignes affichées sur chaque graphique indiquent qu'il doit être utilisé pour distinguer le CD44z du CD45 bw utilisé pour permettre l'identification des naïfs（CD3 plus CD "CsRB动）et de la mémoire（CD3 plus CD42CD I'm）Tcels.（b）Histogramme montrant ont été alimentés sur le même régime sans supplémentation Après un jeûne de 12 heures, des lymphocytes spléniques ont été prélevés sur des sous-ensembles de cellules T RB anesthésiés et soumis à une analyse FACS, tous décrits à la section 5. (a) FACSplots représentatifs des différents groupes de micro générés.

Figure 4 : Les effets de la supplémentation alimentaire ECD sur les cellules tueuses naturelles (cellules NK, CD3 plus CD49 plus cellules T) dans les populations de lymphocytes du sang périphérique de souris SAM-P8. Des souris SAM-P8 mâles de huit mois et des souris SAM-RI témoins ont été divisées en 5 groupes. Les 3 groupes de traitement d'animaux SAM-P8 ont été nourris pendant quatre semaines avec des régimes complétés par des doses faibles (100 mg/kg), moyennes (500 mg/kg) et élevées (2500 mg/kg) d'ECD et les deux groupes d'animaux témoins étaient pour le même régime sans supplémentation. Après un jeûne de 12 heures, du sang périphérique a été prélevé sur des animaux anesthésiés et soumis à une analyse FACS, comme décrit dans la section 5. (a) Parcelles FACS représentatives des différents groupes de souris générés par gating sur CD3 plus CD49 plus cellules T. (b) Histogramme montrant le pourcentage de cellules T tueuses naturelles dans le sang périphérique des différents groupes d'animaux. Les barres représentent la moyenne ± ET (dans chaque groupe,=10).=<0.01><0.01 each="" treatedgroup="" versussam-p8group="" (byone="" way="" anovawith="" post="" hoc="">

Figure 5 : Les effets de la supplémentation alimentaire ECD sur les cellules tueuses naturelles (cellules NK, CD3 plus CD49 plus cellules T) dans les lymphocytes spléniques de souris SAM-P8. Des souris SAM-P8 mâles âgées de huit mois et des souris SAM-RI témoins ont été divisées en 5 groupes. Les 3 groupes de traitement d'animaux SAM-P8 ont été nourris pendant quatre semaines avec des régimes complétés par des doses faibles (100 mg/kg), moyennes (500 mg/kg) et élevées (2 500 mg/kg) d'ECD et les deux groupes d'animaux témoins ont été nourris avec le même régime sans supplémentation. Après un jeûne de 12 heures, des lymphocytes spléniques ont été prélevés sur des animaux anesthésiés et soumis à une analyse FACS comme décrit à la section 5. (a) FACSplots représentatifs des différents groupes de souris générés par gating sur des cellules T CD3 plus CD494. (b) Histogramme montrant le pourcentage de tueur naturel T cellules dans les lymphocytes spléniques des différents groupes d'animaux. Les barres représentent l'écart-type moyen (dans chaque groupe,=10), # < 0,01 sam-p8="" yersus=""><0.01 eachtreatedgroup="" versussam-p8group(by="" oneway="">

Différenciation plus poussée en divers types de lymphocytes matures. Par conséquent, ces cellules Sca-1 positives représentent la principale source de lymphocytes T naïfs dans le sang périphérique. La figure 6 montre que, par rapport aux souris témoins SAM-R1, l'intensité de fluorescence relative des cellules Sca-1 positives chez les souris SAM-P8 était nettement inférieure. Il a été démontré que la supplémentation alimentaire des souris SAM-P8 avec trois doses différentes d'ECD améliore significativement l'intensité de fluorescence relative des cellules Sca-1 positives (Figure 6).

Bénéfice de l'herbe de cistanche : anti-âge