Partie 1|L'extrait de Herba Cistanche améliore la génération d'ATP mitochondrial dans les cœurs de rat et les cellules H9c2

Contact : emily.li@wecistanche.com

Hoi Yan Leung et Kam Ming Ko

Département de biochimie, Université des sciences et technologies de Hong Kong, Clear Water Bay, RAS de Hong Kong, Chine

Mots-clés : ATP,Cistanche désertique, cellules H9c2, cœur, mitochondries

Résumé

Pour étudier la base pharmacologique de la "Yang - revigorant" action de Herbal Cistanche [la plante entière séchée deCistanche désertiqueYC Ma (Orobanchaceae)], en médecine chinoise, les effets de l'extrait au méthanol d'Herba Cistanche sur la capacité de génération d'ATP mitochondriale ont été examinés à l'aide d'un modèle de cœur de rat ex vivo et d'un test de cellules H9c2 in situ. Le traitement avec l'extrait d'Herba Cistanche a augmenté la capacité de génération d'ATP mitochondriale du myocarde de manière dose-dépendante chez les rats, telle qu'évaluée par des mesures in vitro. La stimulation de la capacité de génération d'ATP était associée à une amélioration parallèle du transport d'électrons mitochondrial pris en charge par le pyruvate mais pas par le succinate. Le traitement par Herba Cistanche a également augmenté les activités du complexe myocardique mitochondrial I et du complexe III, l'étendue de la stimulation de l'activité du complexe I étant plus importante. Le traitement Herba Cistanche a produit une augmentation dépendante de la dose et du temps de la capacité de génération d'ATP mitochondriale dans les cellules H9c2. Les résultats indiquent que le traitement Herba Cistanche peutaugmenter la génération d'ATP mitochondrialdans des cœurs de rat ex vivo et des cellules H9c2 in situ, éventuellement paraméliorant la phosphorylation oxydative.

Cistanche peut améliorer la fonction cardiaque, abaisser la tension artérielle et réduire les lipides sanguins

Introduction

La « revigoration Yang », qui incarne l'amélioration généralisée de la fonction corporelle dans la médecine chinoise, implique l'utilisation de l'énergie dans la conduite de divers processus biochimiques.

À cet égard, l'ATP, qui est la monnaie universelle d'énergie pour alimenter la fonction cellulaire, est principalement générée par la phosphorylation oxydative dans les mitochondries. Nous avons postulé que les herbes "vivifiantes Yang"possèdent la capacité d'augmenter la capacité de génération d'ATP mitochondriale(Ko et al., 2004). Ceci est étayé par notre découverte récente selon laquelle les herbes tonifiantes chinoises "vivifiantes pour le Yang" mais pas "nourrissantes pour le Yin" pourraient améliorer la capacité de génération d'ATP myocardique dans le cœur de souris ex vivo (Ko et al., 2006). Herba Cistanche, la plante parasite entière séchée (à l'exclusion de la fleur) de Cistanche deserticola YC Ma (Orobanchaceae), est classée comme'Herbe tonifiante "vivifiante du Yang" dans la médecine traditionnelle chinoise (Chen, 1998), et elle apparaît comme l'ingrédient le plus populaire dans un certain nombre de formulations brevetées chinoises utilisées pour la "vivification du Yang". En Chine et au Japon, Herba Cistanche est largement utilisé pour le traitement d'une multitude de symptômes de carence en Yang. Des études pharmacologiques ont indiqué que Herba Cistanche pouvaitpiéger les radicaux libres(Xiong et al., 1996),produire un sédatif(Lu, 1998),anti-âge(Lee et al., 1990),effets antinociceptifs et anti-inflammatoires(Lin et coll., 2002), etaméliorer la fonction immunitaire(Wu et al., 2005). Le principal ingrédient actif de Herba Cistanche estglycosides phényléthanoïdes(Ouyang et al., 2003), qui se sont avérés avoirantibactérien, antistress et antioxydant(Xiong et al., 1998), ainsi que des effets anti-apoptotique sur les neurones en culture (Tian & Pu, 2005). Dans la présente étude, afin d'étudier la base pharmacologique de l'action vivifiante Yang de Herba Cistanche, les effets du traitement Herba Cistanche sur la capacité de génération d'ATP dans les mitochondries isolées de cœurs de rat ex vivo et de cardiomyocytes H9c2 cultivés in situ ont été examinés. Pour explorer le mécanisme biochimique sous-jacent à l'action d'amélioration de la génération d'ATP, les effets du traitement Herba Cistanche sur le transport d'électrons mitochondrial et les activités complexes I – IV ont également été examinés dans le cœur de rats.

Les ingrédients efficaces de Cistanche peuvent piéger divers radicaux libres d'oxygène actif

Matériaux et méthodes

Produits chimiques, culture cellulaire et matériaux à base de plantes

L'ATP, l'ADP et le 3-[4,5-diméthylthiozol-2-yl]-2,5-bromure de diphényltétrazolium (MTT) ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, États-Unis). La solution de luciférase (ATPlite) a été obtenue auprès de PerkinElmer (Boston, MA, USA). Le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et le sérum de veau fœtal (FBS) ont été achetés auprès de GIBCO BRL Life Technologies (Grand Island, NY, USA). La lignée cellulaire H9c2 a été achetée chez ATTC (Rockville, MD, USA). Herba Cistanche a été fourni par un revendeur local d'herbes (Lee Hoong Kee). L'herbe a été authentifiée par le fournisseur et un spécimen de référence (HKUSTY00301) a été déposé au Département de biochimie de l'Université des sciences et technologies de Hong Kong (HKUST).

Extraction de plantes

Herba Cistanche (100g) a été coupé en petits morceaux puis extrait par chauffage au reflux dans 300 mL de méthanol à 65◦C pendant 2 h. La procédure a été répétée deux fois. L'extrait regroupé a été séché en évaporant le solvant sous pression réduite, et l'extrait au méthanol d'Herba Cistanche a été obtenu avec un rendement de 39 % (p/p). L'analyse chimique a indiqué que l'extrait au méthanol d'Herba Cistanche contenait des saponines totales, des flavonoïdes totaux, des lignanes totaux et des polysaccharides à des concentrations de 1,62 % (p/p), 0,08 %, 0,15 % et 75,6 %, respectivement.

Soins aux animaux

Des rats Sprague-Dawley mâles adultes (8 à 10 semaines ; 250 à 300 g) ont été maintenus sous un cycle d'obscurité/lumière de 12- h dans une pièce à air/humidité contrôlée à environ 22 °C et ont reçu de la nourriture et de l'eau à volonté. dans les installations de soins aux animaux à HKUST. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le Research Practice Committee de HKUST.

Traitement médical

Les animaux ont été divisés au hasard en groupes, avec cinq à six animaux dans chacun. Dans les groupes de traitement, les rats ont reçu par voie intragastrique l'extrait méthanolique d'Herba Cistanche (dissous/suspendu dans l'eau) à des doses quotidiennes croissantes ({{0}}.031–0,5 g/kg) pendant 3 jours. Les animaux témoins n'ont reçu que de l'eau. Vingt-quatre heures après le dernier dosage, le cœur a été prélevé sur des animaux anesthésiés au phénobarbital et soumis à une analyse biochimique.

Préparation de fractions mitochondriales et mesure de la capacité de génération d'ATP (ATP-GC) ex vivo

Des échantillons de tissu ventriculaire gauche cardiaque ont été excisés et rincés avec un tampon isotonique glacé (0.32 M de saccharose, 1 mM d'EDTA, 50 mM de Tris/HCl, pH 7,4). Des fractions mitochondriales cardiaques ont été préparées par centrifugation différentielle dans un tampon isotonique à 4◦C. Un homogénéisat cardiaque à 10 % (p/v) a été préparé en homogénéisant le tissu ventriculaire haché avec un homogénéisateur en verre téflon à 4 000 tr/min pendant 20 à 30 coups complets. L'homogénat a été centrifugé à 600 × g pendant 10 min pour éliminer les noyaux et les débris cellulaires. Le surnageant a ensuite été centrifugé à 8000 × g pendant 30 min pour sédimenter les mitochondries (Evan, 1992). Les culots ont été remis en suspension dans 1 mL du tampon isotonique et reconstitué les fractions mitochondriales. L'ATP-GC mitochondrial des animaux non traités a été mesuré par la méthode de Leung et al. (2005)

Les polysaccharides de Cistanche peuvent retarder la dégénérescence physiologique des organes et la dégénérescence de la morphologie cellulaire

Mesure du transport d'électrons mitochondrial

La mesure du transport d'électrons dans des mitochondries isolées, qui est basée sur la réduction du MTT, telle que réalisée [1] formée comme décrit par Cohen et al. (1997). Les mitochondries ont été préparées à une concentration de protéines de 1 mg/mL avec un tampon d'incubation (saccharose 250 mM, HEPES 50 mM, KH2PO4 10 mM, MgCl2 2 mM, EGTA 1 mM, pH 7,4) . Une aliquote (40 µL) des mitochondries a été mélangée avec 100 µL chacun de 15 mM de pyruvate ou 0,5 mM de succinate et 0,42 mg/mL de MTT. Le mélange réactionnel a été incubé à 37°C pendant 10 min sous agitation douce. Après l'incubation, le mélange réactionnel a été terminé par l'ajout de 100 µL de tampon de lyse (10 %, p/v, dodécylsulfate de sodium et 45 % de diméthylformamide, ajusté à pH 4,7 avec de l'acide acétique glacial). Après un repos de 5 min, des lectures d'absorbance du mélange réactionnel ont été prises avec un lecteur de plaque de microtitration (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) et rapportées comme la différence entre 570 nm et 630 nm. Les données ont été exprimées en pourcentage de la valeur moyenne du groupe témoin (c.-à-d. Herba Cistanche – non traité).

Culture de cellules

Les cellules H9c2, une lignée cellulaire permanente dérivée de myoblastes cardiaques (Hescheler et al., 1991), ont été cultivées sous forme de monocouches dans du DMEM additionné de 10 % (v/v) de FBS. Le milieu contenait du glucose (4,5 g/L) et de la glutamine (4,5 mM), additionnés de NaHCO3 (17 mM), de pénicilline (100 UI/mL) et de streptomycine (100 µg/mL). Toutes les cellules ont été cultivées sous une atmosphère de 5 % (v/v) de CO2 dans l'air à 37◦C. Le milieu était remplacé par du milieu frais tous les 2 ou 3 jours. Un stock de cellules a été cultivé dans un flacon de culture de 75 cm2 et divisé avant confluence à un rapport de sous-culture de 1:10. Pour le dosage ATP-GC, les cellules H9c2 ont été ensemencées à une densité de 2,5 × 104 cellules/puits dans une plaque à puits 24-. Après la fixation des cellules, l'extrait d'Herba Cistanche (dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate; PBS) a été appliqué dans le milieu et les cellules ont été incubées pendant des périodes croissantes (2 à 16 h). Les cellules témoins (non traitées) ont reçu uniquement le PBS.

Mesure de l'ATP-GC in situ

Après les périodes d'incubation indiquées avec l'extrait HerbaCistanche à des concentrations croissantes (5{{10}}–300µg/mL), le test ATP-GC a été effectué. Le milieu a été aspiré et les cellules ont été traitées avec de la digitonine (50 µg/mL) dans un tampon d'incubation (120 mM KCl, 5 mMKH2PO4, 2 mM EGTA, 10 mM HEPES, 0,1 mM MgCl2, 0,5 % BSA, pH 7,4) pendant 3 min à 37 ◦C. Après aspiration de la digitonine, du glutamate (5 mM), du malate (5 mM) et de l'ADP (60 uM) ont été ajoutés aux cellules pour la génération d'ATP mitochondrial, qui a été surveillée à des intervalles de temps croissants allant de 0 à 15 min. La réaction a été terminée par l'ajout de 60 µL d'acide perchlorique (30 %, p/v), et les mélanges réactionnels ont ensuite été centrifugés à 600 × g pendant 10 min à 4°C. Une aliquote (120 µL) du surnageant a été mélangée avec 90 µL de KHCO3 1,4 M pour la neutralisation. Les mélanges ont été centrifugés à nouveau à 600 × g à 4◦C, et les surnageants ont été mesurés pour la teneur en ATP comme décrit précédemment. L'ATP-GC des cellules non traitées a été estimée en calculant l'aire sous la courbe du graphique (AUC1) traçant l'ATP généré (nmol/mg de protéine) en fonction du temps (0 à 15 min) et exprimé en unités arbitraires. Pour les cellules traitées avec HerbaCistanche, les valeurs AUC1 des temps d'incubation croissants (3, 5, 7, 10 et 15 min) ont été normalisées à une valeur de contrôle moyenne respective à partir d'échantillons non traités et exprimées en pourcentage de contrôle. Ensuite, l'aire sous la courbe (AUC2) du graphique traçant les valeurs de contrôle en pourcentage par rapport au temps d'incubation (3 à 15 min) a été calculée et exprimée en unités arbitraires. Les données des groupes traités avec Herba Cistanche ont été exprimées en pourcentage du contrôle à partir de l'équation :

[ASC2(HerbaCistanche − traité)/ASC2(non traité)]×100 %

Mesures des activités du complexe I–IV et de la citrate synthase

Les activités des complexes I-III de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale (ETC) ont été mesurées par des méthodes spectrophotométriques utilisant des substrats spécifiques au complexe (NADH pour le complexe I, succinate pour le complexe II et décylubiquinol pour le complexe III) comme décrit (Grad & Lemire, 2004; Hsu et al. , 2005; Mark et al., 2001). L'activité du complexe IV a été mesurée en utilisant un kit de dosage de la cytochrome c oxydase de Sigma. L'activité citrate synthase mitochondriale a été mesurée par la méthode de Srere (1969).

Dosage des protéines

Les concentrations de protéines des fractions mitochondriales et des lysats cellulaires ont été déterminées à l'aide d'un kit d'analyse de protéines BioRad utilisant de l'albumine de sérum bovin comme standard ({{0}}.038–0.600mg/mL).

analyses statistiques

Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Ils ont été analysés par analyse de variance à un facteur (ANOVA). Des comparaisons multiples post hoc ont été effectuées avec le LSD. Valeurs P<0.05 were="" regarded="" as="" statistically="">

Résultats

Effets du traitement Herba Cistanche sur l'ATP-GC myocardique mitochondrial chez le rat

Comme le montre la figure 1, le traitement avec l'extrait d'Herba Cistanche à des doses allant jusqu'à 0 0,5 g/kg a augmenté l'ATP-GC mitochondrial myocardique de manière dose-dépendante chez les rats, le degré de stimulation étant de 89 % à une dose de 0.5 g/kg.

Effets du traitement Herba Cistanche sur le transport d'électrons mitochondrial dans le cœur des rats

L'étendue du transport d'électrons dans des mitochondries isolées a été mesurée en surveillant la réduction du MTT. Le substrat utilisé pour le dosage était soit du pyruvate soit du succinate.

Figure 1. L'effet du traitement Herba Cistanche sur la capacité de génération d'ATP mitochondriale dans le cœur de rat ex vivo

Chaque barre représente la moyenne ± SEM, avec n {{0}}. Les animaux ont été traités par voie orale avec HerbaCistanche aux doses quotidiennes indiquées pendant 3 jours. La capacité de génération d'ATP a été mesurée comme décrit dans "Matériels et méthodes". Les données ont été exprimées en pourcentage de contrôle par rapport aux valeurs (AUC2) du groupe de contrôle respectif non traité. ∗ Significativement différent du groupe témoin non traité respectif ; significativement différent du groupe traité avec Herba Cistanche à 0,5 g/kg.

Figure 2. Effets du traitement Herba Cistanche sur le transport d'électrons mitochondrial dans le cœur des rats

Chaque barre représente la moyenne ± SEM, avec n {{0}}. (a) Le transport d'électrons mitochondrial supporté par le pyruvate (b) supporté par le succinate a été mesuré par réduction du MTT, comme décrit dans "Matériels et méthodes". Les données ont été exprimées en pourcentage de valeurs témoins non traitées [supporté au pyruvate : OD570nm− OD630nm =0.0206 ± 0,0001 (SEM), n {{ dix}}; pris en charge par le succinate : mâle, 0,255 ± 0,015, n=5]. ∗ Significativement différent du groupe témoin non traité respectif ; significativement différent du groupe 0,5 g/kg.

Comme le montre la figure 2a, le traitement Herba Cistanche a augmenté de manière dose-dépendante l'étendue du transport d'électrons mitochondrial soutenu par le pyruvate dans le cœur des rats, la stimulation optimale étant observable à des doses de 0,5 g/kg. Cependant, aucun changement significatif dans l'étendue du transport d'électrons mitochondrial soutenu par le succinate n'a été détecté dans les cœurs de rats traités avec Herba Cistanche (Fig. 2b).

Pour la partie 2,cliquez ici s'il vous plait.