Partie 1: Cartographier l'interaction épigénomique et transcriptomique pendant la formation et le rappel de la mémoire dans l'ensemble d'engrammes hippocampiques

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Asaf Marco1,2,*, Hiruy S. Meharena1,2, Vishnu Dileep1,2, Ravikiran M. Raju1,4, Jose Davila-Velderrain3, Amy Zhang2, Chinnakkaruppan Adaikkan1,2, Jennie Z. Young1,2, Fan Gao1, Manolis Kellis3,5, Li-Huei Tsai1,2,5,*

1Institut Picower pour l'apprentissage etMémoire, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, États-Unis.

2Département des sciences cérébrales et cognitives, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, États-Unis.

3Laboratoire d'informatique et d'intelligence artificielle, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts, États-Unis.

4Division of Newborn Medicine, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, États-Unis.

5Broad Institute de Harvard et MIT, Cambridge, Massachusetts, États-Unis.

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Résumé

L'épigénome et l'architecture tridimensionnelle (3D)-génomique apparaissent comme des facteurs clés dans la régulation dynamique des différents programmes transcriptionnels nécessaires aux fonctions neuronales. Ici, nous utilisons un système de marquage dépendant de l'activité chez la souris pour déterminer l'état épigénétique, l'architecture du génome 3D et le paysage transcriptionnel des cellules engrammes au cours de la durée de vie deMémoireformation et rappel. Nos découvertes révèlent queMémoirel'encodage conduit à un événement d'amorçage épigénétique, marqué par une accessibilité accrue des activateurs sans modifications transcriptionnelles correspondantes.Mémoirela consolidation entraîne par la suite une réorganisation spatiale de grands segments de chromatine et des interactions promoteur-amplificateur. Enfin, avec la réactivation, les neurones engrammes utilisent un sous-ensemble d'interactions de novolong range, où des activateurs amorcés ont été mis en contact avec leurs promoteurs respectifs pour réguler à la hausse les gènes impliqués dans la traduction locale des protéines dans les compartiments synaptiques. Collectivement, notre travail élucide la transcription complète et les utilisateurs peuvent afficher, imprimer, copier et télécharger du texte et extraire des données du contenu de ces documents, à des fins de recherche universitaire, sous réserve toujours des conditions d'utilisation complètes : http://www.nature. com/authors/editorial_policies/license.html#terms

*Correspondance à : marcoa@mit.edu. lhtsai@mit.edu.

Les contributions de l'auteur:

AM et L.-HT ont conceptualisé et conçu le projet. AM et AZ ont effectué des expériences comportementales, ISH, immunocoloration et analyse MARIS. CA a effectué l'injection de virus et les immunocolorations. AM et HSM ont effectué des expériences ATAC-seq. AM et AZ ont effectué des expériences d'ARN-seq nucléaire. AM, HSM et VD ont réalisé des expériences pc-Hi-C et Hi-C. AM, HSM, VD, RMR et JDV ont effectué une analyse ATAC-seq. AM, RMR, HSM, VD et FG ont effectué une analyse d'ARN-seq nucléaire. AM, VD, HSM et RMR ont effectué une analyse pc-Hi-C et Hi-C. Tous les auteurs ont aidé à interpréter les données. AM, HSM, VD, RMR, JZY, MK et LHT ont rédigé le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs. LHT a fourni les outils et supervisé le projet.

Intérêts concurrents :

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

le paysage épigénomique tout au long de la vieMémoireformation et rappel dans l'ensemble des engrammes hippocampiques.

La formation et la préservation des souvenirs à long terme dépendent de l'expression coordonnée des gènes et de la synthèse des protéines synaptiques1. Ces processus moléculaires agissent au sein d'une population spécifique de neurones, appelés cellules engrammes2–4. Des approches récentes utilisant l'expression dépendante de l'activité des rapporteurs ont fourni un cadre pour explorer l'ensemble d'engrammes5–8, mais les mécanismes moléculaires qui régissentMémoirele stockage et la récupération restent mal compris. Plus précisément, les modifications épigénétiques et l'architecture génomique 3D apparaissent comme un facteur clé dans la régulation dynamique de l'expression des gènes9–17, et on apprécie de plus en plus leur importance dans la fonction neuronale, le développement et la maladie14, 16, 18

Ici, nous avons utilisé le modèle de souris Targeted Recombination in Active Populations (TRAP)5,6, dans lequel les neurones activés exprimant le gène Activity Regulated Cytoskeleton Associated Protein (Arc) sont marqués en permanence de manière inductible. Neurones activés pendantMémoirel'encodage, la consolidation et le rappel ont été triés et soumis au séquençage de l'ARN nucléaire (nRNA-seq), au dosage de la chromatine accessible à la transposase par séquençage (ATAC-seq) et à la capture de la conformation chromosomique (Hi-C). Nos données démontrent queMémoirel'encodage conduit à une augmentation de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome, sans changements attendus dans l'expression des gènes. De plus, nous démontrons que la phase tardive de consolidation de la mémoire était associée à la relocalisation de grands segments de chromatine (sous-compartiments) d'environnements inactifs à permissifs et à la réorganisation du paysage d'interaction promoteur-amplificateur. Enfin, la réactivation des neurones au coursMémoirele rappel est associé à des interactions denovopromoteur-amplificateur, utilisant un grand sous-ensemble d'amplificateurs qui ont été amorcés pendantMémoirecodage. Ces interactions promoteur-amplificateur sont associées à un changement robuste dans l'expression des gènes impliqués dans la synthèse protéique locale et la morphogenèse synaptique.

Résultats

Identification temporelle et spatiale des cellules engrammes activées et réactivées

Le suivi de l'activité neuronale au fil du temps a été l'un des principaux défis lors de l'étude des cellules engrammes, car les marqueurs de l'activité neuronale, connus sous le nom de gènes précoces immédiats (IEG), reviennent à la ligne de base peu après l'induction1,2. Pour surmonter cette limitation, nous avons profité du modèle TRAP5,6, qui nécessite deux transgènes, l'un qui exprime CreERT2 à partir d'un promoteur Arc dépendant de l'activité et l'autre qui permet l'expression du rapporteur de la protéine fluorescente jaune (eYFP), dans un Cre- manière dépendante. L'administration de tamoxifène (TAM) aux souris TRAP entraîne une étiquette eYFP permanente dans les neurones de l'Arc activés. Sans TAM, CreERT2 est retenu dans le cytoplasme et eYFP n'est pas exprimé (Extended Data Fig. 1a). Les souris TRAP ont été soumises au paradigme pavlovien classique du conditionnement contextuel de la peur (CFC) (Fig. 1a), une méthode couramment utilisée pour étudier les souvenirs aversifs19. Environ 1,5 à 2 heures après l'exposition au FS, les cerveaux ont été prélevés pour identifier i) l'homologue 3 de la protéine de liaison à l'ARN fox-1 (Rbfox3) également connu sous le nom de NeuN plus et eYFP plus les neurones marqués qui ont été activés lors de l'exposition initiale (Activated -précoce), qui peuvent être distingués de ii) NeuN plus / eYFP- neurones à l'état basal non activés (Basal) (Fig. 1a). Après cinq jours, en l'absence de récupération, nous avons collecté iii) les neurones NeuN plus / eYFP plus qui ont été marqués le jour de la formation, indiquant une longue duréeMémoireconsolidation (Activé-tardif). Dans un

cohorte différente, les souris ont été réexposées au stimulus conditionné et l'expression ultérieure de la protéine ARC endogène a été dosée 1,5 à 2 heures après la réexposition. Cela a permis l'identification de iv) neurones doublement positifs NeuN plus / eYFP plus / endogènes Arc plus engrammes qui ont été activés pendant l'entraînement et réactivés pendantMémoirerappel (réactivé). Notamment, bien que la recombinaison de l'ADN ne se produise pas complètement 1,5 à 2 h après le FS, nous avons observé une co-localisation élevée (moyenne de 84%) entre la protéine Arc endogène et le rapporteur Arc: eYFP (Extended Data Fig. 1b), qui était également conforme aux rapports précédents20.

ConfirmerMémoirel'encodage et le rappel pendant le CFC, le comportement de congélation a été enregistré pendant l'entraînement et la réexposition à des signaux induisant la peur (Extended Data Fig. 1c). Conformément aux publications précédentes6,20, nos données ont montré une augmentation significative du nombre de neurones eYFP plus (Activated-early and -late) dans l'hippocampe, par rapport aux souris restées naïves au CFC dans leur cage domestique (F (2, 70)=240.3, P<0.0001, fig.="" 1b).="" activity-dependent="" tagging="" was="" also="" negligible="" (~1%)="" in="" the="" absence="" of="" tam="" induction="" (fig.="" 1c,="" extended="" data="" fig.="" 1d).="" with="" tamoxifen="" treatment,="" we="" observed="" a="" wide="" distribution="" of="" activity-labeled="" populations="" across="" all="" hippocampal="" sub-regions,="" where="" early="" activation="" was="" predominantly="" observed="" in="" the="" dg="" and="" late="" tagging="" was="" most="" abundant="" in="" the="" ca1="" (fig.="" 1d).="" to="" further="" interrogate="" the="" specificity="" of="" engram="" formation,="" we="" subjected="" trap="" mice="" to="" cfc="" learning="" in="" context="" a="" and="" then="" exposed="" them="" 5="" days="" later="" to="" the="" same="" context="" (a-a)="" or="" a="" novel="" neutral="" context="" b="" (a-b)="" (fig.="" 1e,="" extended="" data="" fig.="" 1e).="" we="" found="" comparable="" numbers="" of="" activated="" –late="" neurons="" in="" both="" groups="" (p="0.9)" and="" significantly="" fewer="" reactivated="" neurons="" in="" the="" a-b="" group=""><0.0001, fig.="" 1f;="" extended="" data="" fig.="" 1f),="" confirming="" that="" the="" reactivated="" cells="" play="" a="" key="" role="" in="" encoding="" prior="">

La formation de la mémoire est associée à une accessibilité accrue de la chromatine, principalement sur les activateurs

Pour mieux comprendre les forces moléculaires qui régissent les différents programmes de transcription, nous avons mesuré les changements à l'échelle du génome de l'accessibilité de la chromatine à travers différentes phases deMémoire. Les tissus hippocampiques ont été regroupés et les noyaux isolés (données étendues Fig. 2a, tableau supplémentaire 1) ont été soumis à la préparation de la bibliothèque ATAC-seq. L'analyse des régions différentiellement accessibles (DAR) (Diffbind, mode DESeq2) entre toutes les populations (Fig. 2a) a révélé que la plupart des changements d'état de la chromatine se produisent au cours de la phase précoce de la formation de la mémoire, où 7, 862 régions du génome gagnent accessibilité (basale vs. précoce, tableau supplémentaire 2). En revanche, nous avons observé des changements relativement minimes dans l'état de la chromatine lors de la transition d'activé-précoce à activé-tardif (582 DAR) et entre les neurones activés-tardifs et réactivés (725 DAR), avec un chevauchement de 48 % entre eux (Extended Data Fig. 2b ). Remarquablement, nous avons identifié un pourcentage élevé (52%) de DAR acquis de manière stable qui sont devenus plus accessibles dans les neurones activés-précoces et sont restés accessibles à la fois dans les neurones activés-tardifs et réactivés (Fig. 2b, c; Tableau supplémentaire 2). Fait intéressant, alors que les changements précoces (Basal vs. Early) et les DAR acquis de manière stable étaient enrichis pour les régions intergéniques, les changements tardifs de la chromatine (Early vs. late et Late vs. Reactivated) étaient principalement enrichis pour les sites promoteurs (Fig. 2d).

Un aperçu fonctionnel a été fourni en évaluant comment les DAR sont marqués par différentes modifications d'histones. Nous avons d'abord utilisé ChromHMM pour établir un modèle d'état de la chromatine à partir de deux études indépendantes qui utilisaient du tissu d'hippocampe en vrac avant et après le choc du pied 21,22. Ensuite, nous avons effectué une analyse d'enrichissement en plis (observée sur la distribution attendue) des DAR pour ces différents états et avons révélé que les changements précoces de la chromatine et les DAR stables étaient enrichis pour les marques d'amplificateurs (Fig. 2e; Données étendues Fig. 2c, Tableau supplémentaire 3) .

Ces résultats sont conformes aux publications précédentes, montrant que la stimulation de la culture neuronale primaire induit une activité activatrice prolongée12,23. Ensuite, nous avons analysé le chevauchement des locus stables individuels avec H3K4me1 et H3K27ac21. Ces deux marques d'histones délimitent différentes populations d'amplificateurs, qui peuvent être soit « amorcés » (uniquement H3K4me1), « actifs » (H3K4me1 et H3K27ac) ou « latents » (pas de marques)18. Les pics stables ont montré une distribution entre les activateurs amorcés et actifs (Extended Data Fig. 2d), où 47% de ces sites étaient prédits comme étant "latents" (aucun chevauchement entre les DAR et les marques d'histones21 obtenues 1h après FS). Pour confirmer notre modèle, nous avons effectué une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour les marqueurs d'histone H3K4me1 et H3K27ac, suivie d'une qPCR. Quatre sites sélectionnés ont été choisis à partir de notre analyse de modélisation des amplificateurs putatifs (Extended Data Fig. 2d ; Enhancer 1 - prédit amorcé, Enhancer 2- prédit actif, Enhancer 3 et 4 - prédit latent). En accord avec notre modèle, nous avons identifié deux locus « latents » à l'état basal (Enhancers 3 et 4) qui se sont transformés en un état « actif » au cours deMémoireformation (Fig. 2f). De plus, l'amplificateur putatif 1 s'est avéré «amorcé» à l'état basal et est devenu actif, où il y a eu une augmentation stable et significative des marqueurs H3K27ac au cours de la phase tardive et du rappel (Fig. 2f). Ensemble, ces données indiquent que le répertoire des activateurs nouvellement accessibles a été élargi dans les neurones engrammes potentialisés, où les régions latentes ou amorcées ont acquis les marques H3K4me1 et H3K27ac et sont ainsi devenues des activateurs actifs.

Pour comprendre le rôle fonctionnel des promoteurs accessibles et des régions activatrices, nous avons effectué une analyse d'enrichissement de motifs (tableau supplémentaire 4). Nos données indiquent que la majorité (70 %) des motifs sur les promoteurs accessibles sont également enrichis et ont été identifiés à toutes les phases deMémoire(Données étendues Fig. 2e). En revanche, la majorité des sites amplificateurs ont montré des modèles distincts de motifs de liaison au facteur de transcription (TF) à travers différentes phases de mémoire. Fait intéressant, les motifs exprimés de manière omniprésente du proto-oncogène Jun, de la sous-unité du facteur de transcription Ap -1 (c'est-à-dire Jun-Ap1) et de la famille des TF du facteur régulateur X (Rfx), n'ont été significativement enrichis qu'après la phase initiale de codage (Extended Data Fig. 2e). Il a été rapporté précédemment que le complexe Jun-Ap1 joue un rôle central dans la sélection des amplificateurs et pourrait agir comme un TF pionnier pour définir les sites des amplificateurs au cours du développement cérébral et de l'activité neuronale. Ces résultats sont cohérents avec nos données qui montraient un pourcentage élevé de locus latents / amorcés à l'état basal (Fig. 2f, Données étendues Fig. 2c, d). Par conséquent, il semble que l'activité neuronale pourrait déclencher la liaison de Jun-Ap1 aux activateurs latents, qui recrutent alors des modificateurs de la chromatine qui activent les activateurs latents. De même, l'enrichissement des motifs du facteur de transcription Yin Yang 1 (Yy1) uniquement dans les amplificateurs des états précoces et tardifs, suggère que l'organisation promoteur-amplificateur est un processus actif deMémoireformation, car il a été récemment rapporté que Yy1 facilite la formation de ces interactions à longue portée25. Collectivement, ces données suggèrent que la phase initiale deMémoireLa formation modifie le paysage d'accessibilité de la chromatine dans les neurones activés, avec des changements stables de longue durée se produisant principalement dans les régions activatrices.

Changements dynamiques de l'architecture nucléaire spatiale et de l'accessibilité de la chromatine au cours de laMémoireformation correspondent à une augmentation de la fréquence des interactions promoteur-activateur pendantMémoirerappeler

L'architecture nucléaire 3D apparaît comme un facteur clé dans la régulation dynamique de l'expression des gènes, dans de nombreuses fonctions neuronales26-28. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à délimiter les changements précis qui se produisent dans l'organisation spatiale de la chromatine au cours deMémoireconstitution et consolidation. Nous avons produit des données Hi-C à partir de l'état basal et de l'eYFP plus des neurones marqués (précoces et tardifs, tableau supplémentaire 5). La chromatine est séparée en deux compartiments sous-nucléaires spatialement distincts, « A » et « B », correspondant à la chromatine transcriptionnellement active et inactive, respectivement15, 16,26. Les premières preuves suggèrent que l'activité neuronale et la signalisation extrinsèque pourraient induire une réorganisation de l'architecture 3D de la chromatine14,27,28. Notre analyse de l'état du compartiment15, 16,26 (Fig. 3a–c) a révélé la relocalisation de grands segments de chromatine de l'environnement inactif (B) à l'environnement permissif (A) (et vice versa) au cours de la phase initiale et tardive deMémoireformation (212 segments commutés de A à B, 127 de B à A, taille moyenne de ~436Kbp). Fait intéressant, 52% des régions de la phase précoce qui sont passées de B à A ont maintenu cet état dans la phase tardive (c'est-à-dire sont restées dans l'état A, Fig. 3b, c; Tableau supplémentaire 6). De plus, presque toutes ces régions se chevauchaient avec les DAR acquis de notre analyse ATAC-seq, confirmant la transition du sous-compartiment de l'environnement inactif à l'environnement permissif (Fig. 3d). Ces données indiquent que certains locus subissent une commutation de sous-compartiment à travers différentes phases de mémoire et pourraient donc contribuer à des changements à long terme dans les propriétés et la fonction neuronales après l'activation initiale.

Alors que nos données Hi-C suggéraient une réorganisation à grande échelle, il n'était pas clair si cette réorientation permettait l'interaction de nouveaux répertoires de promoteurs-amplificateurs et le réglage fin de différents programmes transcriptionnels (Fig. 3e). En utilisant la technique de capture de promoteur Hi-C (pc-HiC), nous avons étudié les changements précis qui se produisent dans les interactions promoteur-amplificateur au cours du processus deMémoireformation et rappel. Pour cette étude, nous avons utilisé des "appâts" personnalisés ciblant ~5000 promoteurs29. En accord avec les publications précédentes29, nous avons détecté environ 19 000 (par groupe) interactions significatives promoteurs-amplificateurs (67,5%) et promoteurs-promoteurs (46,2%) (Extended Data Fig. 3a, b).

Étant donné que les promoteurs dans le cerveau des mammifères pourraient être sous le contrôle de plusieurs éléments régulateurs14,30,31, nous avons analysé le chevauchement entre tous les activateurs en interaction et leurs promoteurs respectifs. Nous avons constaté qu'au cours de chaqueMémoirephase, les mêmes promoteurs interagissent plus fréquemment avec un sous-ensemble distinct d'amplificateurs (c'est-à-dire unique, basal - 3243, précoce - 7602, tardif - 7028, réactivé - 7244 ; Fig. 4a, b ; Données étendues Fig. 3c ; tableau supplémentaire 7). Ce résultat est cohérent avec les publications précédentes montrant que de multiples activateurs entourant plusieurs gènes (c-Fos et Arc) sont cruciaux pour leur activation et que leur fréquence d'interaction avec leurs promoteurs respectifs est altérée en réponse à divers agents dépolarisants dans les neurones en culture31. Nous avons également identifié un plus petit sous-ensemble d'interactions dans lesquelles les promoteurs interagissaient avec les mêmes amplificateurs à travers différentsMémoirephases (c'est-à-dire communes, ~ 31 % de toutes les interactions ; tableau supplémentaire 7). De plus, les neurones réactivés présentaient des scores d'interaction significativement plus forts (tels que calculés par Chicago, Fig. 4b; Extended Data Fig. 3d). Par conséquent, bien que le nombre d'interactions uniques soit similaire dans les états précoces, tardifs et réactivés, des scores d'interaction plus forts indiquent que des interactions spécifiques promoteur-amplificateur se produisent plus fréquemment pendant la mémoire.

rappeler. Cette notion a ensuite été validée par des expériences 3C, avec des amorces conçues pour mesurer la fréquence d'interaction entre l'enhancer sélectionné (E) et les promoteurs de gènes (P) qui codent pour la sous-unité D 3 du facteur d'initiation de la traduction eucaryote (Eif3d) ou le récepteur du glutamate, ionotrope, kaïnate 3 (Grik3) (Fig. 4c). Nos données ont montré que les neurones réactivés présentaient une augmentation significative de la fréquence d'interaction entre le promoteur Eif3d et l'amplificateur sélectionné, par rapport aux autres populations (Fig. 4c). Collectivement, ces données indiquent que les interactions promoteur-amplificateur se produisent plus fréquemment pendantMémoirerappeler.

Ensuite, nous avons demandé si les interactions dynamiques à longue portée identifiées via pc-HiC correspondent à des régions de chromatine qui deviennent plus accessibles, comme déterminé via ATAC-seq. Cela confirmerait que l'accessibilité accrue a une conséquence fonctionnelle en provoquant de nouvelles interactions promoteur-amplificateur. Pour ce faire, nous avons comparé le chevauchement entre les activateurs en interaction dans chaque population de cellules aux DAR (observés) ou à un ensemble aléatoire de loci génomiques accessibles (attendus). Notre analyse a révélé un chevauchement significatif entre les DAR acquis dans les neurones précoces activés et les DAR acquis de manière stable avec les activateurs en interaction, dans toutes les populations de cellules (Tous les Ps <0.0001, données="" étendues="" fig.="" 3e).="" en="" revanche,="" les="" changements="" dans="" l'accessibilité="" de="" la="" chromatine="" qui="" se="" sont="" produits="" au="" cours="" de="" la="" phase="" tardive="">Mémoirela consolidation et la réactivation ne se chevauchaient pas de manière significative avec les activateurs en interaction (données étendues Fig. 3e). Ensemble, ces résultats indiquent que le gain d'accessibilité lors de l'encodage de la mémoire est un événement d'amorçage et que ces loci amorcés s'engagent dans des interactions fonctionnelles promoteur-amplificateur de novo au cours des phases ultérieures deMémoireformation. Ce paysage dynamique est illustré en visualisant les régions génomiques autour du gène eucaryote de la sous-unité A (Eif5a) du facteur d'initiation de la traduction 5 (Fig. 4d). Cette dissection moléculaire temporelle de la durée de vie de l'engramme met en évidence comment l'amorçage coordonné de l'état épigénétique d'une cellule pendantMémoirel'encodage et la consolidation facilitent les interactions à longue portée lors de la réactivation.