Partie 1 : Le verbascoside protège les cellules pancréatiques contre le stress du RE
Mar 05, 2022
Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com
Alessandra Galli 1, plus , Paola Marciani 1, plus , Algerta Marku 1, Silvia Ghislanzoni 1, Federico Bertuzzi 2, Rafaella Rossi 3, Alessia Di Giancamillo 3 , Michela Castagna 1 et Carla Perego 1,*
Résumé:
Des preuves épidémiologiques substantielles indiquent qu'une alimentation riche en polyphénols protège contre le développement du diabète de type 2. Le glycoside phényléthanoïdeverbascoside/actéoside, un composé végétal polyphénolique répandu, possède plusieurs propriétés biologiques, notamment de fortes activités antioxydantes, anti-inflammatoires et neuroprotectrices. Le but de cette recherche était de tester les effets possibles deverbascosidesur les cellules pancréatiques, une cible jamais testée auparavant. Des cellules de souris et humaines ont été incubées avecverbascoside(0.8–16 uM) pendant cinq jours maximum et une combinaison de techniques biochimiques et d'imagerie ont été utilisées pour évaluer la survie et la fonction des cellules dans des conditions normales ou induisant un stress du réticulum endoplasmique (RE). Nous avons trouvé un effet protecteur dose-dépendant deverbascosidecontre le stress oxydatif dans les cellules clonales et humaines. Des études mécanistiques ont révélé que le polyphénol protège les cellules contre les dysfonctionnements médiés par le stress ER, modulant l'activation de la branche PERK (protéine kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase) de la réponse protéique dépliée et favorisant la dynamique mitochondriale. En conséquence, une viabilité, une fonction mitochondriale et une teneur en insuline accrues ont été détectées dans ces cellules. Ces études apportent la preuve queverbascosidestimule la capacité des cellules à faire face au stress du RE, un important contributeur au dysfonctionnement et à l'échec des cellules dans les conditions diabétiques et soutient le potentiel thérapeutique du verbascoside dans le diabète.
Mots clés:
verbascoside; polyphénols; cellules productrices d'insuline; Diabète; EPU ; stress oxydatif; ER-stress ; AVANTAGE ; anti-inflammatoire; mitochondries
1. Introduction
Le diabète est une maladie chronique qui touche des centaines de millions de personnes [1]. Différentes étiologies caractérisent les diabètes de type 1 (DT1) et de type 2 (DT2), tous deux caractérisés par un manque d'insuline [2]. L'insuline régule la concentration plasmatique de glucose en stimulant l'absorption du glucose dans les cellules musculaires et adipeuses et en modulant le métabolisme hépatique du glucose. La disponibilité des nutriments, les hormones et les apports neuronaux régulent la sécrétion d'insuline pancréatique et maintiennent les concentrations de glucose dans le sang dans une plage physiologique [3-5]. Par conséquent, le dysfonctionnement des cellules conduit au diabète caractérisé par une hyperglycémie à jeun.
Le DT2 est une maladie progressive dans laquelle la résistance à l'insuline et les dysfonctionnements des cellules ß sont liés et des preuves récentes ont suscité un intérêt pour le rôle primaire critique des cellules ß dans l'état hyperglycémique [6,7]. Chez les sujets obèses non diabétiques, les cellules compensent la résistance à l'insuline par une sécrétion accrue de l'hormone. Cependant, chez certains sujets, à mesure que leur état se détériore, l'insulinémie chute et le taux de glucose grimpe jusqu'à l'hyperglycémie [8,9].
Le glucose est le modulateur le plus important des fonctions cellulaires. La stimulation du glucose affecte la régulation des gènes et l'expression des protéines impliquées dans de nombreuses fonctions cellulaires telles que la glycolyse, la synthèse et la sécrétion d'insuline [10]. La sécrétion d'insuline induite par le glucose repose sur le métabolisme oxydatif pour produire de l'adénosine triphosphate (ATP) et un faible niveau d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) est physiologiquement produit. Cependant, les cellules ß ne sont pas très bien équipées en enzymes piégeuses et cette faiblesse les rend très sensibles au stress oxydatif [11,12]. À mesure que le stress oxydatif augmente, la production d'insuline des cellules diminue et les cellules produisent des cytokines qui provoquent des dommages cellulaires par inflammation et apoptose [13]. Fait intéressant, bien que la masse cellulaire réduite ait été précédemment attribuée à la mort cellulaire, des études récentes suggèrent un rôle majeur de la dédifférenciation cellulaire [14,15]. Il est devenu évident que plusieurs étapes conduisent au DT2. Les insultes métaboliques et oxydatives provoquent un stress du réticulum endoplasmique (ER) qui entraîne une diminution de la synthèse et de la sécrétion d'insuline, des processus d'inflammation suivent la libération de cytokines et la perte de cellules peut se produire par apoptose et dédifférenciation. Cette connaissance est fondamentale pour développer des stratégies de traitement appropriées, car le stress oxydatif et l'inflammation peuvent être contrecarrés, et la plasticité des cellules pancréatiques permet la possibilité de transformer les cellules souches en cellules - comme cela a été prouvé chez la souris [16].
Récemment, la vulnérabilité des cellules β au stress oxydatif a incité avec succès l'utilisation d'antioxydants alimentaires pour prévenir le diabète [17]. Parmi les aliments antioxydants les plus intéressants, l'huile d'olive est connue pour ses propriétés bénéfiques depuis les anciens Grecs. L'huile d'olive contient une bonne quantité d'acides gras mono-insaturés (MUFA) et plusieurs polyphénols tels que le tyrosol, l'hydroxytyrosol, l'oleuropéine et le verbascoside.
Verbascoside, également connu sous le nom d'actéoside, est un glycoside phényléthanoïde extrait d'Olea europea, de plantes de l'espèce Verbascum et de 23 autres familles de plantes [18–20]. Il peut également être obtenu à partir de sous-produits de l'huile d'olive (il est enrichi dans les eaux usées des moulins à huile provenant de la transformation des olives) ou être produit par des approches d'ingénierie métabolique et de biologie synthétique [21].
Aucune donnée n'a encore été rapportée sur la biodisponibilité du verbascoside chez l'homme. Des études menées sur des souris, des cellules SKBR3 et Caco-2 suggèrent qu'il est possible que le verbascoside non métabolisé traverse la barrière intestinale, circule dans le plasma sanguin et exerce des effets antioxydants [20,22,23]. Contrairement à la plupart des polyphénols végétaux, le verbascoside agit principalement sur les cellules par la modulation de la transcription génique d'une variété d'enzymes et de facteurs de régulation, avec des effets antioxydants et anti-inflammatoires [24–30].
Bien que de nombreux effets bénéfiques du verbascoside pour la santé humaine soient connus, il n'existe aucune donnée concernant son effet sur les cellules pancréatiques. Étant donné que le stress oxydatif et l'inflammation sont à la base de la pathogenèse du DT2, nous avons cherché à savoir si le traitement par le verbascoside pouvait améliorer la viabilité des cellules et
fonction dans des conditions induisant un stress ER et nous avons caractérisé les mécanismes moléculaires de son action. Nos données révèlent que le verbascoside prévient le stress oxydatif des cellules et l'inflammation en modulant l'activation de la réponse protéique dépliée et en favorisant la dynamique mitochondriale, entraînant ainsi une augmentation de la viabilité cellulaire et de la teneur en insuline.
2. Matériels et méthodes
2.1. Culture cellulaire et matériaux
Des cellules tc3 de souris (aimablement fournies par le professeur Hanahan—Département de biochimie et de biophysique, Université de Californie, San Francisco, CA [31]) ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 (Euroclone SpA, ECB90 0, Pero MI, Italie) additionné de 10 % (v/v) de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Euroclone SpA, ECS0180L, Pero MI, Italie), 1 % (v/v) de pénicilline-streptomycine (EuroClone SpA, ECB3001D, Pero MI, Italie) et 1 % (v/v) de L-glutamine (EuroClone SpA, ECB300D, Pero MI, Italie). Des îlots de Langerhans humains ont été isolés à Milan (Niguarda Ca' Granda) à partir de donneurs multiorganes cadavériques selon la procédure décrite par Ricordi et al. [32] ; ils ont été cultivés dans un milieu de culture RPMI contenant 5,5 mmol/L de glucose, 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur, 0,7 mM de glutamine, 50 unités/mL de pénicilline et 50 ug/mL de streptomycine (EuroClone, SpA, Pero MI, Italie). Quatre préparations d'îlots différentes ont été utilisées, la pureté des îlots était de 80 ± 10 %. L'isolement des îlots et les études d'îlots ont été approuvés par le comité d'éthique de l'hôpital Niguarda Ca' Granda de Milan (11.12.2009). Les cellules tc3 ont été traitées avec du verbascoside 0,8, 1,6 et 16 uM (Carbosynth, OV08034, Compton, Royaume-Uni), de l'acide caféique et de l'hydroxytyrosol (don aimable du professeur Dell'Agli, Département des sciences pharmacologiques et biomoléculaires, Universita degli Studi di Milano, Milan, Italie) dans un milieu RPMI complet pendant 5 jours, tandis que des îlots humains avec 16 uM de verbascoside. Des cellules traitées au méthanol/éthanol ont été utilisées comme témoins. Afin d'induire un stress oxydatif, les cellules ont été traitées avec H2O2 (Sigma Aldrich, H1009, St. Louis MO, USA) 500 uM dans un milieu RPMI complet pendant 20 min avant l'analyse, tandis que le traitement avec la tunicamycine 2 ug/mL (T7765, Sigma Aldrich ) pendant 7 h a été réalisée pour induire un stress ER.
2.2. Détection de la viabilité cellulaire par test MTT
Les cellules ont été étalées dans 96 plaques multipuits et cinq jours après le traitement au verbascoside, elles ont été incubées avec 0.5 mg/mL MTT (3-(4,5-diméthyltiazol{{7} }yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium) (Sigma-Aldrich, M5655, St. Louis, MO, USA) pendant 4 h dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 à 37 oC. Après incubation, les cellules ont été doucement remises en suspension dans 100 uL de DMSO (Euro-Clone SpA, BK12611S, Pero MI, Italie) et l'absorbance à 540 nm a été détectée avec un lecteur de microplaques (Benchmark, lecteur de microplaques, Bio-Rad Laboratories, Hercules CA, États-Unis) [33]. Les expériences ont été réalisées en triple exemplaire et les données ont été exprimées sous la forme d'une multiplication par rapport aux échantillons témoins.
2.3. Détection de la mort cellulaire par cytométrie en flux
Cinq jours après incubation avec 16 uM de verbascoside, les cellules ont été détachées par une incubation de 7 min avec de la trypsine/EDTA, collectées et centrifugées ; le culot a été doucement remis en suspension dans du tampon phosphate salin à faible teneur en sels. Les cellules ont été colorées avec le réactif de comptage et de viabilité MuseTM (Millipore, MCH100102, Burlington MA, USA) en suivant le protocole du fabricant et analysées par cytométrie en flux. Les expériences ont été réalisées en triple et les données ont été exprimées en pourcentage de cellules mortes sur le total.
2.4. Génération ROS
Les ROS intracellulaires ont été évalués avec le DCFDA (diacétate de 2/,7/-dichlorofuorescéine) (Sigma Aldrich, D6883, St. Louis, MO, USA), une sonde perméable à la membrane qui devient fluorescente lorsqu'elle est liée aux ROS [34]. Les cellules tc3 ont été préchargées avec 15 uM de DCFDA dans un tampon Krebs-Ringer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM MgSO4, 1,2 mM KH2PO4, 25 mM HEPES-NaOH pH 7,4 et 2 mM CaCl2)
additionné de glucose 11 mM pendant 1 h à 37 oC. La teneur en ROS a été détectée pendant 30 min à la fois dans des conditions basales et de stress avec un lecteur de microplaques (485/528 nm Ex/Em) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Suisse). Les valeurs moyennes et les écarts-types étaient basés sur trois expériences indépendantes.
2.5. Western blot
Les cellules tc3 ont été collectées et solubilisées dans un tampon RIPA (NaCl 15 0 mM, Tris HCl 50 mM pH 7,6, EDTA 1 mM, 1 % TERGITOLw NP40, 0,5 % désoxycholate) additionné d'aprotinine (Sigma Aldrich, A4529, St. Louis, MO, USA), PMSF (Sigma Aldrich, 10837091001, St. Louis, MO, USA) et inhibiteurs de Roche (Sigma Aldrich, 5892953001, St. Louis, MO, USA) pendant 40 min à 4 oC. La concentration en protéines a été déterminée par le test de Bradford [35] en utilisant le réactif de Bradford (Sigma Aldrich, B6916, St. Louis, MO, USA), 30 ug de protéines ont été résolus par SDS-PAGE à 10 % et transférés sur des membranes de nitrocellulose (Millipore, Burlington MA, États-Unis). Les anticorps primaires ont été appliqués pendant 2 h dans un tampon de blocage avec du lait écrémé à 5 % ou des solutions de BSA à 5 % ; les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anti- -actine de souris (Novus International Inc., NB600501, St. Louis, MO, USA), anti-acroléine de souris (Abcam, ab48501,Cambridge, UK), anti-BIP de souris (aimable don du professeur Borgese Nica, Institut des neurosciences, CNR, Milan, Italie), lapin anti-HNE ( -diagnostic International Inc., HNE11S, San Antonio, TX, USA), souris anti-HSP70 (Enzo Life Sciences Inc ., C92F3A-5, Farmingdale, NY, USA), lapin anti-phospho-IKB (Ser32) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), souris anti-IKB (Cell Signaling Technology Inc ., 4814, Danvers, MA, USA), lapin anti-phospho-NFKB p65 (Ser 536) (Cell Signaling Technology Inc., 3033, Danvers, MA, USA), lapin anti-NFkB p65 (Cell Signaling Technology Inc., 8242, Danvers MA, USA), mouton anti-SOD1 (Merck, KGaA, Darmstadt, Allemagne), lapin anti-PERK (Cell Signaling Technology Inc., 3192, Danvers, MA, USA), lapin anti-eIF2 (Cell Signaling Technology Inc., 5324, Danvers, MA, USA) et lapin anti-P-eIF2 (Ser 51) (Cell Signaling Technology Inc., 3597, Danvers, MA, États-Unis). Les anticorps secondaires conjugués à la HRP (Dako Agilent, Santa Clara, CA, USA) ont été utilisés à une dilution de 1:5000. Les protéines ont été détectées en utilisant le système de détection ECL (Euro-Clone SpA, Pero MI, Italie) en utilisant le système Odyssey Fc Image (LI-COR Biotechnology GmbH, Bad Homburg, Allemagne) et la densité de bande a été quantifiée par le logiciel Image Studiow Lite (LI -COR Biosciences, Lincoln, NE, États-Unis) [36]. Les expériences ont été réalisées en triple exemplaire et les données ont été exprimées sous la forme d'une multiplication par rapport aux échantillons témoins.
2.6. Potentiel de la membrane mitochondriale
tc3 cellules et îlots humains de Langerhans ont été incubés avec 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italie) ou 100 uM MitoSpyw Green FM (BioLegend, 424805, Campoverde Srl, Milan, Italie) pendant 30 min à 37 °C ; Les intensités de fluorescence ont été détectées avec le lecteur de microplaques TECAN Infinite⑧ F500 (551/576 nm Ex/Em pour MitoSpyw Orange CMTMRos ; 490/516 nm Ex/Em pour MitoSpyw Green) (TECAN Infinite⑧ F500, Tecan Group Ltd. Männedorf, Suisse). Les cellules ont été incubées avec 500 uM de H2O2 pendant 20 minutes et l'intensité de la fluorescence a été détectée comme décrit précédemment. Les valeurs moyennes et les écarts-types étaient basés sur trois expériences différentes.
2.7. Morphologie et dynamique mitochondriales
Les cellules tc3 ont été préchargées avec 100 nM MitoSpyw Orange CMTMRos (BioLegend, 424803, Campoverde Srl, Milan, Italie) dans un tampon Krebs-Ringer de glucose 11 mM à 37 oC pendant 30 min. Les échantillons ont été placés dans une chambre d'imagerie et des champs aléatoires ont été imagés en utilisant le filtre rhodan du microscope Axio Observer Z1 (Zeiss, Oberkochen Allemagne). Pour évaluer la morphologie mitochondriale, les paramètres suivants ont été analysés à l'aide du logiciel d'analyse de particules ImageJ : aire (um2), circularité (4mArea2/Perimeter2) et diamètre maximal de Feret (um) [37].
Pour les expériences en accéléré, l'imagerie unicellulaire a été réalisée à 1 image par seconde pendant 30 s dans des conditions de contrôle ou de stress oxydatif. Pour mesurer la distance cumulée mitochondriale (um2), les images ont d'abord été corrigées pour le blanchiment des photos, puis les vidéos ont été analysées à l'aide d'un plug-in Image-Pro Plus existant (suivi d'objets) (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Jusqu'à douze
les cellules ont été imagées dans trois expériences indépendantes et les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes et d'écarts types.
2.8. Sécrétion d'insuline
Des îlots de Langerhans humains isolés ont été ensemencés dans une plaque 96-puits à une densité de 20 îlots par puits et, après 5 jours de traitement, la teneur et la sécrétion d'insuline ont été mesurées en solution basale (glucose 3,3 mM) et stimulées (glucose 16,7 mM ) au moyen d'un test immunologique ELISA (Mercodia, 10-1113-01, Uppsala, Suède).
2.9. Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été effectuées avec GraphPad Prism 8.0 sur des répliques biologiques indépendantes. Les moyennes entre deux groupes ont été évaluées en utilisant le test t de Student bilatéral et une valeur de p < 0.05="" a="" été="" prise="" comme="" preuve="" de="" la="" signification="" statistique.="" les="" moyennes="" de="" trois="" groupes="" ou="" plus="" ont="" été="" comparées="" par="" analyse="" de="" variance="" (anova),="" suivie="" d'un="" test="" de="" comparaison="" post-hoc="" multiple="" (tukey).="" le="" test="" statistique="" utilisé,="" les="" valeurs="" p="" exactes="" et="" le="" nombre="" de="" répliques="" (n)="" sont="" indiqués="" dans="" les="" légendes="" des="" figures="" individuelles.="" les="" barres="" d'erreur="" dans="" les="" figures="" affichent="" la="" moyenne="" ±="" sd="" ou="" la="" moyenne="" ±="" se,="" comme="">
3. Résultats
3.1. Le verbascoside améliore la viabilité des cellules
Puisqu'il n'y avait pas de données sur l'effet du verbascoside sur les cellules, nous avons effectué un test MTT pour évaluer la viabilité cellulaire et, comme le montre la figure 1A, une tendance dose-dépendante positive a été observée. Par conséquent, pour d'autres études, nous avons sélectionné la concentration de 16 uM qui s'est avérée statistiquement efficace pour améliorer la viabilité des cellules. Par cytométrie en flux, nous avons étudié l'impact de cinq jours d'incubation du verbascoside sur la survie des cellules dans des conditions basales et après 2 } min de prétraitement avec 500 uM H2O2. Dans l'état basal, le verbascoside n'a pas affecté la survie cellulaire, ce qui suggère que la viabilité accrue des cellules observée dans le test MTT peut être due à une activité mitochondriale améliorée. Alors qu'après une exposition au H2O2, un prétraitement au verbascoside à 16 uM a significativement réduit la mort cellulaire induite par le stress oxydatif (Figure 1B, C). Le verbascoside est une molécule complexe qui peut être modifiée par des enzymes hydrolysantes [18]. Pour tester si les métabolites du verbascoside pouvaient être responsables de l'effet protecteur observé, les cellules tc3 ont été traitées avec de l'hydroxytyrosol et des acides caféiques (0,8 et 16 uM) pendant 5 jours. Les deux métabolites n'ont pas amélioré la viabilité cellulaire, au contraire un effet cytotoxique, plus pertinent après une exposition au H2O2, a été détecté pour la concentration de 16 uM (Figure S1). Cette découverte prouve que le verbascoside et non ses métabolites exerce l'effet protecteur contre le traitement au H2O2.
3.2. Le verbascoside module l'homéostasie redox et exerce un effet anti-inflammatoire dans les cellules -
Nous avons d'abord confirmé dans les cellules TC3 les effets anti-inflammatoires et antioxydants du verbascoside observés dans d'autres types cellulaires [24,29,34]. L'activité de piégeage des ROS par le verbascoside a été évaluée avec des cellules tc3 marquées avec la sonde perméable cellulaire DCFDA (diacétate de 2/,7/-dichlorofuorescéine) spécifique aux ROS. Comme le montre la figure 2A, une diminution significative de la teneur en ROS a été détectée après le prétraitement au verbascoside, à la fois dans des conditions de stress basal et oxydatif.
Les analyses Western blot ont révélé une diminution significative de l'expression des marqueurs de stress oxydatif acroléine et 4-hydroxynonenal (HNE) dans les cellules traitées au verbascoside. De plus, nous avons constaté une augmentation de l'expression de la superoxyde dismutase (SOD1), suggérant que le verbascoside exerce probablement son activité antioxydante avec deux mécanismes différents, directement en tant que piégeur de ROS et indirectement en induisant l'expression d'enzymes antioxydantes (Figure 2B,C).
L'effet anti-inflammatoire du verbascoside sur les cellules a été évalué en évaluant l'activation de la voie NFKB, la voie pro-inflammatoire la plus importante dans ces cellules [38]. Par analyse Western blot, nous avons trouvé une expression réduite de l'inhibiteur du facteur nucléaire kappa B (IKB) et du facteur nucléaire kappa-amplificateur de chaîne légère (NFKB), et une diminution significative de la phosphorylation de NFKB dans les cellules prétraitées, soutenant l'hypothèse de l'efficacité du verbascoside pour réduire l'inflammation cellulaire (Figure 2D,E).
3.3. Le verbascoside module la réponse protéique dépliée des cellules -
Nous avons ensuite analysé en profondeur le mécanisme moléculaire par lequel le verbascoside exerce des rôles antioxydant et anti-inflammatoire, en nous concentrant sur le réticulum endoplasmique qui émerge comme un capteur clé des signaux métaboliques et de stress dans les cellules. Dans des conditions de stress, l'organite monte une réponse homéostatique, connue sous le nom de réponse protéique dépliée (UPR), visant à récupérer la fonction ER; cependant, l'activation excessive de cette voie entraîne l'apoptose [39,40].
Les marqueurs d'un stress ER accru sont la régulation à la hausse des protéines chaperons et l'activation de la réponse UPR. L'analyse Western blot des cellules traitées avec le verbascoside a révélé une diminution des niveaux de la protéine de choc thermique des deux chaperonines 70 (HSP70) et de la protéine d'immunoglobuline de liaison (BIP) (Figure 3A,B). En outre, une réduction significative de l'expression de la protéine kinase RNA-like ER kinase (PERK) et une diminution de la phosphorylation de son effecteur en aval, le facteur d'initiation de la traduction eucaryote 2 (eIF2), ont été détectées.
