Partie 2: La calpastatine prévient les lésions podocytaires médiées par l’angiotensine Il grâce au maintien de l’autophagie

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Angel + HSD active l’activité de la calphaïne dans les podocytes qui contribue au blocage de l’autophagie

Comme l’activité de la calpaïne a été activée par Angel dans plusieurs types de cellules et (ii) pour cliver plusieurs protéines liées à l’autophagie, nous nous sommes demandé si le blocage de l’autophagie médié par AngII + HSD pouvait être attribuable à une augmentation de l’activité de la calphaïne induite par Angl. Nous avons d’abord constaté que les podocytes primaires exprimaient les 3 formes omniprésentes de calpains (Figure 3a). Nous avons ensuite montré qu’AngII stimulait l’activité de la calphaïne dans les podocytes primaires. Cette augmentation de l’activité de la calpaïne a été bloquée par un inhibiteur sélectif de la calpaine (figure 3b). Nous avons utilisé une souris knock-in avec une expression transgénique supplémentaire de calpastatine (entraînant une diminution de l’activité de la calpaine) pour évaluer le rôle des calpains dans AngII + HSD-médiéreinBlessureet le blocus de l’autophagie. Les podocytes primaires de souris CST’g ont montré une diminution de l’activité de la calpaïne en réponse à AngII par rapport aux podocytes de souris témoins (Figure 3c). Ainsi, la surexpression de la calpastatine dans les podocytes a diminué l’activation de la calpaine médiée par AngII.

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Nous avons ensuite évalué les niveaux d’autophagie dans les podocytes de souris CSTTg. Nous avons généré des souris CST avec le transgène GFP-LC3. Le rapporteur LC3-GFP a permis de compter les autophagosomes en tant que points GFP+/P62+. P62 s’accumulera en agrégats dans les cellules lorsque le flux autophagique est bloqué. À l’état basal, nous avons compté moins de points GFP+ P62+ (Figure 4a, b et e) et moins d’accumulation de P62 (Figure4c, d et f) dans les podocytes de souris CST1g GFP-LC3 que dans les podocytes de normale

Graphique 4| Évaluation du flux autophagique dans les podocytes de souris transgéniques à la calpastatine (CST9). (a,b) Images d’immunofluorescence représentatives de l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) (vert) et P62 (rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 et CST’GFP-LC3 âgées de 12 semaines. Les pointes de flèche indiquent les autophagosomes GFP+ P62+. (c,d) Images d’immunofluorescence représentatives de l’expression de P62 (vert) et de podocalyxine (PODXL; rouge) dans les glomérules de souris GFP-LC3 et CST'9 GFP-LC3 âgées de 12 semaines. Les sous-parties de la figure avec nombre premier indiquent un grossissement plus élevé. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres = 50 μm. e) Quantification du nombre de points CL3+ P62+ par podocyte. Test de Mann-Whitney :**P=0,0065. f) Quantification de l’aire P62+ par section glomérulaire. Test de Mann-Whitney :*P= 0.0420.In(e,f), n =5 souris GFP-LC3 et n =8 souris CST'9 GFP-LC3. Les valeurs sont présentées sous forme de graphiques individuels et la moyenne± SEM. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article chez les souris GFP-LC3, suggérant une augmentation du flux autophagique dans les podocytes de souris ayant une abondance élevée de calpastatine.

Le flux autophagique peut être surveillé par la mesure de la conversion de la forme cytoplasmique de LC3, LC3-I, en la forme autophasomale clivée et couplée à la phosphatidyléthanolamine de LC3, LC3-II, sur le transfert de Western. Les podocytes de souris CST ont montré une augmentation de la conversion de LC3-I en LC3-II et une diminution de l’expression de P62, à la fois en présence et en l’absence de bafilomycine A (Figure 5a et b), indiquant une augmentation du flux autophagique dans les podocytes avec surexpression de calpastatine. Enfin, l’accumulation de points GFP+P62+ dans les podocytes après administration de chloroquine était plus importante chez les souris CST’g GFP-LC3 que chez les souris GFP-LC3, confirmant ainsi que la surexpression de la calpastatine in duces flux autophagique dans les podocytes in vivo (Figure 5c-e). Dans l’ensemble, nos données suggèrent que l’AngII stimule l’activité de la calpaïne dans les podocytes, que l’autophagie est inhibée par la calpaine dans les podocytes et que l’inhibition de l’activité endogène de la calpatine par la surexpression de la calpastatine est suffisante pour stimuler le flux autophagique dans les podocytes.

Les souris CSTT9 sont protégées contre les lésions podocytaires induites par Angel + HSD

CSTT: les souris n’ont montré aucunreinaltération jusqu’à l’âge d’au moins 12 mois (figure supplémentaire S5). Nous avons analysé les lésions podocytaires chez des souris CST’号 pendant le traitement AngII + HSD. Bien que les souris WT aient développé une glomérulosclérose légère et des lésions podocytaires après 4 semaines d’hypertension, comme le montre l’expression anormale de podocalyxine et de néphrine, les souris CSTTg présentaient moins de lésions glomérulaires sslérotiques (Figure 6a

Graphique 5| Le blocage de la dégradation autophagosomique a confirmé une augmentation du flux autophagique des podocytes chez les souris transgéniques à la calpastatine (CSTT). a) Analyse par transfert de Western de l’expression de la CL3. Séquestosome 1 (SOSTM1) / P62 et ATG5 dans les podocytes primaires de type sauvage (W ou CST'9mice. L’expression de la tubuline sert de normalisation. Les podocytes ont été traités ou non avec de la bafilomycine A1 (BafA1; 100 nM) pendant 4 heures avant l’arrêt de la culture. b) Quantification des rapports CL3-ll/tubuline et P62/tubuline.n = 10 souris WT et n = 8 souris CST'9. Les valeurs sont présentées sous forme de diagrammes individuels et de moyennes ± SEM. Analyse bidirectionnelle de la variance appariée pour le traitement: pour la CL3-ll/tubuline: génotype, P = 0,0008;traitement, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">rein-international.org.

Graphique 6| La surexpression de calpastatine prévient les lésions podocytaires médiées par l’angiotensine Il (Angel) et le régime riche en sel (HSD). (a,b)

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Images représentatives des sections de glomérules trichromes de Masson provenant de souris de type sauvage (WT et calpastatine transgénique (CST'9) après 6 semaines de HSD Angll+. Barres = 50 um. (c,d,f,g) Images d’immunofluorescence représentatives de l’expression de (c,d) podocalyxine (PODXL) et (f,g)néphrine (NPHS1) dans WT et CST'9mice après 6 semaines de quantification Angel +HSD et (e,h) associées. Barres = 50 um. (ii)

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Images d’immunofluorescence représentatives de l’expression de la tumeur de Wilm 1 (WT1; vert) et PODXL (rouge) dans les glomérules de souris WT et CST après 6 semaines d’Angel + HSD et (k) quantification associée du nombre de cellules WT1 + par section glomérulaire. Les noyaux ont été colorés avec Hoechst (bleu). Barres = 50 um. Dans (e,h,k), les valeurs sont présentées sous forme de diagrammes individuels et la moyenne ± SEM,n = 9 souris WT et n = 7 souris CSTTg. Test t non apparié avec un SD égal :**P=0,0095 in (e),*P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k).

et b)et l’expression préservée de la podocalyxine et de la néphrine (figure 6c-h). De telles différences dans le phénotype des podocytes ont été observées à un stade où la densité des noyaux de podocytes n’était pas différente entre les souris WT et hypertendues CST’g (figure 6i-k).

De même, après 6 semaines d’hypertension, les souris GFP-LC3 et CST'1 GFP-LC3 présentaient des lésions podocytaires, mais les lésions étaient plus importantes chez les souris GFP-LC3 (Figure 7). Le rapport albumine/créatinine urinaire était plus élevé chez les souris GFP-LC3 après 4 semaines d’AnglI + HSD (Figure 7a). Le nombre de podocytes n’était pas différent entre les 2 génotypes, mais l’expression de néphrine était significativement plus diminuée chez les souris GFP-LC3 (témoins) (Figure 7b-e). En corrélation avec la protection médiée par la calpastatine, l’analyse ultrastructurale a montré un effacement léger et focal du processus du pied podocytaire chez les souris GFP-LC3 traitées par Angl+ HSD avec une meilleure préservation du processus d’effacement du pied chez les souris CST’g, bien que la quantification globale du nombre de processus du pied par longueur de membrane basale glomérulaire (GBM) n’était pas statistiquement différente, probablement parce que la lésion des podocytes est focale et segmentaire dans notre modèle (Figure 7f-h). Il convient de noter que les macrophages et l’infiltration des lymphocytes T dansReinsn’étaient pas différents entre les groupes (figure supplémentaire S6). Pris ensemble, ces résultats ont démontré que la calpastatine prévenait les lésions podocytaires induites par AngII+ HSD.

La surexpression de calpastatine restaure le flux autophagique dans les podocytes de souris après un traitement Angel + HSD

Enfin, nous nous sommes demandé si la protection glomérulaire médiée par la calpastatine dans le modèle AngII+ HSD impliquait le maintien de l’autophagie dans les podocytes. Fait intéressant, l’accumulation de P62 induite par AnglI + HSD dans les podocytes a été évitée chez les souris CSTTg et GFP-LC3 CST’g (Figure 8a-d), indiquant que la calpastatine empêchait le blocage de l’autophagie podocytaire. Il convient de noter que le nombre de points GFP+ P62+ marqués par des autophagosomes était similaire chez les podocytes de souris CST GFP-LC3 et GFP-LC3 hypertendues, suggérant ainsi que AnglI + HSD induisait un ralentissement du flux autophagique des podocytes plutôt qu’un arrêt complet (Figure 8e-g).

Prédiction in silico du site de clivage de la calpaïne dans les protéines podocytaires

Nous avons utilisé plusieurs outils in silico pour prédire les cibles potentielles de calphaïne dans les podocytes (tableaux supplémentaires S1 et S2). Trois bases de données en ligne ont été comparées : GPS-CCD,4CaMPDB,5, et DeepCalpain.° L’analyse in silico a identifié plusieurs protéines podocytaires, dont la néphrine et la podocine, qui pourraient être clivées par les calphaïnes. Ainsi, la protection glomérulaire médiée par la calpastatine pourrait être liée à une réduction de l’activité enzymatique de la calpaine, entraînant une dégradation réduite de certaines protéines podocytaires.

De plus, au moins 3 protéines liées à l’autophagie sont des cibles directes des calphaïnes. ATG5 est clivé par les calpains, ce qui entraîne une perturbation de la formation du complexe ATG12-ATG5.57 L’administration d’inhibiteurs de la calpaine in vivo a également empêché le clivage de la protéine d’autophagie Beclin-1.5"L’analyse in silico du site de clivage putatif sur les protéines liées à l’autophagie soutient l’hypothèse selon laquelle la calphaïne pourrait réguler l’autophagie par le clivage enzymatique des protéines d’autophagie.

Expression de l’ARNm du réticulum endoplasmique (RE) et marqueurs de stress oxydatif dans les glomérules de souris traitées par Angll+ HSD

Nous avons évalué le stress endoplasmique du réticulum (ER) et le stress oxydatif par PCR quantitative dans les glomérules pendant le traitement AngII + HSD (Tableau 1). Au départ, nous n’avons observé aucun changement dans l’expression de l’ARNm des gènes analysés chez les souris glomérules5loxlox (Supplémentaire de WT et Nphs2.cre Atg5 Figure S7). Après 6 semaines d’hypertension, les glomérules de souris Nphs2. cre Atg5loxlox ont montré différents profils d’ARNm des gènes des voies de stress ER et de stress oxydatif avec une expression accrue de Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl et Hsp90b1 par rapport aux glomérules WT, suggérant ainsi que l’épuisement de l’autophagie dans les podocytes favorisait le stress ER induit par AngII + HSD et le stress oxydatif. Inversement, les glomérules de souris CST présentaient une régulation négative de plusieurs gènes des voies de stress ER et de stress oxydatif ainsi qu’une diminution de l’expression de certains gènes pro-apoptotiques (Figure 9).

Pris ensemble, ces résultats indiquent que la surexpression de la calpastatine pourrait prévenir les lésions glomérulaires en réduisant les REL et le stress oxydatif induits par AngII + HSD.

DISCUSSION

Dans la présente étude, nous avons démontré que dans l’hypertension induite par AngII + HSD, l’autophagie podocytaire est nettement régulée à la baisse. En outre, les souris présentant une délétion spécifique des podocytes d’Atg5 étaient plus sujettes à la glomérulosclérose induite par AngI+ HSD et à la perte de podocytes, montrant ainsi que l’autophagie dans les podocytes empêche le développement d’une néphropathie hypertensive, soulignant le rôle essentiel de l’autophagie dans les lésions podocytaires induites par Angl + HSD. On sait peu de choses sur les stimuli extracellulaires qui régulent l’autophagie cellulaire, et ces résultats mettent en lumière la régulation physiopathologique de l’autophagie podocytaire par AngII.

Dans la plupart des glomérupathies humaines, l’effacement du processus du pied podocytaire est une caractéristique de lésion glomérulaire conduisant à une protéinurie. L’autophagie est susceptible de jouer un rôle essentiel dans le maintien de la fonction podocytaire, car ces cellules différenciées en phase terminale présentent des taux élevés d’autophagie, même en l’absence de stress. Une étude précédente a montré qu’Angi pro-motes autophagie par la génération d’espèces réactives de l’oxygène dans une lignée cellulaire de podocytes murins immortalisés conditionnellement.5 La production d’espèces réactives de l’oxygène est en effet un inducteur général de l’autophagie dans de nombreux types de cellules et les raisons d’une telle divergence avec nos résultats ne sont pas claires. Contrairement à cette dernière étude, nous avons utilisé des podocytes murins en culture primaire conservant l’expression de la podocine et de la néphrine et des approches in vivo et non des lignées cellulaires murines. Nous confirmons les rapports précédents selon lesquels les podocytes postmitotiques présentent un niveau inhabituellement élevé d’autophagie constitutive. La mesure de la quantité accrue de CL3-II après stimulation AngII en présence ou en l’absence d’inhibiteurs lysosomaux est nécessaire pour déterminer

si le flux autophagique est augmenté ou bloqué. Des études antérieures ont négligé ce phénomène.

Ici, nous avons utilisé un modèle hypertensif basé sur la perfusion AnglI et HSD. Les podocytes présentent des récepteurs ATI et sont exposés à des peptides filtrés libres tels que AngII1,6,26,61-6 On suppose que les effets rénoprotecteurs observés de l’inhibition du RAAS pourraient être – au moins partiellement – dus à un blocage de ce RAAS spécifique des podocytes. De même, les études in vivo

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