Partie 2 : Sortiline carbamylée associée à la calcification cardiovasculaire chez les patients atteints de maladies rénales chroniques

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La sortiline carbamylée modifie la liaison du ligand

La sortiline est un corécepteur pour plusieurs ligands.8 La carbamylation de la lysine modifie considérablement les propriétés de la chaîne latérale de la lysine, le groupe amino chargé positivement étant remplacé par un groupe polaire volumineux, affectant potentiellement la liaison du ligand. Nous avons examiné les interactions des chaînes latérales de la sortiline lysine les plus fréquemment modifiées trouvées danschronique un reinmaladie(séquence d'acides aminés [séquence de structure cristalline]), Lys95(62), Lys205(172), Lys260(227) et Lys294(261), par modélisation in silico pour prédire les éventuelles conséquences structure-fonction de la carbamylation de la lysine. Nous avons utilisé la structure cristalline existante de l'ectodomaine de la sortiline à partir de la forme liée à la neurotensine à pH neutre (fichier PDB Q24 : 4PO7 ; figure 3a) et de la forme sans ligand à pH acide (fichier PDB : 6EHO ; tableau supplémentaire S5).

À pH neutre, Lys95(62) forme un pont salin avec Glu609(576) et une liaison hydrogène avec le groupe carbonyle de la chaîne principale de Arg90(57). A pH acide, l'interaction avec Glu609(576) est plus étroite car la distance entre le groupe amino de Lys95(62) et le groupe carboxyle de Glu609(576) permet maintenant la formation d'une liaison hydrogène, alors que l'interaction avec Arg90(57 ) n'est pas présent. Par conséquent, la carbamylation à Lys95(62) peut déstabiliser les deux conformations de la sortiline. Ainsi, la carbamylation à Lys205 favoriserait éventuellement la conformation à pH acide de la sortiline. Lys294(261) n'a aucune interaction à pH neutre et acide.

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Enfin, à pH neutre, Lys260(227) interagit avec la neurotensine-Tyr11 dans le site de liaison du ligand dans le tunnel de l'hélice b de la sortiline. Comme la structure de la sortiline à pH acide n'a pas d'affinité pour le ligand, nous ne trouvons aucune interaction de la chaîne latérale Lys260(227) dans cette structure. L'interaction avec la neurotensine Tyr11 sera affectée par la carbamylation et pourrait conduire à une plus faible affinité pour la neurotensine. L'interleukine 6 (IL-6), un ligand connu de la sortiline20, lie la sortiline par sa queue C-terminale, qui contient une arginine à la position équivalente de la neurotensine-Tyr11. Ainsi, la carbamylation de Lys260(227) pourrait probablement augmenter l'affinité pour l'IL-6, un contributeur potentiel à la calcification vasculaire.

Des études de liaison ultérieures utilisant la spectroscopie de résonance plasmonique de surface et SortCo ou SortCarb ont révélé une liaison plus efficace de IL -6 à SortCarb (KD ¼ 23 nM) par rapport à Q25 avec SortCo non modifié (KD ¼ 141 nM), suggérant la sortiline carbamylée comme IL potentiel -6 partenaire de liaison (Figure 3b et c). La progranuline, un autre ligand de la sortiline connu, 22 lié à SortCo, mais une liaison à SortCarb n'a pas pu être détectée (Figures supplémentaires S7A et B). SortCo et SortCarb sont liés à la protéine associée au récepteur humain fusionnée à une étiquette GST, mais pas à la GST seule, soutenant l'intégrité structurelle Q26 de la sortiline quel que soit son statut de carbamylation et démontrant la spécificité de notre cadre expérimental (Figure supplémentaire S7C– F).

Ensuite, nous avons évalué si l'affinité altérée pour l'IL-6 pouvait affecter les voies de signalisation impliquées dans la calcification vasculaire. Dans les hSMC calcifiantes, l'ajout d'IL-6 à SortCarb a favorisé l'expression de l'ARNm ALPL et RUNX2 (Figure 3d et e) ainsi que l'activité TNAP (Figure 3f), alors qu'il n'a eu aucun effet en combinaison avec SortCo. Ces données indiquent que la carbamylation de la sortiline augmente la capacité de liaison du ligand à l'IL -6, ce qui entraîne une augmentation de la calcification des cellules musculaires lisses.

La carbamylation de la sortiline est associée à une calcification vasculaire chezchroniqueun reinmaladiepatients Sur la base de nos données, il a été constaté que les résidus de sortiline carbamylée s'associaient àchroniqueun reinmaladieet la calcification, nous avons ensuite étudiéchroniqueun reinmaladieparticipants de l'étude CARVIDA, chez qui les scanners tomodensitométriques ont quantifié le CAC. Comme les participants à l'étude CARE FOR HOMe, la plupart des participants à CARVIDA avaient 2 et 3 PTM, les résidus de lysine 95 et 26 0 étant fréquemment affectés (Figure supplémentaire S8A). Comparativement aux patients sans résidus carbamylés, les patients avec 1 résidu de sortiline carbamyl-lysine étaient plus âgés (P ¼ 0.002), avaient un DFGe inférieur (P ¼ 0,008), étaient plus fréquemment (anciens) fumeurs (P ¼ 0,023) et avaient un volume de CAC significativement plus élevé (P < 0,001="" ;="" figure="" 4a="" et="" tableau="" supplémentaire="">

Ln- (CAC plus 1) au départ était corrélé à la présence et à l'augmentation de la sortiline carbamylée post-traductionnelle (tableau supplémentaire S7). En outre, Ln-(CAC þ 1) était également associé au sexe masculin, au diabète sucré, aux médicaments antidiabétiques et hypolipémiants, à un âge plus avancé, à l'IL sérique -6 et à l'hémoglobine A1c, et à un eGFR et à une lipoprotéine de haute densité sérique inférieurs ( Tableau supplémentaire S7). Néanmoins, l'association entre les résidus de sortiline carbamylée et la ligne de base Ln-(CAC þ 1) est restée significative après ajustement pour toutes les variables mentionnées ci-dessus (P ¼ 0.029 ; Tableau 3).

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Ensuite, nous avons évalué si la présence de résidus carbamylés avait un impact sur la progression du CAC. La présence de sortiline carbamylée (vs. pas de carbamylation) a augmenté la progression du CAC (P ¼ 0.047). En détail,chroniqueun reinmaladieles patients avec sortiline carbamylée (n ¼ 33) ont montré une augmentation significative de la progression du CAC sur une durée médiane de suivi de 4,4 ans (Figure 4b), avec une augmentation annuelle du volume médian du CAC de 30.32 Q27 (interquartile gamme ¼ 84,0) (Figure 4C). En revanche,chroniqueun reinmaladieles patients sans carbamylation de la sortiline (n ¼ 8) ont révélé une variation annuelle du volume médian du CAC de 1,63 (écart interquartile ¼ 8,54) et aucune progression significative du CAC au cours de la période de suivi (Figure 4b et c). Après ajustement pour les covariables associées à la progression du CAC (volume de base du CAC, âge, sexe, indice de masse corporelle, DFGe, diabète sucré, IL sérique -6, lipoprotéines de haute densité sérique et hypolipidémiant), le statut de carbamylation était n'est plus associé à la progression du CAC (P ¼ 0.286).

Les patients avec un résidu de carbamyl-lysine 260 ont présenté la plus forte augmentation du volume de CAC que les patients sans résidu carbamylé ou sans résidus de carbamyl-lysine autres que 260 (Figure supplémentaire S8B).

Dans l'ensemble, les données indiquent que la sortiline carbamylée post-traductionnelle est associée au volume de CAC et à sa progression chez les patients atteints dechroniqueun reinmaladie.

DISCUSSION

Dans diverses études expérimentales in vitro et in vivo et 2 cohortes prospectives indépendantes, nous démontrons que les patients atteintschroniqueun reinmaladieprésentent un schéma spécifique de résidus post-traductionnels de sortiline lysine carbamylée dans la circulation, qui peuvent également être détectés dans la paroi vasculaire. De plus, la carbamylation de la sortiline était associée au CAC danschroniqueun reinmaladiepatients, quel que soit leur âge,un reinfonction et d'autres facteurs de risque de calcification. Mécaniquement, nous avons pu montrer que la carbamylation de la sortiline augmente sa capacité à se lier à l'IL-6 et agit directement sur les cellules vasculaires pour favoriser la calcification vasculaire (Figure 4d). Dans son ensemble, cette étude a révélé un nouveau facteur de risque non traditionnel de calcification, qui contribue potentiellement au fardeau élevé decardiovasculairemaladies danschroniqueun reinmaladie.

La carbamylation des protéines peut être médiée par le cyanate, qui se développe lors de la décomposition spontanée de l'urée ou est généré par l'oxydation du thiocyanate catalysée par la myéloperoxydase au niveau des sites d'inflammation.24 Nous avons montré quechronique un reinmaladieles patients avec des niveaux d'urée plus élevés en raison de la réductionun reinprésentait plus de résidus de carbamylation de la sortiline que les témoins sains. Cependant, nous n'avons trouvé aucune association entre les niveaux totaux et l'activité de la myéloperoxydase et de la carbamylation de la sortiline, ce qui suggère que l'urémie est le principal moteur de la carbamylation de la sortiline chezchroniqueun reinmaladie. De plus, nos données démontrent que l'âge, le NT-proBNP et une faible consommation d'antagonistes de l'aldostérone sont associés à davantage de résidus carbamylés. Nos données sont cohérentes avec les rapports précédents qui identifiaient le vieillissement comme un médiateur important de la carbamylation des protéines.25 Il a été démontré que les médicaments antihypertenseurs hydrochlorothiazide et amlodipine affectent les niveaux d'homocitrulline, un acide aminé lié au cycle de l'urée et un produit dérivé de la carbamylation.26 Si la prise d'antagonistes de l'aldostérone diminue l'homocitrulline, et donc réduit les résidus carbamylés danschroniqueun reinmaladiemalades, est inconnue. Drechsler et al. ont démontré une corrélation entre l'albumine carbamylée sérique et le NT proBNP, qui était associée à l'insuffisance cardiaque chez les patients dialyséschroniqueun reinmaladiepatients.27 On ne sait pas si la carbamylation de la sortiline peut également servir de facteur de risque d'insuffisance cardiaque, mais une calcification coronarienne accrue avec des effets potentiellement nocifs sur la fonction cardiaque pourrait expliquer l'association entre les résidus de sortiline carbamylée et les niveaux de NT proBNP dans notre étude.

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Des études récentes ont identifié le rôle de la sortiline dans la pathogenèse des troubles vasculaires et métaboliques, mais se sont principalement concentrées sur l'expression tissulaire de la sortiline plutôt que sur l'exploration de la fonction de la forme soluble.7 La sortiline circulante peut provenir de l'excrétion cellulaire de son domaine luminal, comme démontré in vitro , 28–30, et de vésicules extracellulaires sécrétées remplies de sortiline.9,31 La carbamylation entraîne des altérations des propriétés de charge, structurelles et fonctionnelles des protéines, entraînant une perte de fonction et des réponses cellulaires et moléculaires potentiellement pathophysiologiques.5 Nous avons établi pour la première fois un schéma spécifique de carbamylation des résidus de lysine de la sortiline en circulation danschroniqueun reinmaladie, en utilisant une approche MS ciblée, et prédit les altérations fonctionnelles et structurelles par modélisation in silico. Nous proposons que la carbamylation de la lysine favorisera la conformation à pH acide de la sortiline, affectant l'affinité ligand dépendante du pH de la sortiline. Des études antérieures sur la structure cristalline ont démontré qu'à pH 5,5, qui représente un environnement similaire à celui des endosomes tardifs, la sortiline subit des changements de conformation et la formation de dimères, rendant les sites de liaison connus indisponibles pour la liaison du ligand.32,33

La lysine 260 forme une liaison hydrogène avec une tyrosine de neurotensine à l'intérieur du tunnel de l'hélice b, laissant entendre que d'autres ligands qui se lient de manière similaire à la neurotensine seraient également affectés. Notre enquête a révélé une affinité accrue de l'IL-6 pour la sortiline carbamylée, suggérant une participation aux voies de signalisation de l'IL-6. Plusieurs études ont suggéré que l'IL-6 pourrait contribuer à la calcification vasculaire chezchroniqueun reinmaladie.22,34,35 rôle fonctionnel dans la pathologie vasculaire calcifiante. La sortiline carbamylée soluble a favorisé la calcification vasculaire in vitro et ex vivo en augmentant les gènes cibles ostéogéniques, l'activité TNAP et la minéralisation de la matrice. De plus, l'ajout d'IL-6 à la sortiline carbamylée a encore augmenté les gènes cibles ostéogéniques et l'activité TNAP.

La carbamylation a été associée à une altération de la matrice extracellulaire,36 au stress oxydatif,25 aux dysfonctionnements endothéliaux,37 et à l'athérosclérose,38 tous impliqués dans l'initiation et la progression de la calcification. Bien que Mori et al. ont rapporté que la carbamylation des protéines favorise la calcification vasculaire par la carbamylation des protéines mitochondriales,6 aucune protéine cible spécifique n'a été identifiée. Une étude récente a démontré que la carbamylation de l'uromoduline entraînait une perte de ses propriétés anti-calcifiantes in vitro. 39 Les deux études ont utilisé le Western blot pour détecter la carbamylation en général. Nous avons démontré que la sortiline carbamylée in vitro imite le modèle spécifique de modification de la lysine in vivo trouvé danschroniqueun reinmaladiepatients utilisant la SEP. Ainsi, notre étude fournit des indices sur des mécanismes spécifiques reliantchroniqueun reinmaladie, carbamylation des protéines, IL-6 et calcification.

Auparavant, des taux élevés de sortiline sérique étaient associés à la fois à la calcification de l'aorte abdominale et àcardiovasculaireevents independent of traditional Framingham risk factors in a community-dwelling cohort of men aged >50 ans.10 Chez les patients souffrant de douleurs thoraciques à risque faible à intermédiaire, les taux de sortiline n'étaient pas associés à la gravité de la maladie coronarienne.40 Dans cette étude, nous avons pu montrer que les patients souffrant dechroniqueun reinmaladieont des niveaux de sortiline plus élevés que les contrôles avec la normaleun reinfonction. Les niveaux de sortiline n'ont pas augmenté avec la diminutionun reinfonctionner une fois qu'un patient a eu unchroniqueun reinmaladieavec DFGe<60 ml/min="" per="" 1.73="" m2.="" however,="" we="" observed="" an="" increase="" of="" carbamylated="" sortilin="" residues="" with="" decreased="">un reinfonction. De même, Kalim et al. n'ont rapporté aucune association entre les taux d'albumine totale et carbamylée chezchroniqueun reinmaladiepatients.41 Carbamylation de la sortiline, résultant d'uneun reinfonction, pourrait encore augmenter la calcification vasculaire liée àchroniqueun reinmaladie-les perturbations minérales associées. Notre étude comporte plusieurs forces et limites. Les points forts incluent l'analyse des données obtenues in vitro, ex vivo et chez les patients en utilisant différentes approches expérimentales. La caractérisation minutieuse des patients atteints dechroniqueun reinmaladie, y compris des questionnaires standardisés pour évaluer les caractéristiques des participants, des visites d'étude en personne menées par des infirmières formées à l'étude et des mesures de nombreuses valeurs de laboratoire et de calcification, est une force particulière de l'étude. La petite cohorte peut sembler limiter notre étude ; cependant, nous avons utilisé deschroniqueun reinmaladiecohortes avec des données de suivi pour la calcification pour valider le statut de carbamylation de la sortiline par MS ciblée laborieuse. Les résultats cliniques ont été rédigés en allemandchroniqueun reinmaladiepatients et peut donc limiter la généralisation des résultats à d'autres pays ou ethnies. Enfin, bien que la conception de l'étude ait permis un ajustement pour de nombreux facteurs de confusion importants, la confusion résiduelle, comme dans toute étude observationnelle, ne peut pas être entièrement exclue.

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Conclusion

En conclusion, il s'agit de la première étude démontrant des acides aminés spécifiques modifiés après la traduction dans la sortiline en circulation. Nos données suggèrent que la présence dechroniqueun reinmaladiefavorise la carbamylation de la sortiline circulante et que la sortiline carbamylée présente des propriétés procalcifiantes, comme démontré in vitro, ex vivo, et par sa présence dans les tissus calcifiés. La carbamylation de la sortiline était associée au CAC, même après ajustement pour l'âge,un reinfonction, et plusieurs autres facteurs de risque, suggérant que la prévention de la carbamylation de la sortiline pourrait réduire le risque decardiovasculairecalcification et donccardiovasculairecomplications chez les patients atteintschroniqueun reinmaladie. Ainsi, nos résultats indiquent que la sortiline carbamylée contribue à lacardiovasculairecharge de morbidité danschroniqueun reinmaladieles patients.

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RÉFÉRENCES

Cette source est de Vera Jankowski, IMCAR, faculté de médecine, RWTH Aachen University, Aachen, Allemagne, etc.