Partie 2 : Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche Tubulosa induisent l'apoptose des cellules de carcinome hépatocellulaire et renforcent l'effet antitumoral
Mar 25, 2022
Contact :ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, et Jinyao Li, PhD1
CLIQUEZ ICI POURPARTIE 1
Résultats
Le CTPG a inhibé la prolifération des cellules HCC in vitro
Les composants du CTPG ont été qualifiés et quantifiés par HPLC à l'aide d'étalons d'échinacoside et d'actéoside (Figure supplémentaire 1A), qui étaient les principaux composants des glycosides phényléthanoïdes deCistanche.18 Selon les temps de rétention des pics et les surfaces des pics, le CTPG contenait 28 % d'échinacoside et 9,9 % d'actéoside. En outre, la teneur en polysaccharides du CTPG était de 34,8 % par la méthode au phénol-acide sulfurique.19 Le test MTT a montré que le CTPG réduisait considérablement la viabilité des cellules BEL-7404 et HepG2 d'une manière dépendante de la dose et du temps ( Figure 1A). De manière constante, la prolifération des cellules BEL-7404 a été significativement inhibée par le traitement CTPG, qui a été analysé par coloration Ki-67 (Figure 1B). L'effet du CTPG sur la prolifération des splénocytes in vitro a également été analysé par dosage MTT. Nous avons observé que le CTPG augmentait la prolifération des splénocytes de manière dose-dépendante (figure 1C).
La voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) joue un rôle central dans la survie, la différenciation et la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses humaines.20 Afin de déterminer si la voie de signalisation MAPK était impliquée dans l'effet inhibiteur du CTPG sur la prolifération des cellules HCC, les niveaux de phosphorylation de diverses protéines de la voie du signal MAPK ont été analysés dans des cellules HepG2 après traitement avec CTPG à différentes concentrations et à différents moments. La phosphorylation de JNK (P-JNK) et p38 (P-p38) a été augmentée de manière dose-dépendante par le traitement au CTPG. La phosphorylation de ERK (P-ERK) a été régulée à la baisse par un traitement CTPG à 200 et 400 ug/mL, tandis que P-ERK a été régulée à la hausse sous un traitement CTPG à 600 ug/mL (figure 1D). De plus, les niveaux de P-JNK, P-p38 et P-ERK ont été régulés à la hausse de manière dépendante du temps (Figure 1D). Ces résultats suggèrent que le CTPG pourrait inhiber la prolifération des cellules HCC via la voie de signalisation MAPK.
Figure 1. L'effet du CTPG sur la prolifération des cellules HCC et des splénocytes.
Arrêt du cycle cellulaire du CHC induit par le CTPG en phase S
Nous avons en outre analysé si le CTPG inhibait la prolifération des cellules HCC par induction de l'arrêt du cycle cellulaire. Après traitement au CTPG, une accumulation de cellules BEL-7404 en phase S a été observée de manière dose-dépendante. De même, le CTPG a également induit l'arrêt du cycle cellulaire HepG2 en phase S et les fréquences sont passées de 40,66 % dans le groupe témoin à 61,90 % dans le groupe traité avec 600 ug/mL de CTPG (figure 2A). Les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (CDK) jouent un rôle important dans le contrôle et le développement de la division cellulaire,21 qui étaient associés à la phase G2/M.22 Progression en phase S. Les niveaux d'expression de la cycline B1, CDK1 et CDK2 ont également été réduits ; ces protéines étaient associées à la phase G2/M (figure 2B). Ces résultats suggèrent que le CTPG supprime la prolifération des cellules HCC en induisant l'arrêt du cycle cellulaire.
Voie d'apoptose dépendante des mitochondries activée par le CTPG dans les cellules HCC
Nous avons également détecté si le CTPG déclenchait l'apoptose dans les cellules HCC et avons constaté que le CTPG induisait l'apoptose dans les cellules HepG2 et BEL -7404 de manière dose-dépendante (figure 3A). En outre, les niveaux d'expression de Bax et Bcl -2 ont été augmentés et diminués par le traitement CTPG de manière dose-dépendante, respectivement (figure 3B). L'apoptose des cellules HepG2 a été en outre déterminée par coloration Hoechst 33342 après traitement au CTPG pendant 24 heures. La morphologie nucléaire a été observée par un microscope inversé à fluorescence. Comme le montre la figure 3C, les cellules HepG2 témoins ont été colorées de manière homogène tandis que les cellules HepG2 traitées avec CTPG ont montré une condensation et une fragmentation de la chromatine de manière dose-dépendante, ce qui était similaire aux cellules HepG2 traitées avec du cisplatine. Ces résultats ont indiqué que le CTPG induisait l'apoptose des cellules HCC.
L'intégrité de la membrane mitochondriale externe est strictement régulée par la famille Bcl-2 et la réduction de Δψm favorise la libération de cytochrome c qui active la cascade de caspases pour induire l'apoptose.23,24 Lorsque Δψm diminue, le JC{{3 }} polymère (fluorescence rouge) se décompose en monomères (fluorescence verte).25 Par conséquent, les cellules Δψmof HCC ont été détectées par coloration JC-1 après un traitement au CTPG pendant 24 heures. Comme le montre la figure 4A, l'intensité de fluorescence verte du canal FL-1 a été augmentée en fonction de la dose par le traitement CTPG tandis que l'intensité de fluorescence rouge du canal FL-2 a été diminuée en fonction de la dose dans les deux BEL{ {12}} et cellules HepG2. L'observation au microscope à fluorescence inversée a montré un résultat similaire (figure 4B), indiquant que le CTPG réduit le Δψm des cellules HCC. Par la suite, nous avons observé que les niveaux de cytochrome c étaient augmentés dans les cellules BEL -7404 et HepG2 après le traitement au CTPG (figure 4C), ce qui confirmait davantage la réduction de Δψm dans les cellules HCC traitées au CTPG.
La libération de cytochrome c peut activer la caspase initiatrice-9 pour induire l'apoptose.26 Les résultats du test Western blot suggèrent que les niveaux de caspase clivée-3, -7 et{{4} } ont été augmentés tandis que le niveau de caspase clivée -8 n'a pas été modifié (Figure 5). La caspase activée-3 peut cliver l'enzyme de réparation de l'ADN de la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) pour empêcher la réparation de l'ADN et accumuler des dommages à l'ADN.27 Nous avons également observé des niveaux régulés à la hausse de PARP clivée. Le rôle de la cascade de caspases dans l'apoptose des cellules HCC induite par le CTPG a été déterminé en utilisant respectivement un inhibiteur de caspase (Z-VAD-FMK) et un inhibiteur de caspase-3 (Ac-DEVD-CHO). Z-VAD-FMK a inversé de manière significative l'apoptose des cellules BEL -7404 et HepG2 induite par le CTPG (Figure 1B supplémentaire). De même, Ac-DEVD-CHO a également inversé de manière significative l'apoptose des cellules HepG2 induite par le CTPG (Figure 1C supplémentaire). Les résultats ont démontré que le CTPG induisait l'apoptose des cellules HCC par une voie dépendante des mitochondries.
CTPG Suppression de la migration des cellules HCC in vitro
La migration des cellules cancéreuses est considérée comme l'un des processus critiques dans les métastases tumorales. Pour déterminer si le CTPG affecte la migration des cellules HCC, la motilité des cellules HepG2 a été évaluée par le test de cicatrisation. Comme le montrent les figures 6A et B, la migration des cellules HepG2 a été significativement inhibée par le traitement CTPG d'une manière dose-dépendante. La famille MMP et le VEGF jouent un rôle essentiel dans la migration des cellules tumorales.28 Après un traitement au CTPG pendant 24 heures, les taux de MMP-2 et de VEGF ont été considérablement réduits (Figure 6C), ce qui suggère que le CTPG pourrait supprimer l'invasion et les métastases. du HCC.
Le CTPG a amélioré l'immunité des souris
Il a été rapporté queCistanchedésertiquepolysaccharidesontimmunomodulateurles fonctionsy compris la promotion de la prolifération des lymphocytes et l'activation des macrophages.29 Les cellules T et les cellules B sont les principaux lymphocytes, qui interviennent respectivement dans les réponses immunitaires cellulaires et humorales. Le CTPG contenait une teneur en polysaccharides de 34,8 %. Par conséquent, nous avons examiné les effets du CTPG sur la prolifération des lymphocytes T et des lymphocytes B. Comme le montre la figure supplémentaire 2A, le CTPG a augmenté de manière significative la prolifération des lymphocytes T et des lymphocytes B de manière dose-dépendante, même en présence de cisplatine. Fait intéressant, le CTPG a inhibé de manière significative l'apoptose des splénocytes induite par le cisplatine (Figure 2B supplémentaire), indiquant que le CTPG pourrait atténuer les effets secondaires du cisplatine sur le système immunitaire des souris.
Nous avons en outre évalué l'effet immunostimulant du CTPG sur des souris. Après injection ip, injection sc et administration ig de CTPG (200 et 400 mg/kg), il n'y a pas eu de changement significatif de l'état des souris par rapport au groupe non traité. Le poids corporel des souris n'avait également aucune différence significative entre les groupes traités au CTPG et les groupes non traités (figure 7A). Les indices du cœur, du foie, de la rate, des poumons, des reins et du thymus des souris étaient similaires dans tous les groupes, à l'exception des indices de la rate des souris dans le groupe d'injection ip de CTPG de 400 mg/kg (tableau 1). Les résultats suggèrent que les doses sélectionnées de CTPG n'ont eu aucun effet secondaire chez la souris.
La rate est un important organe de défense immunitaire chez les mammifères, et son développement affecte directement la fonction immunitaire de l'individu et sa capacité à résister aux maladies. L'indice d'organe immunitaire reflète le développement et la fonction immunitaire des organes immunitaires. La rate contient une variété de cellules immunitaires, y compris les cellules T, les cellules B, les cellules tueuses naturelles (cellules NK), les macrophages, les cellules dendritiques (DC) et autres, qui jouent un rôle important dans le système immunitaire.3{{2} } Il a été rapporté que les polysaccharides peuvent augmenter le nombre de cellules immunitaires pour renforcer l'immunité du corps. cellules immunitaires dans la rate. Les résultats ont montré que l'injection ip de CTPG augmentait significativement le nombre de lymphocytes T (cellules CD3 plus CD19−) (augmentation de {{10}}.49 fois), de cellules B (CD3−CD19 plus cellules) (augmentation 0.49 fois), et les cellules NK (CD3-CD19-CD49b plus cellules) (augmentées de 1,63 fois) par rapport au groupe non traité. Les cellules T CD4 plus et CD8 plus, en tant que principaux sous-types de cellules T, jouent un rôle important dans la réponse immunitaire cellulaire spécifique à l'antigène.32 Par conséquent, nous avons analysé plus en détail le nombre et l'état d'activation des cellules T CD4 plus et CD8 plus dans le rate. Les résultats ont indiqué que l'injection ip de CTPG a non seulement augmenté de manière significative le nombre de lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus (augmentation de 0 0,55 et 0,34 fois, respectivement), mais a également amélioré l'état d'activation des lymphocytes T CD4 plus (CD4 plus les cellules CD44 plus) (augmenté de 0,84 fois) (figure 7B), ces résultats suggérant que le CTPG avait une fonction de renforcement immunitaire.
Figure 2. Les effets du CTPG sur le cycle cellulaire dans les cellules HCC.
La combinaison du CTPG et du cisplatine a montré un puissant effet antitumoral sur le modèle de souris tumorale H22
Il est généralement admis que la chimiothérapie ou la radiothérapie peuvent conduire à un mauvais pronostic et induire de nombreux événements indésirables, qui peuvent être dus à la suppression du système immunitaire et à des dommages aux tissus et organes normaux. Les polysaccharides de TCM ont des effets de renforcement immunitaire et atténuent les dommages causés aux organes immunitaires et aux cellules immunitaires par la chimiothérapie, par exemple, le chitosan33 et les polysaccharides de Lycium barbarum.34 Le résultat ci-dessus a montré que le CTPG pouvait atténuer les effets secondaires du cisplatine sur le système immunitaire. Par conséquent, l'effet antitumoral du CTPG associé au cisplatine a été évalué dans le modèle murin de tumeur H22. Comme le montre la figure 8A, le CTPG seul, le cisplatine seul et la combinaison de CTPG et de cisplatine (CTPG plus cisplatine) ont significativement supprimé la croissance tumorale H22 par rapport au groupe témoin. Le CTPG plus le cisplatine a montré un effet inhibiteur plus fort que celui du CTPG et du cisplatine seuls. Au 20e jour, les volumes tumoraux dans les groupes contrôle, cisplatine seul, CTPG seul et CTPG plus cis platine étaient d'environ 1707,8, 722,5, 1033,8 et 367,5 mm3, respectivement. Le même jour, les tumeurs ont été recueillies pour observation visuelle (figure 8B) et comparaison de poids (figure 8C). Le CTPG plus le cisplatine a montré de meilleurs effets thérapeutiques sur le modèle murin de tumeur H22 que le CTPG ou le cisplatine seul. Le poids de la tumeur dans le groupe CTPG plus cisplatine était inférieur à celui des autres groupes. Ces résultats suggèrent que l'activité antitumorale du CTPG et du cisplatine entraîne des effets synergiques.
Le poids corporel des souris a été mesuré pour refléter l'état de santé des souris. Le poids corporel a remarquablement diminué après le traitement au cisplatine, suggérant une toxicité systémique sévère induite par le cisplatine.35 En comparaison, le CTPG combiné au cisplatine a considérablement amélioré la perte de poids corporel induite par le cisplatine, tandis que le CTPG seul n'a eu aucun effet significatif sur le poids corporel des souris (Figure 8D). Les organes, y compris la rate, le cœur, le foie, les poumons, les reins et le thymus, ont également été isolés pour calculer les indices d'organes. Comparativement au groupe non traité, les indices spléniques ont été significativement diminués et augmentés par le cisplatine et le CTPG, respectivement. CTPG plus cisplatine a récupéré les indices spléniques par rapport au cisplatine seul. Les autres indices d'organes n'ont montré aucune différence significative entre tous les groupes (tableau 2).
Le CTPG combiné au cisplatine a amélioré l'immunité des souris tumorales
Les résultats ci-dessus ont montré que le CTPG renforçait l'immunité des souris et inhibait l'apoptose des splénocytes induite par le cisplatine. Nous avons en outre étudié si l'effet antitumoral du CTPG plus cisplatine était corrélé à une immunité accrue. Dans le processus d'apparition et de développement de la tumeur, le système immunitaire de l'organisme joue une fonction de surveillance immunitaire importante et l'immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T joue un rôle clé. Les lymphocytes T CD4 plus ont pour fonction d'aider l'immunité cellulaire et la réponse immunitaire humorale, et les lymphocytes T CD8 plus sont les principales cellules effectrices de la réponse immunitaire, qui peuvent spécifiquement tuer les cellules cibles et jouer un rôle important dans l'immunité tumorale et l'immunité antivirale.32 Les rates de souris porteuses de tumeurs ont été prélevées pour détecter le nombre de lymphocytes T et de lymphocytes B par cytométrie en flux. Les fréquences et le nombre de lymphocytes T, y compris les lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus, dans le groupe CTPG plus cisplatine étaient significativement plus élevés que ceux du groupe témoin (augmentation de 0,55 et 0,7 fois, respectivement) et les groupes cisplatine (augmentation 0.92 et 1,16 fois, respectivement) (Figure 9A et B). Par rapport au groupe témoin, le CTPG seul a également augmenté en partie le nombre de lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus, bien qu'il n'y ait pas eu de différence significative. Les fréquences et le nombre de lymphocytes B n'avaient pas de différence significative entre tous les groupes.
Les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les cellules T régulatrices (Tregs) se développent dans les tumeurs et inhibent les réponses immunitaires antitumorales ; ils suppriment l'activation et l'expansion des lymphocytes T CD4 plus, la fonction des lymphocytes T effecteurs, l'activation et/ou la prolifération et la formation de cytokines des lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus, la prolifération des lymphocytes B et la production et le changement de classe des immunoglobulines, le les fonctions cytotoxiques des NK et des cellules T tueuses naturelles (NKT), ainsi que la fonction et la maturation des DC.36-38 Les fréquences et le nombre de MDSC (CD11b plus Gr-1 plus ), les macrophages (CD11b plus Gr{ {9}}-) et les Tregs (Tregs naturels : CD4 plus CD25 plus Foxp3 plus ; Tregs induits : CD4 plus CD25−Foxp3 plus ) dans la rate de souris tumorales ont été analysés par cytométrie en flux. Comparativement au groupe témoin, les fréquences et le nombre de MDSC ont diminué de manière significative après injection de cisplatine seul (diminué de 1,56 fois) ou en association avec le CTPG (diminué de 0,62 fois). Le nombre de macrophages CD11b plus Gr-1− a également diminué de manière significative bien qu'il n'y ait eu aucun changement significatif dans leurs fréquences (Figure 9C). De plus, le traitement au CTPG seul et au CTPG plus cisplatine a significativement diminué les fréquences des Tregs induits (diminution 0.33 et 0.37 fois, respectivement) (Figure 9D). Ces résultats suggèrent que l'effet antitumoral du CTPG plus le cisplatine pourrait être corrélé à l'amélioration de l'immunité caractérisée par l'augmentation du nombre de lymphocytes T et la diminution du nombre de MDSC et de Tregs.
Cistanche renforce l'immunité.
Discussion
Il a été rapporté que la TCM pouvait induire l'apoptose de diverses cellules tumorales par différentes voies, y compris le récepteur de mort extrinsèque, les voies de stress intrinsèques mitochondriales et du réticulum endoplasmique (ER).39 Notre étude précédente a montré que la sous-fraction N-butanol de Brassica rapa L. induit l'apoptose des cellules d'adénocarcinome pulmonaire A54916 et des extraits à l'éthanol de Pleurotus ferulae cultivés et sauvages ont induit l'apoptose des cellules H22 via la voie dépendante du stress ER et des mitochondries.17 Nous avons également signalé que le CTPG inhibait la croissance des cellules B16-F10 du mélanome et les cellules Eca-109 du carcinome de l'œsophage par l'induction de l'apoptose via une voie mitochondriale dépendante.13 L'échinacoside est un composé important avec de nombreuses activités biologiques dans les PhG. Il a été rapporté que l'échinacoside exerçait ses fonctions antiprolifératives et pro-apoptotiques sur la lignée cellulaire HepG2 HCC en diminuant l'expression de TREM2 et la signalisation PI3K/AKT.40 Dans la présente étude, nous avons constaté que le CTPG inhibait la croissance du HCC humain HepG2 et BEL{{18 }} via l'activation de la voie de signalisation MAPK et l'induction de l'apoptose via la voie dépendante des mitochondries. Bax et Bcl-2 jouent un rôle essentiel dans la voie de l'apoptose dépendante des mitochondries.24 Ici, nous avons constaté que CTPG augmentait l'expression de Bax et réduisait l'expression de Bcl-2 dans HepG2 et BEL{{25 }}, ce qui a entraîné la réduction de Δψman et la libération de cytochrome c pour activer la cascade des caspases. Les niveaux régulés à la hausse de caspase clivée-9 et de caspase clivée-3 ont été observés après le traitement CTPG, tandis que les niveaux de caspase clivée-8 n'ont pas été modifiés par le traitement CTPG, ce qui suggère que l'apoptose de Les cellules HepG2 et BEL-7404 induites par le CTPG n'étaient pas médiées par la voie de signalisation extrinsèque. Cependant, notre étude précédente a montré que le CTPG induisait l'apoptose des cellules H22 par des voies intrinsèques et extrinsèques.15 Ces résultats suggéraient que le CTPG pourrait inhiber la croissance des cellules tumorales par de multiples cibles et voies.
La MTC a été largement utilisée pour traiter le cancer par plusieurs voies de signalisation avec ou sans effets secondaires mineurs.41 La voie de signalisation MAPK est étroitement liée à l'apparition, à l'invasion et à la métastase des cellules tumorales, qui implique principalement la voie p38, la voie JNK/SAPK , et voie ERK1/2.20 L'activation de p38 et JNK peut induire l'apoptose mais l'activation de ERK1/2 peut être anti-apoptotique ou pro-apoptotique selon les propriétés cellulaires.42 Il a été rapporté que CHM induisait l'apoptose de cellules tumorales en activant les voies p38, JNK ou ERK MAPK.43,44 Nous avons constaté que le CTPG régulait à la hausse les niveaux phosphorylés de p38, JNK et ERK, suggérant que la voie de signalisation MAPK pourrait être impliquée dans l'apoptose des cellules HCC induite par le CTPG.
La chimiothérapie et la radiothérapie peuvent provoquer divers effets indésirables, notamment la suppression du système immunitaire. Afin d'améliorer l'efficacité clinique de la chimiothérapie, les polysaccharides naturels ont été approuvés pour être utilisés comme adjuvants pour le traitement du cancer. Il a été rapporté que la combinaison de lentinan et de l'agent chimiothérapeutique tégafur améliorait l'efficacité clinique des patients atteints de carcinome de l'œsophage en renforçant la fonction immunitaire du patient.45 Dans nos études précédentes, l'effet inhibiteur in vivo du CTPG sur la croissance tumorale est lié à la non seulement son effet antitumoral direct mais aussi sa fonction de renforcement immunitaire.13,15 La fonction de renforcement immunitaire du CTPG pourrait être corrélée à sa teneur en polysaccharides. Ici, l'effet antitumoral in vivo du CTPG plus cisplatine a été étudié. Dans le modèle de souris tumorale H22, CTPG plus cisplatine a non seulement montré le meilleur effet antitumoral, mais a également réduit les effets secondaires du cisplatine. CTPG plus cisplatine a amélioré l'immunité des souris porteuses de tumeurs en augmentant le nombre de lymphocytes T CD4 plus et CD8 plus et en diminuant le nombre de MDSC et de Tregs, qui ont participé au microenvironnement inhibiteur induit par la tumeur, favorisé la croissance tumorale et inhibé la réponse immunitaire .46 Le nombre accru de lymphocytes T pourrait être corrigé avec leur prolifération favorisée par le CTPG et leur diminution de l'apoptose protégée par le CTPG. Cependant, les mécanismes du CTPG pour réduire le nombre de MDSC et de Treg doivent être étudiés plus avant.
En conclusion, le CTPG a induit l'apoptose dans les cellules HCC par les voies de signalisation dépendantes des mitochondries et MAPK in vitro et a inhibé la croissance du HCC par des effets antitumoraux directs et une amélioration immunitaire indirecte en combinaison avec le cisplatine. Le CTPG pourrait servir de candidat potentiel pour le traitement du CHC.
comprimés de cistanche
Pour plus d'informations, veuillez cliquer sur l'image.
