Partie 2 Détection des médicaments Cistanches Herba (Rou Cong Rong) à l'aide de signatures nucléotidiques spécifiques à l'espèce

En recherchant les signatures nucléotidiques développées dans cette étude, nous avons découvert que 15 des 31 médicaments brevetés chinois étiquetés comme contenantCistanches Herbacontenaient plutôt des adultérants, dont huit ingrédients contrefaits et sept adultérants (tableau 2). Par exemple, six lots ont été remplacés par Cy. songaricum, comprenant trois lots de pilules Shihu Yeguang, un lot de pilules Kangguzhi Zengsheng, un lot de capsules Sanbao et un lot de particules Wenweishu.

De plus, différents lots du même fabricant ont produit des résultats quelque peu différents. Par exemple, parmi trois lots d'un même fabricant (ZCY16, ZCY69 et ZCY71), un lot comprenait un mélange de Ci.désertiqueet Cy. songaricum, un lot comprenait un mélange deCi. désertiqueetCi. tubuleuxet un lot ne contenait queCi. tubuleux. Deux lots d'un autre fabricant (ZCY44 et ZCY70) différaient également : un lot contenait du Cy. songaricum, alors que l'autre lot contenaitCi. désertiqueetCi. tubuleux.

Cistanches Herbaa été détecté dans 23 des 31 médicaments brevetés chinois testés (tableau 2), et seuls 16 échantillons étaient authentiques, c'est-à-dire sans adultérants ni ingrédients contrefaits.Ci. tubuleuxa été détecté dans 16 lots de médicaments brevetés chinois, et Ci. deserticola a été détecté dans 10 lots. O. coerulescens n'a été détecté dans aucun des produits (tableau 2).

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DISCUSSION

La nécessité de développer une nouvelle méthode de surveillance des médicaments disponibles dans le commerce contenantCistanchesHerbe

Cistanches Herbaest un tonique largement utilisé dans les médicaments brevetés chinois réparateurs et d'autres produits médicinaux. Cependant, le contrôle de la qualité des médicaments brevetés chinois présente un grand défi en raison de la diversité et de la complexité des ingrédients. En raison de l'absence de surveillance réglementaire, il existe un risque considérable de falsification ou de contrefaçon de produits. De plus, tous les produits doivent être transformés conformément à la pharmacopée ou à d'autres normes ; la falsification ou la contrefaçon n'est pas autorisée pendant le traitement. Ainsi, diverses méthodes de contrôle de la qualité ont été établies, telles que la chromatographie liquide bidimensionnelle multi-cœur (Yao et al., 2015), la spectroscopie de réflectance dans le proche infrarouge (Zhang et Su, 2014 ; Zhang et al., 2015 ) et chromatographie liquide-spectrométrie de masse (Wang et al., 2016b). Cependant, les méthodes de chimie analytique actuellement utilisées par la Commission de la pharmacopée chinoise (2015) ne peuvent pas être utilisées pour authentifier tous les ingrédients des médicaments brevetés chinois ou pour détecter la présence d'ingrédients adultérants. De plus, des études ont montré que les métabolites ciblés dans les plantes sont altérés pendant la transformation du produit, ce qui entraîne une variabilité considérable des résultats des tests ou un échec complet des méthodes de test (Ananingsih et al., 2013). Ainsi, des outils moléculaires tels que les signatures nucléotidiques spécifiques à l'espèce sont sur le point de renforcer les systèmes de contrôle de la qualité contre le risque de substitution et d'adultération frauduleuses de produits et d'inclusion d'ingrédients non étiquetés.

Bien que l'ITS/ITS2 soit considéré comme un outil très efficace pour l'identification des médicaments à base de plantes, ces séquences ne peuvent pas être amplifiées à partir d'échantillons hautement traités (Newmaster et al., 2013 ; de Boer et al., 2015). Wang et al. ont rapporté que ITS2 ne pouvait pas être amplifié à partir d'extrait d'Angelicae Sinensis Radix ou de décoctions bouillies pendant plus de 120 min (Wang et al., 2016a). Selon les technologies traditionnelles et la Commission de la pharmacopée chinoise (2015), Cistanches Herba est toujours hautement transformé pour augmenter son efficacité médicinale ; ces processus comprennent le séchage au four, le salage et la cuisson à la vapeur avec du vin (Zou et al., 2017), qui entraînent la dégradation de l'ADN. De plus, divers excipients sont ajoutés pendant le traitement, tels que le miel, l'amidon et la dextrine. Si ces excipients ne sont pas complètement éliminés, la pureté de l'ADN sera affectée. Par exemple, le processus de fabrication suivant est utilisé pour générer des gélules de Sanbao contenant Cistanches Herba : "Faire bouillir les tranches médicinales pendant 1,5 h deux fois, combiner les décoctions et filtrer le mélange. Concentrer le filtrat à une densité relative de 1,20∼1,25 (à 80 ◦C).Ajouter d'autres poudres broyées et les mélanger pour obtenir un mélange homogène.Ensuite, sécher le mélange à 60◦C, puis le broyer en une fine

Cependant, après le processus de production décrit ci-dessus, il pourrait y avoir des difficultés lors de l'extraction de l'ADN des médicaments brevetés chinois, et de longs fragments pourraient ne pas être amplifiés à partir de l'ADN dégradé, ce qui empêcherait l'identification des adultérants. Ainsi, pour assurer la qualité et pureté de l'ADN, nous avons ajouté des étapes supplémentaires avant l'extraction de l'ADN génomique, y compris le lavage avec un tampon de prélavage et l'élution de dix tubes parallèles dans un tube pour chaque lot.

Bien que tous les médicaments brevetés chinois utilisés dans la présente étude contiennent de 6 à 25 ingrédients, les paires d'amorces développées pourraient amplifier spécifiquement les séquences des adultérants dans ces médicaments brevetés chinois. Le séquençage direct des produits de PCR a montré des fichiers de trace propres. Ainsi, cette méthode de signature nucléotidique est capable d'identifier à la fois les ingrédients d'espèces authentiques et les adultérants et devrait élargir l'application des outils de diagnostic moléculaire basés sur l'ADN pour la surveillance du marché.

les lésions et maladies rénales peuvent être traitées par cistanche

Signatures nucléotidiques pour l'identification efficace des produits Cistanches Herba

Les outils moléculaires qui utilisent la technologie PCR sont très prometteurs pour l'authentification des médicaments dans les systèmes de contrôle qualité. L'application réussie des amorces pour identifier les adultérants dégradés par l'ADN de Cistanches Herba suggère qu'une méthode de détection basée sur la PCR pourrait être largement utilisée. Sur le marché chinois de la phytothérapie, le prix des ingrédients authentiques de l'espèce Cistanches Herba est plus de cinq fois supérieur au prix de ses adultérants. Nos résultats ont montré que Cy. songaricum est l'adultérant de Cistanches Herba le plus courant sur le marché, suivi de Ci. Sinensis. Cy. songaricum a été ajouté car ces médicaments partagent des caractéristiques morphologiques similaires. De plus, la composition chimique de Ci. sinensis est similaire à celle de Cistanches Herba. En tant que marqueurs de contrôle de la qualité pourCistanches Herbaextraits, l'échinacoside et l'actéoside peuvent être extraits à peu de frais de Ci. sinensis. Ainsi, certaines usines pharmaceutiques utilisent Ci. sinensis comme substitut dans la production d'extraits de Cistanches Herba. Pris ensemble, les résultats de cette étude indiquent qu'il existe une fraude considérable sur le marché des médicaments.

L'adultération dans la médecine brevetée chinoise est similaire à celle trouvée dans d'autres pays. Des niveaux similaires d'adultération ont été enregistrés en Amérique du Nord (Newmaster et al., 2013), en Europe (Raclariu et al., 2017) et en Asie (Cheng et al., 2014 ; Shanmughanandhan et al., 2016 ; Gao et al., 2016 ; Gao et al. , 2017). Dans cette étude, le taux de falsification des médicaments brevetés chinois était d'environ 48,4 %, seuls 16 des 31 échantillons étant des Cistanches Herba authentiques. De plus, nous avons émis l'hypothèse que les différents résultats produits dans les produits du même fabricant pourraient être attribués à des différences dans les qualités des différents lots de matériaux de médecine chinoise. Par conséquent, pour contrôler la qualité des médicaments brevetés chinois, les matières premières doivent être authentifiées avant d'être transformées en produits.

Falsification deCistanches Herbaest traditionnellement associée aux questions d'offre et de demande de matières premières.Ci. désertiqueetCi. tubuleuxsont les deux plantes originales actuellement utilisées pour formulerCistanches Herba. Cependant, Ci. deserticola est la seule espèce originale de Cistanches Herba traditionnels authentiques répertoriée dans la Commission de la pharmacopée chinoise (2000), dans laquelle Ci. tubulosa est identifié comme adultérant. En raison de la pénurie de Ci. ressources désertiques,Ci. tubuleuxest répertorié comme supplément dans la pharmacopée chinoise depuis 2005 (Jiang et Tu, 2009). Jusqu'à récemment, les prix de ces herbes différaient sensiblement; Ci. tubulosa a été beaucoup moins cher que Ci. deserticola parce qu'il y a une offre beaucoup plus importante de la première. Ici, nos résultats ont montré que Ci. tubulosa est plus largement utilisé dans les produits Cistanches Herba disponibles dans le commerce.

En conclusion, les signatures nucléotidiques et basées sur la PCR

les méthodes développées dans cette étude peuvent servir d'outils utiles à l'industrie des médicaments pour authentifier les ingrédients et détecter les adultérants dansCistanchesProduits Herba. Conformément au résultat de sensibilité, même si la proportion d'adultérants était de un sur dix mille, il peut être détecté via qRT-PCR. Cela signifie qu'une fois qu'une signature nucléotidique est détectée dansCistanchesProduits fonctionnels contenant de l'herbe, il pourrait être identifié comme un ingrédient adultérant ou contrefait. Une nouvelle solution pour détecter les ingrédients contrefaits ou les Cistanches Herba frelatés a été fournie qui n'était pas disponible auparavant via les méthodes de détection chimique dans la Pharmacopée chinoise. En outre, cette méthode pourrait être utilisée pour valider des types croissants de médicaments et pour élargir les applications des outils de diagnostic moléculaire basés sur l'ADN pour la surveillance du marché.

Pour soulager lechroniqueun reinmaladieaveccistanche

LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR

JH a conçu l'étude et participé à sa conception. XW, RX et JC ont fourni des échantillons et réalisé les expériences. XW a analysé les données. XW, JH, ZZ, S-GN, JS et SC ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

FINANCEMENT

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéro de subvention 81673552], le CAMS Innovation

Fund for Medical Sciences [numéro de subvention 2016-I2 M- 3-016] et United Fund Key Project de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [numéro de subvention U1403224].

REMERCIEMENTS

Nous tenons à remercier nos collègues qui ont aidé à la collecte des échantillons, à l'identification, au travail de laboratoire et à la préparation du manuscrit, notamment Chaokui Sun, Dianyun Hou et Piao Zhang.

MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE

Le matériel supplémentaire de cet article est disponible en ligne à l'adresse : https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2018. 01643/complet#matériel-supplémentaire

Figure supplémentaire S1|Le résultat de l'alignement de la séquence ITS2 de six espèces.

Figure supplémentaire S2|Électrophorèse sur gel d'agarose de tous les échantillons.

Tableau supplémentaire S1|Informations d'échantillonnage de Cistanches Herba et de ses adultérants.

Tableau supplémentaire S2|Informations sur la séquence des espèces apparentées téléchargées à partir de GenBank.

Tableau supplémentaire S3|Les compositions déclarées de différents échantillons de médicaments brevetés chinois.

Fiche de données supplémentaires S1|Toutes les séquences obtenues dans cette étude.

Cistanchedeserticola a de nombreux effets

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Déclaration de conflit d'intérêts : les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l'absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d'intérêts potentiel.

Copyright © 2018 Wang, Xu, Chen, Song, Newmaster, Han, Zhang et Chen. Il s'agit d'un article en libre accès distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution (CC BY). L'utilisation, la distribution ou la reproduction dans d'autres forums est autorisée, à condition que le ou les auteurs originaux et le ou les titulaires des droits d'auteur soient crédités et que la publication originale dans cette revue soit citée, conformément à la pratique académique acceptée. Aucune utilisation, distribution ou reproduction non conforme à ces conditions n'est autorisée.