Partie 3 : Le récepteur cannabinoïde de type 2 favorise la fibrose rénale en orchestrant la signalisation de la B-caténine

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Cependant, il a rarement été rapporté qu'il existe une relation entre le CB2 et la -caténine.

CB2 fait partie de la famille GPCR. Nous avons précédemment découvert que CB2 est exprimé dans les cellules tubulaires, les fibroblastes et les macrophages. CB2 est également exprimé dans les podocytes et les cellules mésangiales.3Le rôle de CB2 dans l'IRC était controversé dans le passé.Malgré la régulation positive de l'ARNm de CB2 et de son principal ligand endogène 2-AG dans les modèles d'IRC, il a été rapporté précédemment un agoniste de CB2 pourrait améliorer la fibrose rénale. "En revanche, nos études précédentes ont identifié un rôle délétère de CB2 dans la fibrose rénale par le biais d'expériences et d'essais génétiques avec l'agoniste inverse CB2 plus sélectif XL-001, un nouvel agoniste inverse CB2 qui présente la plus forte affinité de liaison au récepteur CB2, avec la meilleure sélectivité sur le récepteur CB1 (2594- fois) et un Ki de 0.5 nM. Il convient de noter que la -caténine et ses cibles sont supprimées par ablation génétique ou inhibition pharmacologique de CB2. Étant donné que CB2 est un membre de la famille des GPCR, CB2 pourrait moduler la -caténine. Cependant, cette hypothèse demande à être validée. Dans cette étude, nous avons montré que CB2 médie l'activation de la -caténine par le biais d'une onde de signal GPCR.

Notre étude confirme également le rôle émergent du système endocannabinoïde dans la fibrose rénale. Parmi les 2 principaux endo-cannabinoïdes, l'anandamide (N-arachidonoyléthanolamine) a une affinité plus élevée pour CBl, alors que 2-AG a une affinité similaire pour CB1 et CB2 (son affinité pour CB1 est légèrement plus élevée). Par conséquent, {{ 7}}AG est le principal agoniste endocannabinoïde du récepteur CB2. Notamment, leun reinle cortex présente des niveaux basaux similaires d'anandamide et d'2-AG ; cependant, 2-les niveaux d'AG sont plus augmentés dans les cas d'obstructionfibrosedelaun rein, accompagnée de la diminution des niveaux d'anandamide, ce qui entraîne l'activation à la fois de CB2 et de CB1.rénalfibrosea été démontré par des approches génétiques dans notre étude récente,'' et est encore confirmé dans la présente étude.

Bien qu'un rapport précédent ait montré que CB2 est exprimé à la fois par les cellules inflammatoires et les podocytes à un niveau basal élevé,8 CB2 et son principal ligand endogène 2-AG sont en fait régulés à la hausse après UUO et IRI.7 Notamment, dans la fibrose rénale des souris et une variété de néphropathies humaines, CB2 est principalement exprimé dans l'épithélium tubulaire rénal ainsi que dans les fibroblastes interstitiels et les leucocytes (Figure 2; Figure supplémentaire S1), ce qui suggère que la régulation à la hausse de CB2 est une caractéristique pathologique commune dans les reins fibrotiques. Dans nos études animales, nous avons adopté l'hybridation in situ par fluorescence de CB2 pour identifier son modèle d'expression en raison de son faible coût. La coloration a révélé que CB2 est principalement exprimé dans l'épithélium tubulaire. La raison de cet écart peut résider dans la sensibilité de la technique d'hybridation in situ par fluorescence dans la détection d'ARNm très abondants et le temps d'exposition pour l'imagerie. Nous avons observé CB2 non seulement dans la membrane cellulaire, mais aussi dans la zone cytoplasmique tubulaire, suggérant une internalisation des récepteurs dans des compartiments intracellulaires, tels que les endosomes et les lysosomes.6 La spécificité du test d'hybridation in situ par fluorescence a été confirmée avec un anticorps CB2 primaire, et les deux ont été vérifié chez les souris knock-out CB2 (Figure supplémentaire S1). Fait intéressant, nous avons observé la formation d'hétérodimères de CB2 avec CB1 dans les régions affectées par l'UUO.reinset transformant les cellules tubulaires induites par le facteur de croissance - - (Figure supplémentaire S4), ce qui suggère que leurs effets stimulants peuvent être synergiques. Cependant, l'expression de CB1 n'a pas été affectée par AM1241 ou XL-001, ce qui ajoute une complexité supplémentaire aux mécanismes. Comme mentionné précédemment concernant les effets mutuellement inhibiteurs de CB2 et CB1, «d'autres études devraient être réalisées pour vérifier leurs effets interconnectés, une enquête au-delà de la portée de l'étude actuelle. Néanmoins, nos résultats antérieurs et actuels révèlent systématiquement que le blocage de CB2 est une stratégie d'intervention thérapeutique potentielle pour prévenir la fibrose rénale. En plus d'informer les patients atteints d'IRC, nos résultats fournissent des avertissements de santé au groupe à croissance rapide.

Figure 10|Le récepteur cannabinoïde de type 2 (CB2) est une cible en aval de la -caténine (-cat). (a) L'analyse bioinformatique a révélé la présence de sites de liaison au facteur de cellule T (TCF) putatifs (TBS) dans la région promotrice du CB2 humain et murin gènes. Les séquences et les positions des TBS putatifs dans les gènes CB2 sont surlignées (rouge), tandis que la séquence consensus du TBS est donnée au bas de ce panneau. (b) Résultats représentatifs du test d'immunoprécipitation de la chromatine (ChlP) montrant la liaison du TCF ou du facteur de liaison de l'amplificateur lymphoïde (LEF) -1 à la région promotrice du gène CB2. Humainun reinLes cellules tubulaires proximales (HKC)-8 ont été transfectées avec le plasmide d'expression de la -caténine (pFlag- -cat) ou pcDNA3 pendant 24 heures. Les ysates cellulaires ont été précipités avec un anticorps contre le TCF, le LEF -1, l'histone H3 ou lgG non immunitaire, et le test sur puce a été effectué pour les promoteurs du gène CB2. Le lysat dilué total a été utilisé comme ADN d'entrée génomique total. (c) Présentation graphique du niveau d'ARNm de CB2. Les cellules HKC-8 ont été transfectées avec le plasmide pFlag- -cat ou pcDNA3. L'ARN total a été analysé par réaction en chaîne par polymérase quantitative.*P<0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (d,e)representative="" western="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" overexpression="" of="" β-catenin-induced="" upregulation="" of=""><0.05 versus="" the="" pcdna3="" group="" (n="3)." (f="" representative="" graphs="" show="" β-catenin="" induced="" the="" formation="" of="" a="" cb2/β-arrestin="" 1(β-arr1)/="" proto-oncogene="" src="" complex.="" cell="" lysates="" were="" immunoprecipitated="" (ip)="" with="" an="" antibody="" against="" cb2,="" followed="" by="" immunoblotting="" (b)="" with="" anti-β-arrestin="" 1(β-arr1),="" or="" anti-src.(g-i)representative="" westem="" blot="" and="" quantitative="" data="" show="" the="" expression="" of="" cb2,="" β-arrestin="" 1(β-arr1),="" and="" src.="" hkc-8="" cells="" were="" transfected="" with="" pflag-β-cat="" (or="" pcdna3)="" plasmid="" in="" the="" presence="" or="" absence="" of="" cb2="" small="" interfering="" rna=""><0.001 versus="" the="" pcdna3=""><0.001 versus="" the="" flag-β-catenin="" group="" alone="" (n="">des consommateurs d'endocannabinoïdes, à des fins récréatives et médicinales. Une utilisation intensive chronique pourrait entraîner l'activation continue des récepteurs CB1 et CB2, ce qui pourrait avoir des effets négatifs surun reinsanté.

Bien qu'un rapport précédent ait montré que l'-arrestine 1 joue un rôle dans la fibrose rénale et l'activation de la -caténine, "nous clarifions davantage les mécanismes fonctionnels de la voie médiée par l'-arrestine 1-CB2/-caténine. Nous avons trouvé -arrestine 1 est plus abondant que -arrestin 2 chez les souris IRI (données non présentées) Il est bien connu que -arrestin 1 est responsable de l'activation du GPCR et de la transduction du signal en aval via Src, AKT, protéine kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK1/2) , et d'autres kinases.2que l'activation de Src pourrait médier plusieurs voies de pro-fibrose, telles que le récepteur du facteur de croissance épidermique et le transducteur de signal et l'activateur de la transcription (STAT)3 », nous ne pouvions pas exclure la possibilité que ces voies soient également les voies en aval de CB2. Néanmoins, nos observations suggèrent que la signalisation de la -caténine est médiée par le complexe -arrestin 1/Src induit par CB2-. caténine en la transférant vers le noyau. Une autre nouvelle découverte est que CB2 est une cible de -caténine. Plusieurs cibles de -caténine ont déjà été identifiées dans cette étude. Par conséquent, il est à noter que la voie CB2/-caténine semble créer une boucle d'activation réciproque qui favorise de manière coopérative la pathogenèse de la fibrose rénale.

En résumé, nos résultats suggèrent que le CB2 exprimé de manière aberrante est impliqué de manière critique dans la fibrose rénale par l'activation de la -caténine induite par l'arrestine 1-. -la caténine déclenche l'expression de CB2, ce qui facilite l'activation des récepteurs et la transmission de l'onde signal. Ces résultats (i) illustrent une nouvelle voie CB2/-caténine qui favorise la fibrose rénale et (ii) impliquent que l'inhibition ciblée de CB2 ou -arrestine 1 peut protéger contre la fibrose par inhibition de la boucle d'activation réciproque.

MÉTHODES CONCISES

Pour des méthodes détaillées, voir les méthodes supplémentaires.

Modèles animaux

Des souris mâles C57BL/6 ont été achetées au Experimental Animal Center de la Southern Medical University (Guangzhou, Chine). Pour le modèle IRI, les pédicules bilatéraux ont été clipsés par des pinces à microanévrisme pendant 32 minutes à 37,5 degrés pendant la période d'ischémie et de récupération. Le modèle UUO a été établi en triple-ligaturant l'uretère gauche avec de la soie 4-0 après une incision médiane abdominale. Pour le modèle UIRI, les pédicules gauches ont été clippés pendant 35 minutes à l'aide de pinces à micro-anévrisme, et le pédicule controlatéralun reina été retiré 1 jour avant le sacrifice. Pour le modèle de néphropathie induite par l'acide folique, des souris mâles C57BL/6 ont été traitées avec de l'acide folique via une seule injection intrapéritonéale de 25 mg/kg de poids corporel. L'expression in vivo de Wnt1 ou CB2 ou l'inactivation de -arrestine 1 chez la souris a été réalisée par une approche de délivrance de gènes basée sur l'hydrodynamique. par le comité d'éthique animale de la Southern Medical University, Guangzhou, Chine. Des paires reproductrices de souris nulles CB2 (CB2/) âgées de 6-8 semaines, dans un contexte C57BL/6N, ont été achetées auprès de Cyagen Biosciences (stock no. KOCMP{ {19}}Cnr2 ; Cyagen Biosciences, Guangzhou, Chine). Le déficit en récepteurs CB2 a été confirmé par transcription inverse-PCR.

Échantillons de biopsie rénale humaine et culture cellulaire

Humainun reindes sections (3 μm) ont été obtenues à partir de biopsies rénales réalisées à l'hôpital Nanfang et à l'hôpital populaire du district de Huadu, Université médicale du Sud, Guangzhou, Chine. Les biopsies témoins normales ont été dérivées de non-tumeurun reintissusdes patients qui avaient un carcinome rénal. Les études impliquant des sections de rein humain ont été réalisées avec le consentement éclairé du patient et ont été approuvées par le comité d'éthique institutionnel de l'hôpital Nanfang et de l'hôpital populaire du district de Huadu. Les cellules épithéliales tubulaires proximales humaines (HKC-8) ont été fournies par le Dr Lorraine C. Racusen (Université Johns Hopkins, Baltimore, MD). Les fractions nucléaires et cytoplasmiques ont été séparées avec un kit commercial (BestBio, Shanghai, Chine).

Détermination des taux de créatinine sérique et d'azote uréique sanguin

Les niveaux de créatinine sérique et d'azote uréique sanguin ont été déterminés par un analyseur chimique automatique (analyseur de chimie AU480, Beckman Coulter, Atlanta, GA).

Hybridation in situ

Les sondes CB2 ont été achetées chez Boster Technology, Wuhan, Chine.Un reindes sections (8 μm) ont été fixées avec du formaldéhyde à 4 % et évaluées par coloration par fluorescence de CB2 à l'aide d'un kit commercial (MK2530, Boster Biological Technology, Wuhan, Chine).

Histologie et coloration immunohistochimique et immunofluorescence

Inclus en paraffineun reinles sections ont été colorées à l'aide de la coloration trichrome périodique à l'acide de Schiff et de Masson pour identifier les tubules blessés et déterminer le dépôt de collagène. Les lésions ont été quantifiées à l'aide d'une technique assistée par ordinateur. Une coloration immunohistochimique et immunofluorescente a été réalisée dans des coupes de paraffine et congelées, respectivement. Les anticorps sont décrits dans les méthodes supplémentaires.