Partie 3: L'échinacoside isolé de Cistanche Tubulosa stimule de manière putative la sécrétion d'hormone de croissance via l'activation du récepteur de la ghréline

L'échinacoside isolé de Cistanche tubulosa stimule potentiellement la sécrétion d'hormone de croissance via l'activation du récepteur de la ghréline

Chieh-Ju Wu 1, Mei-Yin Chien 2, Nan-Hei Lin 1, Yi-Chiao Lin 1, Wen-Ying Chen 3, Chao-Hsiang Chen 2,4,* et Jason TC Tzen 1,*

1 Institut universitaire de biotechnologie, Université nationale Chung-Hsing, Taichung 402, Taïwan ; baby159357520@gmail.com (C.-JW); CMNHEI@mohw.gov.tw (N.-HL) ; s9755702@gmail.com (Y.-CL)

2 Ko Da Pharmaceutical Co. Ltd., Taoyuan 324, Taïwan ; rd1@koda.com.tw

3 Département de médecine vétérinaire, Université nationale Chung-Hsing, Taichung 402, Taïwan ; wychen@dragon.nchu.edu.tw

4 Institut universitaire de pharmacognosie, Université médicale de Taipei, Taipei 110, Taïwan

* Correspondance : gm@koda.com.tw (C.-HC) ; TCTZEN@dragon.nchu.edu.tw (JTCT) ; Tél. : plus 886-4-22840328 (poste 776) (JTCT) ; Télécopie : plus 886-4-22853527 (JTCT)

Éditeur académique : Pinarosa Avato

Reçu : 22 janvier 2019 ; Accepté : 14 février 2019 ; Publié: 17 février 2019

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ Whatsapp : 008618081934791

Résumé:Cistancheespèce, le ginseng du désert, possède de nombreuses activités biologiques dans la pharmacopée traditionnelle chinoise et a été utilisée comme médicament anti-âge. Trois glycosides phényléthanoïdes—échinacoside, tubuloside A et actéoside - ont été détectés dans l'extrait aqueux deCistanche tubuleux(Schenk) R. Wight et le principal constituant,échinacoside, a été purifié davantage.Échinacosided'une concentration supérieure à 10_6 M a montré une activité significative pour stimuler la sécrétion d'hormone de croissance des cellules hypophysaires de rat. Semblable à l'hormone de libération de l'hormone de croissance-6, un analogue synthétique de la ghréline, la stimulation de la sécrétion de l'hormone de croissance par l'échinacoside a été inhibée par [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substance P , un agoniste inverse du récepteur de la ghréline. La modélisation moléculaire a montré que les trois glycosides phényléthanoïdes interagissaient de manière adéquate avec la poche de liaison du récepteur de la ghréline, et l'échinacoside présentait une interaction légèrement meilleure avec le récepteur que le tubuloside A et l'actéoside. Les résultats suggèrent que les glycosides phényléthanoïdes, en particulier l'échinacoside, sont des constituants actifs potentiellement responsables des effets anti-vieillissement de C. tubulosa et peuvent être considérés comme se développant en tant qu'analogues non peptidyliques de la ghréline.

Mots clés: cistanchetubuleuse;échinacoside; ghréline; sécrétion d'hormone de croissance;phényléthanoïdeglycosides

échinacosidedanscistanchea de nombreux effets

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4. Matériels et méthodes

4.1. Produits chimiques et matières végétales

Cistanchedeserticola YC Ma a été obtenu sur un marché local et authentifié par le Dr Nan-Hei Lin.Cistanchetubulosa (Schenk) R. Wight a été acheté auprès de Sinopharm Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., (Hangzhou, Chine). L'acétonitrile de qualité HPLC, l'acide formique et le méthanol ont été achetés chez ECHO Chemical Co., Ltd, (Miaoli, Taiwan). Le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal dialysé (DFBS) et la trypsine-EDTA ont été achetés chez Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). La DNase I a été achetée chez Worthington Biochemical (Lakewood, NJ, USA). L'hormone de libération de l'hormone de croissance-6 (GHRP-6) a été obtenue auprès de Gen Way Biotech, Inc. (San Diego, Californie, États-Unis). La collagénase de type I et la [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substance P ont été achetées auprès de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA). Le kit ELISA d'hormone de croissance de rat a été acheté auprès de Sunred Biological Technology Corporation (Shanghai, Chine).

4.2. Analyses HPLC/UV et LC_MSn de l'extraction à l'eau de Cistanche spp.

Tige séchée (25 g) deCistanchedeserticola YC Ma ouCistanchetubulosa (Schenk) R a été extrait trois fois avec 500 mL d'eau distillée pendant 60 min à 50 degrés dans un bain-marie. La solution a été filtrée à travers un filtre syrien de 13 mm avec un filtre à membrane en PP de 0,45 um (Pall Corporation, Glen Cove, NY, USA) et soumise aux analyses suivantes. Les constituants chimiques des extraits ont été analysés

en utilisant une colonne Syncronis C18 (4,6 × 250 mm de diamètre intérieur, 5 um, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) dans le système HPLC couplée à un détecteur à matrice de photodiodes modèle 600E (Waters Corporation,

Milford, MA, États-Unis). La phase mobile consistait en (A) de l'eau contenant {{0}},1 % d'acide formique et (B) de l'acétonitrile. Le gradient d'élution était le suivant : 0–60 min, gradient linéaire à partir de 14 % de B ; 0–3 min, 14 % à 17 % B ; 3–4 min, 17 % B ; 4–15 min, 17 % à 20 % B ; 15 à 20 min, 20 % B ; 20 à 50 min, 20 % à 14 % B ; 50–60

min, 14 % B. La longueur d'onde de détection de l'absorbance ultraviolette (UV) a été fixée à 330 nm. Un spectromètre de masse tandem quadripolaire à piège linéaire (LTQ) (Thermo Electron, San Jose, CA, USA) équipé d'une interface d'ionisation par électrospray (ESI) a été connecté à un système Surveyor LC (Thermo Electron)

avec une boucle d'échantillon de 5 uL. Le gradient d'élution était le suivant : 0–90 min, gradient linéaire à partir de 14 % de B ; 0–24 min, 14 % à 17 % B ; 24–25 min, 17 % B ; 25–36 min, 17 % à 20 % B ; 36–37 min, 20 % B ; 37–80 minutes,

20% to 14% B; 80–90 min, 14% B. The heated capillary temperature was set at 300℃ with a spray voltage of 4.5 kV. Negative ESI mode was firstly scanned ranging from m/z 400–1000. Data-dependent MSN was obtained using the high purity helium (>99,99 %) comme gaz de collision.

4.3. Isolement de l'échinacoside

L'extrait aqueux de la tige séchée (25 g) de C. tubulosa a été concentré sous pression réduite pour donner un sirop brun foncé. L'extraction brute a été mise en suspension avec de l'eau distillée et lyophilisée par un lyophilisateur. La poudre de 100 mg a été résolue dans de l'eau distillée de 5 mL et soumise à une purification à l'aide d'une colonne Sephadex LH-20 (100 mL ; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Suède) éluée avec une solution aqueuse de méthanol à 10 % et contrôlée par HPLC . Les fractions contenant de l'échinacoside ont été détectées par lecture de l'absorbance à 245 nm et récoltées à l'aide d'un échantillonneur automatique.

4.4. Animaux

Les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université nationale Chung_Hsing avec le numéro d'approbation de l'IACUC 106-079. Des rats mâles Sprague_Dawley pesant 250_300 g ont été achetés chez BioLASCO, Taiwan Co., Ltd. (Taipei, Taiwan). Deux animaux par cage ont été maintenus dans un environnement contrôlé de 23 o2, 60 o 10 % d'humidité et un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les rats ont été nourris avec un régime alimentaire standard (calories fournies

par 28,7 % de protéines, 13,4 % de matières grasses et 57,9 % de glucides, 5001 Rodent LabDiet, St. Louis, MO, USA) et de l'eau distillée à volonté.

4.5. Culture de cellules hypophysaires primaires

Les cellules hypophysaires ont été isolées selon une méthode de dispersion enzymatique modifiée développée par Yamazaki et al. [29]. Brièvement, des rats mâles Sprague Dawley ont été anesthésiés avec du Zoletil 50 (40 mg/kg, IP ; Laboratoires Virbac, Carros, France), et les hypophyses antérieures ont été prélevées et dispersées pour mettre en culture des cellules hypophysaires en suspension, comme décrit précédemment [30].

4.6. Test de sécrétion d'hormone de croissance

Les cellules hypophysaires antérieures primaires de 4 × 104 cellules/puits ont été cultivées à 37 degrés sous 5 % de CO2 pendant 2 jours avant le test de sécrétion d'hormone de croissance selon le protocole décrit précédemment [30].

Après le retrait du milieu de culture, les cellules ont été privées de sérum dans du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) sans sérum pendant 90 min pour stabiliser la sécrétion hormonale basale. Le milieu de famine a été remplacé par du DMEM frais contenant de l'échinacoside (de 10_8 à 10_5 M) ou du GHRP-6 (un agoniste d'un récepteur de la ghréline humaine, GHSR, 10_7 M) comme témoin positif, et les cellules ont été incubées pendant 15 et 30 min à 37 degrés sous 5 % de CO2. Pour la détection de l'effet antagoniste, les cellules ont été incubées avec un GHSR

agoniste inverse, [D-Arg1, D-Phe5, D-Trp7,9, Leu11]-substance P (0.5 uM), puis traité avec du DMEM contenant de l'échinacoside (10_5 M) ou GHRP-6 (10_7 M) pendant 30 min. Le milieu a été recueilli pendant

détermination de la sécrétion d'hormone de croissance par un kit ELISA d'hormone de croissance de rat (Shanghai Sunred Biological Technology Corporation).

4.7. Analyses statistiques

Les données ont été présentées sous forme de valeurs moyennes o SD. Les différences ont été analysées par T-Test. Les calculs statistiques ont été effectués par GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA). Un niveau de p < 0.05="" a="" été="" considéré="" comme="" statistiquement="">

4.8. Modélisation d'homologie et amarrage

La modélisation d'homologie et l'amarrage à un récepteur de la ghréline humaine, le récepteur sécrétagogue de l'hormone de croissance (GHSR, numéro d'accès AAI13548), ont été établis en suivant notre construction précédente [21,24]. En bref, les structures cristallines des récepteurs adrénergiques 1 et 2 (PDB 2YCY et 3PDS) avec des ligands liés, du cyanopindolol et du FAUC50 ont été utilisées comme modèles pour construire la structure GHSR [31,32]. La structure GHSR avec l'énergie totale PDF la plus faible a été sélectionnée pour un amarrage supplémentaire avec le GHRP -6, l'échinacoside, le tubuloside A et l'actéoside. Tous les processus de modélisation ont été réalisés à l'aide de la plate-forme Discovery Studio 2.1 (http://accelrys.com/).

La structure 3D du GHRP -6 a été téléchargée à partir de la base de données des composés Pub-Chem sur le site Web du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Les structures 3D de l'échinacoside, du tubuloside A et de l'actéoside ont été construites à l'aide du programme Chem3D (http://www.cambridgesoft.com/). Le site de liaison au ligand du GHSR a été défini comme l'espace sphérique avec un rayon de 14 Å à partir du centre de la poche de liaison dans la simulation d'amarrage. L'amarrage du GHRP -6, de l'échinacoside, du tubuloside A ou de l'actéoside au site de liaison du GHSR a été effectué in silico en utilisant le module LibDock dans le package Discover Studio 2.1 et encore minimisé par l'algorithme de minimisation intelligent avec le champ de force CHARMm dans le Découvrez le pack Studio 2.1 [33]. Pour comparer les affinités de liaison relatives de l'échinacoside, du tubuloside A et de l'actéoside dans le GHSR, la zone centrale active construite avec le GHRP -6 dans le GHSR a été utilisée pour l'amarrage, et l'énergie de liaison a été calculée par GEMDOCK (The Institute of Bioinformatics , Université nationale Chiao Tung, Taïwan).

Contributions des auteurs : expérimentations animales, C.-JW, Y.-CL et W.-YC ; Identification et purification : MY.C., N.-HL et C.-HC ; Modélisation moléculaire : C.-JW, Y.-CL et JTCT ; Conception et rédaction du projet : C.-HC et JTCT

Financement : Le travail a été en partie soutenu par une subvention à Jason TC Tzen de l'Université nationale Chung-Hsing (NCHU-102D604).

Remerciements : Les auteurs remercient Tian-Shun Weng d'avoir partagé son expérience professionnelle dans l'utilisation des espèces de Cistanche.

Conflits d'intérêts : Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

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