Partie 3: L'efflux de magnésium des cellules de Drosophila Kenyon est essentiel pour la mémoire à long terme normale et améliorée par l'alimentation

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était limité aux mouches adultes, ce qui suggère que l'UEX a un rôle plus soutenu dans la physiologie neuronale. En revanche, la suppression de l'expression uex dans les neurones abs ou a{{0}}b0 n'a pas altéré le LTM. L'activité des neurones a0 b0 est nécessaire après l'entraînement pour consolider le LTM appétitif (Krashes et Waddell, 2008), alors que la sortie abc et abs KC, ensemble et séparément, est nécessaires à son expression (Krashes et Waddell, 2008 ; Perisse et al., 2013). Par conséquent, l'observation de performances LTM normales chez les mouches avec perte de fonction uex dans les neurones abs et a0b0 plaide contre une déficience générale de la fonction neuronale ab lors de la manipulation de uex.

Le Mg2 plus alimentaire n'a pas pu améliorer la performance LTM défectueuse des mouches qui étaient constitutivement uex mutantes ou hébergeaient une perte de fonction uex restreinte par KC. Cependant, l'expression de uex dans les ab KC des mouches mutantes uex a restauré la capacité de Mg2 plus à améliorer les performances. Par conséquent, les ab KC sont le locus cellulaire pour Mg2 plus -enhancedMémoireà la volée.

Il semble peut-être contre-intuitif que l'efflux de magnésium dirigé par l'UEX soit nécessaire dans les KC pour soutenir leMémoire-effets d'amélioration du Mg2 plus l'alimentation, lorsque le Mg2 plus alimentaire augmente le KC [Mg2 plus ]i . À ce stade, nous ne pouvons que spéculer sur les raisons pour lesquelles il en est ainsi. Nous supposons que le cerveau et les KC ab, en particulier, doivent s'adapter de manière équilibrée aux niveaux plus élevés de Mg2 plus intracellulaire et extracellulaire résultant de la supplémentation alimentaire. Notre imagerie en direct de KC [Mg2 plus] i dans les cerveaux de type sauvage et mutant uex suggère que l'efflux dirigé par UEX est susceptible d'être un facteur essentiel dans le maintien homéostatique actif, et peut-être évoqué par un stimulus, de ces niveaux élevés.

Un certain nombre de types de cellules de mammifères extrudent Mg2 plus de manière dépendante de l'AMPc, quelques minutes après avoir été exposés à une stimulation b-adrénergique (Romani et Scarpa, 2000 ; Vormann et Günther, 1987 ; Jakob et al., 1989 ; Romani et Scarpa, 1990b ; Romani et Scarpa, 1990a ; Vormann et Gu¨nther, 1987 ; Gu¨nther et al., 1990 ; Howarth et al., 1994). La présence d'un domaine CNBH suggère que l'UEX et les CNNM pourraient être directement régulés par l'AMPc. Nous avons testé l'importance du CNBH en introduisant une substitution d'acide aminé R622K qui devrait bloquer la liaison de l'AMPc dans l'UEX CNBH. Cette mutation subtile a aboli la capacité du transgène uexR622K à restaurer les performances LTM des mouches mutantes uex. Nous avons également utilisé CRISPR pour muter le CNBH dans le locus uex natif. Bien que la suppression du CNBH de CNNM4 ait aboli Mg2 plus l'activité d'efflux (Chen et al., 2018), les mouches homozygotes pour la lésion uexT626NRR étaient viables, démontrant qu'elles conservent un niveau suffisant de fonction UEX. Cependant, ces mouches présentaient une altération immédiate et à long termeMémoire. De plus, les performances des mouches uexT626NRR n'ont pas pu être améliorées par l'alimentation Mg2 plus. Ces données démontrent qu'un CNBH intact est un élément essentiel deMémoire-fonction UEX pertinente. La liaison des protéines adaptatrices de la clathrine au CNNM4 CNBH a été impliquée dans le ciblage basolatéral (Hirata et al., 2014), ce qui suggère que l'UEXT626NRR pourrait être localisé de manière inappropriée dans les KC. En outre, l'expression KC du variant mutant CNNM2 E122K, qui conserve la fonction résiduelle

mais a un défaut de trafic (Arjona et al., 2014), n'a pas restauré le défaut uex LTM.

Bien que l'on se soit demandé si les domaines CNNM2/3 CNBH se lient aux nucléotides cycliques (Chen et al., 2018), nous avons constaté que la FSK évoquait une augmentation de ab KC [Mg2 plus ]i sensible à la mutation uex, et que UEX : :HA a été mal localisé dans l'adénylate cyclase rut2080 (Han et al., 1992) et la phosphodiestérase dnc1 (Dudai et al., 1976) apprenant des mouches mutantes défectueuses. Alors que l'étiquette UEX::HA était uniformément répartie dans les KC g, abc et abs chez les mouches de type sauvage, l'étiquette UEX::HA était diminuée dans les KC g et abs et était plus forte dans les neurones abc chez les mutants rut2080 et dnc1. Les manipulations chroniques de l'AMPc chez les mutants sont donc cohérentes avec l'impact de l'AMPc sur la localisation de l'UEX, peut-être en interagissant avec le CNBH. De plus, une localisation UEX altérée peut contribuer à laMémoiredéfauts des mouches rut2080 et dnc1.

Nos données physiologiques utilisant Magnesium Green dans une culture de cellules de mammifères et le rapporteur MagIC génétiquement codé dans les KC ab démontrent que l'UEX de la mouche facilite l'efflux de Mg2 plus. La stimulation du cerveau de la mouche avec FSK a évoqué une plus grande augmentation de ab KC [Mg2 plus ]i dans les cerveaux mutants uex que dans les témoins de type sauvage, ce qui fournit la première preuve que UEX limite une augmentation de [Mg2 plus ]i chez Drosophila KCs. Nos enregistrements MagIC ont également révélé une oscillation lente (centrée autour de 0.015 Hz, environ une fois par minute) de ab KC [Mg2 plus ]i qui dépendait de UEX. Nous ne comprenons pas encore la fonction physiologique de cette fluctuation [Mg2 plus ]i bien qu'elle reflète probablement une propriété homéostatique au niveau des systèmes des cellules. L'activité oscillatoire biochimique joue un rôle crucial dans de nombreux aspects de la physiologie cellulaire (Nova'k et Tyson, 2008). Plus particulièrement, la fluctuation temporelle circadienne de [Mg2 plus ]i relie le métabolisme énergétique cellulaire dynamique à la traduction contrôlée par l'horloge via la voie mTOR sensible Mg2 plus (cible mécaniste de la rapamycine) (Feeney et al., 2016). Il est donc possible que des oscillations lentes de Mg2 plus puissent unir les rôles de l'AMPc, de l'UEX, du flux d'énergie (Plac¸ais et al., 2017) et de la traduction dépendante de mTOR sous-jacente à la plasticité synaptique pertinente pour le LTM (Casadio et al., 1999 ; Huber et al., 2000 ; Beaumont et al., 2001 ; Hou et Klann, 2004 ; Hoeffer et al., 2008).

Contact pour le partage de réactifs et de ressources

Une liste complète des réactifs peut être consultée dans le tableau des ressources clés.

Les informations complémentaires et les demandes de ressources et de réactifs doivent être adressées au contact principal, Scott Waddell (scott.waddell@cncb.ox.ac.uk) et seront traitées par celui-ci.

Modèle expérimental et détails du sujet

Souches de mouches

Sauf indication contraire, les mouches ont été élevées sur de la farine de maïs standard sous un cycle lumière-obscurité de 12 heures à 60 % d'humidité et à 25 °C. Les mouches de test et de contrôle pour les expériences GAL80ts ont été élevées à 18°C. Des mouches sexuelles mixtes âgées de 1 à 7- jours ont été utilisées dans des expériences.

Canton-S était la souche de type sauvage. Les lignées de pilotes GAL4 utilisées dans cette étude sont c739-GAL4 (McGuire et al., 2001), c305a-GAL4 (Krashes et al., 2007), NP7175-GAL4 (Tanaka et al., 2004), 0770-GAL4 (Gohl et al., 2011), MB247-GAL4 (Zars et al., 2000), nSyb-GAL4 (Bloomington Drosophila Stock Centre, BDSC 51635), elav-GAL4 (BDSC, 8765) et uex-GAL4 (Kvon et al., 2014) ; Centre de ressources sur la drosophile de Vienne, VDRC, VT23256-GAL4). Les lignées UAS obtenues du centre de stockage sont UAS-CD8 :: GFP (BDSC, 5136), UAS-NmdarRNAi (BDSC, 25941) et UAS-uexRNAi (BDSC, 36116). Les différentes lignées mutantes et transgéniques sont décrites, uexMI01943 (Venken et al., 2011 ; BDSC, 32805), uexNC1 (BDSC, 7167), rut2080 (Han et al., 1992), et dnc1 (Dudai et al., 1976) , tubP-GAL80ts (McGuire et al., 2003) et PhsILMiT (BDSC, 24613). Les lignées d'excision Minos uexMI01943.ex1 et uexMI01943.ex2 ont été générées en utilisant la procédure décrite dans Arc et al., 1997. Le schéma d'accouplement détaillé est illustré à la figure 2 - supplément de figure 2A. Des lignes d'excision potentielles ont été établies à partir de mouches individuelles présentant le phénotype de couleur jaune du corps. L'ADN génomique a été extrait de six de ces lignées et l'ADN flanquant le MiMIC uexMI01943 a été amplifié par PCR et séquencé. Les lignées uexMI01943.ex1 et uexMI01943.ex2 ont été identifiées pour abriter des excisions précises, ayant restauré la séquence génomique de type sauvage. Voir le tableau des ressources pour la PCR et les séquences d'amorces de séquençage. Le schéma du détail de la séquence de l'insertion uexMI01943 MiMIC et dans les excisions est illustré à la figure 2 - supplément de figure 2B. Pour construire des mouches transgéniques UAS-uex, une séquence codante uex pleine longueur (CDS) a été clonée par RT-PCR. L'ARN total a été isolé à partir de mouches de type sauvage à l'aide de TRIZOL (Thermo Fisher, 15596018) et transcrit en ADNc à l'aide du système de synthèse du premier brin SuperScript III (Invitrogen, 18080400). Ce mélange d'ADNc total a été utilisé comme matrice pour amplifier le CDS uex. Voir le tableau des ressources pour les séquences d'amorces. Le produit de PCR a été digéré avec SacII et Xhol puis ligaturé dans les sites complémentaires de pUAST (Brand et Perrimon, 1993). Le CDS uex cloné pUAST a été entièrement séquencé et vérifié pour représenter les 2505 pb du cadre de lecture de l'ADNc uex de type sauvage (notez que les quatre isoformes d'ARNm uex possibles, FlyBase Release 6, codent pour la même protéine de 834 acides aminés). Des mouches transgéniques UAS-uex ont été générées commercialement (Bestgene) par transformation avec le vecteur pUAST-uex. Nous avons cartographié l'insertion chromosomique UAS-uex de 10 lignées transgéniques indépendantes et testé comportementalement trois lignées, notées UAS-uex3M, UAS-uex5M et UAS-uex8M, avec un insert sur le troisième chromosome. Les mouches UAS-uex3M étaient celles utilisées tout au long de l'étude et appelées UAS-uex dans le manuscrit.

Les mouches transgéniques UAS-uexR622K ont été générées de manière similaire aux mouches UAS-uex. Une mutation faux-sens a été introduite au codon 622 de UEX dans le domaine CNBH, imitant celle précédemment conçue dans le domaine de liaison à l'AMPc de la sous-unité régulatrice de la protéine kinase A (Bubis et al., 1988). La mutation change le codon CGT codant pour Arg en AAA codant pour Lys. La mutation a été introduite dans le CDS uex de type sauvage à l'aide de Gibson Assembly Master Mix (New England Biolabs, E2621S) comme décrit dans « Méthodes améliorées pour la mutagenèse dirigée sur site à l'aide de Gibson Assembly Master Mix » (NEB Application Note). Les ensembles d'amorces utilisés sont détaillés dans le tableau des ressources. Le produit de l'assemblage de Gibson a été encore amplifié par PCR et le produit résultant a été cloné dans le vecteur pUAST et séquencé. Les insertions de transgène ont été cartographiées comme pour UAS-uex et l'une des deux insertions cartographiées sur le troisième chromosome a été utilisée dans des expériences de comportement.

Les lignées de mouches transgéniques UAS-CNNM2, UAS-CNNM2E122K, UAS-CNNM2E357K, UAS-CNNM2S269W et UAS-CNNM2T568I ont été générées par transformation avec des constructions pUAST contenant des versions de type sauvage ou à mutation ponctuelle d'un ADNc CNNM2 de souris marqué avec HA (mCNNM2 :: HA), décrit dans Arjona et al., 2014. Des versions de type sauvage ou mutées de CNNM2 ont été amplifiées à partir de clones mCNNM2 ::HA originaux dans des plasmides pCiNEO_IRES_GFP (Arjona et al., 2014). Les amorces sont détaillées dans le tableau des ressources. Les produits de PCR ont été digérés avec Xhol et Xbal et ligaturés dans les sites complémentaires de pUAST. Les insertions de chaque construction sur le troisième chromosome ont été identifiées par cartographie comme décrit ci-dessus et ont été utilisées dans les expériences de comportement. Notez que toutes les constructions de codage CNNM2 utilisées dans l'étude sont étiquetées HA, bien que la notation soit souvent omise par souci de brièveté.

Des lignées de mouches transgéniques UAS-MagFRET-1 ont été générées par transformation avec des constructions pJFRC-MUH contenant MagFRET-1 CDS, qui a été sous-cloné à partir du plasmide pCMVMagFRET-1, décrit dans Lindenburg et al. , 2013. Les amorces sont détaillées dans le tableau des ressources. Les produits de PCR ont été digérés avec Xhol et Xbal et ligaturés dans les sites complémentaires dans pJFRC-MUH. L'insertion de la construction a été médiée par le système de transgenèse spécifique au site et le site d'atterrissage est attP2 (sur le troisième chromosome).

Les lignées de mouches transgéniques UAS-MagIC et UAS-MARIO ont été générées par transformation avec des constructions pTW contenant les CDS MagIC/MARIO, qui ont été sous-clonés à partir des plasmides MagIC/pcDNA3 et MARIO/pcDNA3, gracieusement fournis par T. Nagai : (Maeshima et al., 2018 et Koldenkova et al., 2015). MagIC/MARIO CDS ont d'abord été amplifiés par PCR à partir de MARIO/pcDNA3 et MagIC/pcDNA3 respectivement et ont été clonés dans le vecteur pENTR/D-TOPO. Les amorces sont détaillées dans le tableau des ressources. Notez que l'amorce sens MARIO a été conçue pour chevaucher la séquence de pcDNA3 au site d'insertion de MARIO. MagIC/MARIO CDS ont ensuite été clonés dans le vecteur de destination Gateway pTW (Drosophila Gateway Vector Collection).

Le locus uexD édité par CRISPR/Cas9 a été généré commercialement par GenetiVision. Le schéma d'édition est illustré à la figure 2 - supplément de figure 2C. Le locus uex se trouve en orientation inverse sur le chromosome 2R, couvrant une région de 49 141 pb entre les positions 3 900 285 et 3 949 425 (FlyBase, version 6). La description suivante concerne ces coordonnées au sein du lieu uex. Pour générer uexD, deux plasmides gRNA et un plasmide donneur d'ADN double brin (dsDNA) ont été construits et injectés dans des embryons nos-Cas9 (BDSC, 54591). Comme indiqué dans la figure 2 - supplément de figure 2C et détaillé dans le tableau des ressources, le gRNA1 en amont se situe dans l'exon 6 et cible la séquence 30,930.30,952. Le gRNA2 en aval correspondant se situe entre l'exon 7 et l'exon 8 entre 33 988 et 34 010. Les deux ARNg ont été clonés individuellement dans pCFD3-dU63gRNA (Addgene, 49410). Le site de coupure de gRNA1 devrait être compris entre 30 946 et 30 947 tandis que gRNA2 devrait conduire à une coupure entre 33 993 et ​​33 994. Un bras d'homologie en amont de 795 pb (30 152.30 946) et un bras d'homologie en aval de 977 pb (33 994.34 970) ont été clonés dans le plasmide d'ADN donneur. Un codon de terminaison (STOP, dans les trois cadres de lecture) a été inséré entre les deux bras d'homologie et suivi d'une cassette GFP pilotée par un promoteur 3xP3. Le squelette d'ADN du donneur a été conçu par GenetiVision et la séquence complète du donneur pour la lignée uexD est disponible sur demande. Une édition réussie a été identifiée par l'expression de la GFP dans les yeux des mouches et confirmée par PCR génomique et séquençage. Chez les mouches uexD, un fragment de 3047 pb de 30 947 à 33 993 a été remplacé par la séquence entre les deux bras d'homologie dans le plasmide donneur, principalement le signal STOP et la cassette GFP. L'allèle uexD tronque l'ORF uex. Les amorces utilisées pour la vérification PCR génomique sont détaillées dans le tableau des ressources. Le transgène nos-Cas9 (sur le chromosome X) a été éliminé par croisement.

Les mouches uex::HA éditées par CRISPR/Cas9-ont été générées par WellGenetics à l'aide du système ScarlessDsRed développé par le laboratoire de Kate O'Connor-Giles (plasmide original non publié donné à Addgene, #80822). Une étiquette 6XHA a été fusionnée dans le cadre à l'extrémité carboxy de UEX en insérant la séquence codant pour 6XHA immédiatement avant le codon STOP natif dans le locus uex (Figure 3 - supplément de figure 1A). Le processus comportait deux étapes principales. À l'étape 1, une étiquette 6XHA et un transposon pBAC contenant une cassette DsRed ont été insérés dans le cadre avec le codon STOP de uex à l'aide de l'édition du génome médiée par CRISPR/Cas9-par réparation dirigée par homologie (HDR) à l'aide de 1 ARNg et un donneur de plasmide d'ADNdb. L'ARNg se trouve à 50 pb du codon uex STOP et devrait diriger une coupe entre 48 587 et 48 588. L'ARNg a été cloné dans un plasmide pCFD3-dU63gRNA. Un bras en amont de 1 200 pb (47 438.48 637) et un bras en aval de 1 033 pb (48 641.49 673) ont été clonés dans le plasmide d'ADN donneur avec le squelette pUC57-Kan (2579 pb). Voir le tableau des ressources pour les séquences d'ARNg et d'amorces. Une mutation Protospacer Adjacent Motif (PAM) (TCC à TCG, 48 581.48 583) a été introduite chez le donneur pour promouvoir le HDR. Une étiquette 6XHA, suivie d'un transposon pBAC contenant une cassette DsRed pilotée par le promoteur 3XP3, a été insérée entre les deux bras d'homologie. Un motif de reconnaissance pBAC TTAA est intégré dans le codon STOP de 6XHA. La séquence complète du donneur est disponible sur demande. Des plasmides donneurs et gRNA ont été injectés dans des embryons nos-Cas9 (NIG-FLY, CAS0002). L'édition réussie a été identifiée par l'expression de DsRed dans les yeux des mouches et confirmée par PCR génomique et séquençage. Six lignées positives indépendantes ont été identifiées et quatre ont passé la validation PCR. Parmi ces quatre lignées, une a en outre réussi la validation du séquençage et est la lignée intermédiaire représentée sur la figure 3 - supplément de figure 1A. Quatre stocks isogénisés et équilibrés ont été constitués à partir de cette lignée. À l'étape 2, le marqueur de sélection DsRed a été excisé par transposition PiggyBac (PBac) avec la lignée auxiliaire Tub-PBac (BDSC, 8285). Cinq lignées viables homozygotes avec excision réussie ont été validées par PCR génomique et séquençage. Un uex :: HA désigné a été utilisé dans les expériences du manuscrit.

Pour construire les mouches uexT626NRR éditées par CRISPR/Cas{{0}}, nous avons conçu et cloné un ARNg et conçu et commandé (Sigma) un oligo-désoxynucléotide simple brin (ssODN). Les séquences gRNA et ssODN sont détaillées dans le tableau des ressources. Comme nous avions prévu de faire une seule substitution d'acide aminé R622K dans le domaine UEX CNBH, le donneur ssODN de 120 pb était centré sur le codon R622 et porte le changement de codon CGT en AAA (à 31 179.31 181) correspondant à R622K. Le site de coupure attendu de l'ARNg (entre 31 192 et 31 193) n'est qu'à 11 pb du point de mutation attendu. Pour augmenter la probabilité de HDR, qui serait faible en utilisant ssODN comme donneur, nous avons commercialement (GenetiVision) injecté du matériel d'édition dans 250 embryons lig4 KO vasa-Cas (Zimmer et al., 2016). Nous avons obtenu 37 mouches G0 viables à partir des embryons injectés. Un total de 224 mouches G1 ont été soumises à une PCR génomique de mouche unique et à un séquençage pour dépister la mutation attendue. Amorces détaillées dans le tableau des ressources. Nous avons identifié 59 lignées éditées putatives à partir du premier tour de sélection, et parmi celles-ci, 12 ont été confirmées. Malgré l'utilisation de lig4 KO vasa-Cas9, nous n'avons détecté que des événements de jonction d'extrémité non homologues (NHEJ) au lieu de mutations ponctuelles médiées par HDR. Sur les 12 lignées éditées, six étaient létales homozygotes et les six autres étaient viables. Dans quatre des lignées viables homozygotes, nous avons trouvé un remplacement de G par T en position 31 192 avec une insertion dans le cadre de 6 pb d'ATCTTC entre 31 192 et 31 193. Ce montage NHEJ correspond au T626 ! Changement NRR dans la séquence protéique de UEX (Figure 5A). Le chromosome X vasa-Cas9 a été retiré de ces lignées par croisement et une lignée appelée uexT626NRR a été utilisée dans les expériences de comportement du manuscrit.

Détails de la méthode

Expériences comportementales

Pour les expériences de labyrinthe en T comportemental, des mouches sexuelles mixtes âgées de 1 à 7- jour ont été utilisées. Les odeurs étaient le 4-méthylcyclohexanol (MCH) et le 3-octanol (OCT), dilués ~1:103 (plus précisément, 9 ml de MCH ou 7 ml d'OCT dans 8 ml d'huile minérale). Toutes les expériences ont été réalisées à 23 °C et 55 à 65 % d'humidité relative.

Appétit immédiat et plus tardMémoireles expériences ont été réalisées essentiellement comme décrit (Krashes et Waddell, 2008 ; Perisse et al., 2013). Des lots de 100 à 120 mouches ont été affamés pendant 21 à 23 heures avant l'entraînement dans des flacons de famine de 35 ml contenant environ 2 ml d'agar à 1 % (comme source d'eau) et un papier filtre de 2 cm 4 cm. Des papiers de sucre (5 cm 7,5 cm) pour la formation ont été préparés par trempage avec 4 ml de saccharose 2 M et séchage pendant une nuit. Des papiers d'eau de même taille ont été imbibés d'eau et laissés pendant la nuit. Pour l'entraînement appétitif, les mouches ont été transférées d'un tube de famine à un tube d'entraînement avec un papier sec "d'eau", et immédiatement attachées au bras d'entraînement du labyrinthe en T et exposées à l'odeur de CS pendant 2 min, suivies de 30 s de l'air pur. Les mouches ont ensuite été transférées dans un autre tube d'entraînement avec du papier de sucre sec, attachées au labyrinthe en T et exposées à l'odeur CS plus pendant 2 min. ImmédiatMémoirea été testé en transportant des mouches au point de choix T et en leur laissant 2 min pour choisir entre les deux flux d'odeurs. A doser 24hMémoire, les mouches ont été retirées du tube de formation et transférées dans des flacons de semoule de maïs standard pendant 1 heure, puis transférées dans des flacons de famine pendant 23 heures jusqu'au test. L'indice de performance a été calculé comme le nombre de mouches dans le bras CS plus moins le nombre dans le bras CS, divisé par le nombre total de mouches. MCH et OCT ont été alternativement utilisés comme CS plus ou CS et un seul échantillon, ou n, représente l'indice de performance moyen de deux groupes formés réciproquement.

Pour les tests de comportement après Mg2 plus alimentation, des mouches âgées de 1 à 2- jour ont été logées dans des flacons contenant du Mg2 plus de la nourriture supplémentée pendant 1 à 5 jours avant d'être affamées pour un entraînement et des tests appétissants, comme décrit ci-dessus. Pour faire 80 mM [Mg2 plus ] nourriture, 40 ml de solution de MgCl2 1 M ont été ajoutés à 460 ml de nourriture liquide normale pour mouches ; Un aliment [Mg2 plus] 1 mM a été préparé en diluant 0,5 ml de MgCl2 1 M dans 39,5 ml d'eau MilliQ et en l'ajoutant à 460 ml d'aliment liquide. La nourriture a été aliquotée et refroidie pour se solidifier. Les aliments supplémentés en MgSO4 et CaCl2 ont été préparés de la même manière.

Aversif immédiat et 24hMémoireles expériences ont été menées comme décrit précédemment (Hirano et al., 2013 ; Perisse et al., 2016 ; Tully et Quinn, 1985). Des groupes de 100 à 120 mouches ont été entraînés soit avec un cycle d'entraînement aversif, soit avec cinq cycles espacés de 15 minutes d'intervalle entre les essais (entraînement espacé). Pour aversif immédiatMémoire, les mouches ont été testées après un cycle d'entraînement. Aversif 24 hMémoirea été testé selon deux protocoles différents. Dans le protocole facilité par le jeûne, les mouches ont été affamées pendant 16 heures avant la formation d'un cycle (Hirano et al., 2013). Pour l'entraînement espacé, les mouches n'étaient pas affamées avant l'entraînement. Les mouches ont été nourries avec de la nourriture pour mouches normale pendant 24 heures après un entraînement facilité par le jeûne et espacé, avant d'être testées pourMémoireperformance. Au cours de chaque cycle d'entraînement aversif, les mouches ont été exposées pendant 1 min à une première odeur (CS plus ) couplée à douze décharges électriques de 90 V à intervalles de 5 s. Après 45 s d'air pur, une deuxième odeur (CS ) a été présentée pendant 1 min sans choc. L'indice de performance a été calculé comme le nombre de mouches dans le bras CS moins le nombre dans le CS plus

bras, divisé par le nombre total de mouches. MCH et OCT ont été alternativement utilisés comme CS plus ou CS et un seul échantillon, ou n, représente l'indice de performance moyen de deux groupes formés réciproquement.

Les tests d'acuité sensorielle (Figure 2 - données source 1) ont été effectués comme décrit (Keene et al., 2004 ; Keene et al., 2006 ; Schwaerzel et al., 2003) avec des modifications. Pour tester l'acuité olfactive, les mouches non entraînées ont eu 2 minutes pour choisir entre une odeur diluée telle qu'utilisée dans le conditionnement et de l'air barboté à travers de l'huile minérale dans le labyrinthe en T. Un indice d'évitement a été calculé comme le nombre de mouches dans le bras air moins le nombre dans le bras odeur, divisé par le nombre total de mouches. L'évitement des chocs électriques a été effectué et calculé de manière similaire. Les mouches non entraînées ont choisi pendant 1 min entre deux tubes contenant des réseaux électriques, mais un seul était connecté à la source d'alimentation. Un indice d'évitement a été calculé comme le nombre de mouches dans le bras non électrifié moins le nombre dans le bras électrifié, divisé par le nombre total de mouches. Pour évaluer l'acuité du sucre, les mouches affamées ont eu 2 minutes pour choisir entre un bras du labyrinthe en T contenant un papier de sucre séché et l'autre contenant un papier filtre "à eau" séché. Les deux documents ont été préparés comme dans l'appetitifMémoiredosages. Un indice de préférence a été calculé comme le nombre de mouches dans le bras sucre moins celui dans l'autre bras, divisé par le nombre total de mouches. Nous avons constaté que le fait de garder la lumière allumée dans la salle de comportement et d'avoir un flux d'air traversant les tubes de test améliorait considérablement l'indice de préférence chez les mouches de type sauvage et a donc appliqué ces conditions pour tous les tests de préférence de sucre.

Anticorps anti-UEX et western blot

Un anticorps polyclonal UEX a été développé commercialement par Eurogentec. Deux peptides ont été synthétisés comme antigènes : le peptide 1 H-CLPKLDDKFESKQSKP-OH (16aa) et le peptide 2 H-CVDNRTK TRRNRYKKA-NH2 (16aa) et injectés à des lapins. Seul le peptide 2 a induit une réponse immunitaire robuste et a été traité davantage. Le sérum final a été purifié contre le Peptide 2 et utilisé pour l'analyse Western blot sous la forme d'une dilution 1:2000.

Pour chaque échantillon en western blot, les protéines ont été extraites de 20 têtes de mouches en homogénéisant soigneusement dans 120 ml de tampon d'échantillon de protéines contenant un mélange de 30 ml de 2-mercaptoéthanol (Bio-Rad), 270 ml 4 Tampon d'échantillon Laemmli (BioRad) et 900 ml d'eau sans nucléase (Invitrogen). Les échantillons ont ensuite été bouillis sur un bloc chauffant à 100°C pendant 3 min et centrifugés pendant 10 min avant le chargement. Un volume d'échantillon équivalent à quatre têtes a été chargé dans chaque ligne de gel SDS-PAGE. Les protéines ont été transférées sur une membrane de PVDF et bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 1 h à 25 °C avec une agitation de 35 tr/min. La membrane a ensuite été incubée dans une solution anti-UEX (anti-UEX de lapin 1:2000 dans du lait écrémé à 5 %) pendant une nuit à 4 °C avec une agitation de 35 tr/min. La membrane a été lavée rapidement trois fois, suivie de 3 10 lavages min dans une solution TBST (100 ml de solution TBS 10, BioRad, diluée dans 900 ml d'eau MilliQ, avec 0,1 % de Tween 20), puis incubée avec du HRP conjugué. solution d'anticorps secondaire (1:5000 d'anti-lapin de chèvre dans du lait écrémé à 5 %) pendant 1 à 2 heures à 25 °C avec une agitation de 35 tr/min. La membrane a de nouveau été lavée rapidement trois fois, suivie de 3 10 lavages min dans du TBST. Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide du substrat de transfert Western Pierce ECL (Life technologies, 32134). La membrane a ensuite été décapée à l'aide d'une solution Millipore ReBlot Plus Mild (Merck, 2502), bloquée à nouveau dans du lait écrémé à 5 % et sondée avec l'anticorps primaire anti-tubuline de souris (1:2000, Sigma, T6199) et l'anticorps de chèvre conjugué HRP correspondant. anticorps secondaire de souris (1:5000) suivant le protocole détaillé ci-dessus.

Immunomarquage

L'immunomarquage a été effectué comme décrit (Wu et Luo, 2006). Les cerveaux de 1- à 5-mouches adultes âgées d'un jour ont été disséqués dans du PBS et fixés pendant 20 min dans du PBS avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante. Ils ont ensuite été brièvement lavés deux fois dans du 0,5 % de PBT (2,5 ml de Triton-X100 dans 497,5 ml de PBS) et trois lavages de 20 minutes. Les cerveaux ont ensuite été bloqués pendant 30 min à température ambiante dans du PBT contenant 5 % de sérum de chèvre normal, puis incubés avec des anticorps primaires et secondaires avec une rotation douce (35 tr/min) à 4 °C pendant 1 ou 2 jours. Les anticorps primaires étaient anti-GFP de lapin (1:250; Invitrogen A11122) et anti-HA de lapin (1:250, NEB 3724T). L'anti-lapin de chèvre conjugué à l'Alexa 488 (1:250 ; Invitrogen, A11034) était l'anticorps secondaire. Avant et après l'incubation secondaire des anticorps, les cerveaux ont été soumis à deux lavages rapides suivis de trois lavages de 20 minutes dans du PBT à 0,5 %. Les cerveaux colorés ont été montés sur des lames de verre dans Vectashield (Vector Labs H1000) et imagés à l'aide d'un microscope confocal Leica TCS SP5 à un grossissement de 40 (HCX PL APO 40, objectif à immersion dans l'huile 1,3 CS, Leica). Les piles d'images ont été collectées à une résolution de 1024 1024 avec des pas de 1 mm et traitées à l'aide de Fidji (Schindelin et al., 2012). Pour la quantification dans les figures 3G et H, des ROI rectangulaires d'environ 40 25 mm pour le globe, ou des ROI rondes d'un diamètre de 15 mm pour ab, a'b' et EB ont été dessinées manuellement sur une seule section d'un scan z-stack du cerveau de la mouche. Les retours sur investissement correspondants ont également été dessinés sur le protocerebrum médian supérieur (SMP) en tant que région de contrôle de fond, et la fluorescence moyenne a été calculée à l'aide d'ImageJ. L'intensité du retour sur investissement des lobes MB et de l'EB a été normalisée à celle de l'intensité SMP respective. Une moyenne entre les cerveaux gauche et droit a été utilisée pour un seul point de données. Pour la quantification dans les figures 7C et D, les retours sur investissement sont indiqués dans les figures et l'intensité du retour sur investissement a été calculée de manière similaire aux résultats de la figure 3H. Sur la figure 7C, une ligne a été tracée à travers la partie la plus large de la pointe du lobe a. Le profil d'intensité de cette ligne a été obtenu par ImageJ. Trente points de données au milieu d'un tel profil couvrant une ligne d'environ 15 mm ont été extraits pour chaque profil de ligne. Le profil a ensuite été normalisé à la valeur moyenne des cinq premiers points de données (F0) et calculé comme (F F0)/F0. Les valeurs moyennes de ces profils normalisés de différents cerveaux ont été tracées (figure 7C, panneau du milieu). Les profils gauche et droit des cerveaux ont été calculés et sont affichés séparément. Dans la figure 7D, les intensités relatives de différents ROI représentant différentes régions sont additionnées pour générer une mesure d'intensité totale pour le MB.

La construction d'expression d'ADNc de CNNM4 humaine utilisée pour étudier Mg2 plus l'efflux dans la culture cellulaire est celle décrite précédemment (Yamazaki et al., 2013). Une construction exprimant Drosophila uex a été générée en insérant une étiquette FLAG devant le codon STOP du CDS uex. Les ADNc CNNM4 et uex marqués FLAG ont ensuite été insérés dans l'étiquette pCMV-4A (Agilent) pour l'expression dans les cellules HEK293. Les cellules HEK293 ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Nissui) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et d'antibiotiques. Les plasmides d'expression ont été transfectés avec Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Pour l'immunocoloration, les cellules ont été fixées avec 3,7 % de formaldéhyde dans du PBS pendant 2 0 min, puis perméabilisées avec 0,2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min, les deux à température ambiante. Ils ont ensuite été bloqués avec du PBS contenant 3% de FBS et 10% d'albumine de sérum bovin (tampon de blocage) pendant 1 heure à température ambiante. Les cellules ont ensuite été incubées pendant une nuit à 4 °C avec un anticorps de lapin anti-FLAG (F7425, Sigma-Aldrich) dilué dans un tampon de blocage, lavées 3 fois avec du PBS et incubées pendant 1 heure à température ambiante avec Alexa 488-anti-FLAG conjugué. IgG de lapin (Invitrogen) et rhodamine-phalloïdine (pour la visualisation de la F-actine, Invitrogen) diluées dans un tampon de blocage. Après trois lavages avec du PBS, les lamelles ont été montées sur des lames et imagées avec un microscope confocal (FluoView FV1000 ; Olympus).

L'imagerie Mg2 plus avec Magnesium Green a été réalisée comme décrit (Yamazaki et al., 2013), avec de légères modifications. Pour éviter une diminution potentielle de [Mg2 plus ]i avec les protéines exprimées, les cellules HEK293 transfectées ont été cultivées dans un milieu de croissance additionné de 40 mM de MgCl2 jusqu'à l'imagerie. Les cellules ont ensuite été incubées avec du tampon de chargement Mg2 plus (78,1 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 40 mM MgCl2, 5,5 mM glucose et 5,5 mM HEPES-KOH [pH 7,4]), y compris 2 mM Magnesium Green-AM (Invitrogen), pendant 30 min à 37°C. Les cellules ont ensuite été rincées une fois avec un tampon de chargement et visualisées avec un microscope Olympus IX81 équipé d'une caméra CMOS ORCA-Flash 4.0 (Hamamatsu) et d'une lampe à mercure SHI-1300L (Olympus). La fluorescence a été mesurée toutes les 20 s (excitation à 470–490 nm et émission à 505–545 nm) sous le contrôle du logiciel Metamorph (Molecular Devices). Le tampon a ensuite été remplacé par du Mg2 plus un tampon libre (le MgCl2 dans le tampon de charge a été remplacé par 60 mM de NaCl). Les données sont présentées sous forme de tracés linéaires (moyenne de 10 cellules). Après imagerie, les cellules ont été fixées avec du PBS contenant 3,7 % de formaldéhyde et soumises à une microscopie par immunofluorescence pour confirmer l'expression des protéines.

Mesures de concentration de Mg2 plus basées sur FRET dans des cerveaux de mouches fixes

Mouches âgées d'un à deux jours avec le génotype c739 ; UAS-MagFRET-1 ont été conservés dans des flacons contenant 1 mM ou 80 mM [Mg2 plus ] d'aliments pendant 4 jours avant d'être collectés. Les cerveaux de mouches ont été disséqués dans du PBS et fixés pendant 2 0 min dans du PBS avec 4 % de paraformaldéhyde à température ambiante. Ils ont ensuite été brièvement lavés deux fois dans du PBT à 0,5 % (2,5 ml de Triton-X100 dans 497,5 ml de PBS) et trois lavages de 10 min. Les cerveaux ont ensuite été montés sur des lames de verre dans Vectashield (Vector Labs H1000) et imagés à l'aide d'un Slicescope Scientifica à champ large avec un objectif à immersion dans l'eau de 40 , 0,8 NA et une caméra Andor Zyla sCMOS avec le logiciel Andor Solis (v4.27). Afin d'obtenir le rapport FRET qui indique la concentration en Mg2 plus du neurone ab, des séries temporelles ont été acquises alternativement entre le canal céruléen et le canal citrine à 3 Hz avec 512 512 pixels et 16 bits. La longueur d'onde d'excitation pour les deux canaux est de 436 nm, tandis que le filtre d'émission pour la céruléenne est de 460–500 nm et celui pour la citrine est de 520–550 nm. L'acquisition en série commence à partir du canal céruléen et dure 5 s, puis passe au canal citrine et dure encore 5 s, et ce cycle est répété deux fois de plus. Un total de 30 s (90 images) de pile d'images a donc été acquis pour chaque cerveau. Les piles d'images ont ensuite été analysées à l'aide d'ImageJ et de scripts Matlab personnalisés. En bref, les retours sur investissement du rectangle (figure 1E, panneau de gauche) ont été dessinés manuellement sur les lobes ab (un sur un lobe et un sur le lobe b pour chaque hémisphère) et à l'extérieur des lobes ab (un pour chaque hémisphère) comme contrôle de fond. L'intensité de fluorescence du canal céruléen a été calculée en divisant chaque retour sur investissement de lobe vertical ou horizontal par le retour sur investissement de fond, et moyennée entre les deux hémisphères pour chaque lobe, et moyennée sur les 15 images pour chaque cycle. Celui du canal de citrine a été obtenu de la même manière. Un rapport FRET a été obtenu à partir des intensités ci-dessus, en outre moyennées parmi les trois cycles d'acquisition, représentés comme un point de données sur la figure 1E (panneau de droite).

Imagerie confocale Mg2 plus dans un explant de cerveau de mouche

Des cerveaux explantés exprimant c739-UAS-MagIC piloté par GAL4 ont été placés au fond d'un micropuits à fond de verre de 35 mm (référence P35G-1.5–14 C, MatTek Corporation), sous extracellulaire solution tampon saline (NaCl 103 mM, KCl 3 mM, N-Tris 5 mM, tréhalose 10 mM, glucose 10 mM, saccharose 7 mM, NaHCO3 26 mM, NaH2PO4 1 mM, CaCl2 1,5 mM, MgCl2 4 mM, osmolarité 275 mOsm [ pH 7,3]) après dissection dans un tampon sans calcium (Barnstedt et al., 2016). Pour déterminer la sensibilité Mg2 plus de UAS-MagIC ainsi que la réponse de UAS-MagIC à d'autres produits chimiques tels que l'EDTA, l'EGTA et le CaCl2 (figure 8B), les cerveaux ont été incubés dans la solution tampon saline avec 20 mg/ml de digitonine pour 6 min avant l'imagerie (Koldenkova et al., 2015). Pour étudier la fluctuation de Mg2 plus en réponse à l'application de forskoline (FSK) (figure 8C-I), les cerveaux ont été placés dans la solution tampon saline sans digitonine ni incubation. Dans les deux situations, la solution saline fait référence au tampon (avec ou sans digitonine) dans lequel le cerveau est immergé.

L'imagerie a été réalisée dans un microscope confocal LSM780 (Zeiss) avec un objectif 20 air à l'aide du logiciel ZEN 2011. La partie Vénus de MagIC a été excitée avec un laser à 488 nm et son émission a été collectée dans la gamme 520-560 nm. mCherry a été excité avec un laser de 561 nm et son émission a été collectée dans la plage de 600 à 640 nm. Les séries temporelles ont été acquises à 0,5 Hz avec 512 512 pixels et 16 bits. Après 60 s de mesure de référence Venus/mCherry, 2 à 20 ml de solution saline ou d'une autre solution chimique pertinente ont été ajoutés via une micropipette à la boîte avec une capture d'image constante. Les effets des agents appliqués sur l'émission Venus/mCherry ont ensuite été enregistrés pendant 15 à 20 min.

Les piles d'images ont ensuite été analysées à l'aide d'ImageJ et de scripts Python écrits sur mesure. En bref, les retours sur investissement du rectangle ont été dessinés manuellement sur les neurones ab (un pour chaque hémisphère, figure 8A), et un autre retour sur investissement de la même taille a été dessiné au milieu mais à l'extérieur des MB comme contrôle de fond. L'intensité de fluorescence du canal Vénus (ou mCherry) a été calculée en soustrayant le retour sur investissement de fond des retours sur investissement du calice, respectivement, et moyennée entre les deux hémisphères. Ceci est appelé 'Rel. Intensité (au)' dans la figure 8D et E. Le rapport entre l'intensité de Vénus et de mCherry a été calculé comme 'MagIC Ratio' dans la figure 8B et C et la figure 8F et G. Pour la figure 8H, l'intensité pour les deux canaux a été calculée séparément. Dans ce cas, 'Rel. L'intensité (DF/F0)' fait référence à l'intensité de fluorescence relative normalisée à l'intensité moyenne de la période de référence F0, calculée comme (FF0)/F{{9} }. L'intensité relative DF/F0 de Vénus a été utilisée pour calculer la PSD (Figure 8I) via la fonction python psd (sous matplotlib.pyplot), qui a adopté la méthode du périodogramme moyen de Welch (Bendat et al., 2000).

Transcription inverse et PCR quantitative en temps réel

Pour chaque échantillon, 120 mouches ont été congelées dans l'azote liquide et leurs têtes ont été complètement homogénéisées dans le réactif TRIzol (Invitrogen). L'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit Direct-zol RNA MiniPrep (R2050) en suivant les instructions du fabricant. L'ADNc a été synthétisé en utilisant le système de synthèse SuperScript III First-Strand (Invitrogen). Cinq échantillons indépendants ont été préparés pour chaque traitement ou génotype différent. Une PCR quantitative a été réalisée en triple pour chaque échantillon d'ADNc sur un instrument LightCycler 480 (Roche) en utilisant le SYBR Green I Master Mix (Roche). Les courbes de fusion ont été analysées après amplification et les amplicons ont été visualisés par électrophorèse sur gel d'agarose pour confirmer la spécificité de l'amorce. Les niveaux de transcription relatifs ont été calculés par la méthode 2-DDCt (Livak et Schmittgen, 2001), et la moyenne géométrique des valeurs Ct de trois gènes de référence (Gapdh, Tbp et Ef1a 100E) a été utilisée pour la normalisation. Les amorces sont détaillées dans le tableau des ressources.

PCR inverse

La PCR inverse a été utilisée pour cartographier la position d'insertion MiMIC chez les mouches uexMI01943. L'ADN génomique a été préparé à partir de 15 mouches adultes. L'ADN équivalent à deux mouches a ensuite été digéré dans une réaction de restriction de 25 ml avec Mbo I et 10 ml du produit ont été ligaturés pendant une nuit à 4°C pendant une nuit pour circulariser les fragments ; 5 ml du produit de ligature ont été utilisés pour la PCR inverse. Le produit de PCR a été purifié en utilisant la réaction Exo/SAP (Thermo Fisher, 78201) avant d'être séquencé. La séquence a été comparée au génome de D. melanogaster (FlyBase, version 6) par BLAST et correspondait uniformément à la région 3 882 886,3 882 641 sur 2R, conformément à l'insertion uexMI01943 rapportée sur FlyBase. Les amorces sont détaillées dans le tableau des ressources.

Prédiction et alignement du domaine protéique

L'alignement des séquences protéiques a été réalisé à l'aide de Geneious R10.2.2. La prédiction du domaine protéique a été réalisée avec InterPro (Finn et al., 2017; Jones et al., 2014) et Phyre2 (Kelley et al., 2015). L'alignement du domaine et de la structure des protéines a été réalisé à l'aide de TM-align (Zhang et Skolnick, 2005). La visualisation de la structure des protéines a été rendue dans Chimera 1.11.2 (Pettersen et al., 2004).

Quantification et analyses statistiques

Les données de comportement ont été analysées à l'aide d'Excel et de Prism 6. Les données d'imagerie ont été analysées à l'aide d'ImageJ et de scripts MATLAB ou Python écrits sur mesure. Des tests t bilatéraux non appariés ont été utilisés pour comparer deux groupes, et une ANOVA unidirectionnelle suivie d'un test post-hoc de Tukey a été utilisée pour comparer plusieurs groupes. Le seuil de signification statistique a été fixé à p<>

Remerciements

Nous remercions FJ Arjona et JGJ Hoenderop pour les clones murins CNNM2 et les commentaires sur le manuscrit. Nous sommes reconnaissants à T Nagai pour les clones de MagIC et MARIO et au Bloomington Stock Center et VDRC pour les mouches. Nous remercions P Cognigni, Y Huang, R Brain, R Szoke-Kovacs et M Goodwin pour le support technique et les autres membres du groupe Waddell pour discussion. Nous reconnaissons N Halidi, C Monico et l'unité Micron Advanced Bioimaging (soutenue par Wellcome Strategic Awards 091911/B/10/Z et 107457/Z/15/Z) pour leur soutien et leur assistance dans ce travail. EM a été financé par une bourse de longue durée EMBO (ALTF 184-2109). KDJ reconnaît le soutien du Rhodes Trust. SW a été financé par une Wellcome Principal Research Fellowship (200846/Z/16/Z) et une ERC Advanced Grant (789274).