Partie Ⅰ : Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche Tubulosa induisent l'apoptose des cellules de carcinome hépatocellulaire par les voies dépendantes des mitochondries et MAPK et améliorent l'effet antitumoral grâce à la combinaison avec le cisplatine

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Changshuang Fu, Yi Yang, Aipire Adila, Fangfang Zhou, Xianxian Wei, Weilan Zhang, Jie Lv, Yijie Li, Lijie Xia, Jinyao Li

Résumé

Cistanche tubulosaest un type de phytothérapie chinoise et exerce diverses fonctions biologiques. Des études antérieures ont démontré queGlycosides phényléthanoïdes de Cistanche tubulosa (CTPG)présentent des effets antitumoraux sur une variété de cellules tumorales. Cependant, les effets antitumoraux du CTPG sur les cellules de carcinome hépatocellulaire (HCC) HepG2 et BEL-7404 sont encore insaisissables. Notre étude a montré que le CTPG inhibait de manière significative la croissance des cellules HepG2 et BEL -7404 par l'induction de l'arrêt du cycle cellulaire et de l'apoptose, qui était associée à l'activation des voies MAPK caractérisées par la phosphorylation régulée à la hausse de p38, JNK, et ERK1/2 et voie mitochondriale dépendante caractérisée par la réduction du potentiel membranaire mitochondrial. La libération de cytochrome c et le clivage de caspase-3, -7, -9 et PARP ont ensuite été augmentés par le traitement au CTPG. De plus, le CTPG a supprimé de manière significative la migration de HepG2 en réduisant les niveaux de métalloprotéinase matricielle -2 et de facteurs de croissance endothéliales vasculaires. Fait intéressant, le CTPG a non seulement amélioré la prolifération des splénocytes, mais a également réduit l'apoptose des splénocytes induite par le cisplatine. Dans le modèle murin de tumeur H22, le CTPG combiné au cisplatine a encore inhibé la croissance des cellules H22 et réduit les effets secondaires du cisplatine. Pris ensemble, le CTPG a inhibé la croissance du CHC par l'effet antitumoral direct et l'effet d'immunoamplification indirecte et a amélioré l'efficacité antitumorale du cisplatine.

Mots clés

Cistanche tubulosaglycosides phényléthanoïdes, apoptose, voie MAPK, voie dépendante des mitochondries, cisplatine, immunoenhancement.

Introduction

On prévoyait que le cancer du foie serait le sixième cancer le plus fréquemment diagnostiqué et la quatrième cause de décès par cancer dans le monde en 2018, avec environ 841 000 nouveaux cas et 782 000 décès par an en Asie du Sud-Est (Mongolie, Cambodge et Vietnam). .1 En Chine, le cancer du foie était la troisième cause de décès lié au cancer en 2015.2 Plus de 90 % des cancers primitifs du foie sont des carcinomes hépatocellulaires (CHC) dans le monde. Actuellement, l'hépatectomie, la transplantation hépatique et l'ablation percutanée sont les principales méthodes de traitement du CHC. Malheureusement, ces traitements sont efficaces pour 30 % des patients diagnostiqués avec un cancer du foie précoce, tandis que les patients diagnostiqués avec un cancer du foie avancé (représentant 40 %) doivent compter sur un traitement palliatif pour prolonger leur durée de survie.3,4 Le sorafénib en association avec un traitement hépatique la chimioembolie artérielle est un traitement palliatif important et courant pour la plupart des patients atteints de CHC avancé dans la région Asie-Pacifique.5 Le sorafenib, approuvé par la FDA en 2006 pour le traitement du cancer du foie avancé, est un inhibiteur de kinases multiples qui inhibe la prolifération des cellules tumorales et les effets vasculaires. production et favorise l'apoptose des cellules tumorales. Le sorafenib prolonge significativement la durée de survie du patient de 3 à 5 mois mais a des effets secondaires graves et est étroitement lié à la survenue d'une résistance aux médicaments.6 Par conséquent, il est urgent de développer de nouveaux médicaments ou stratégies pour le CHC.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) seule ou en combinaison avec d'autres stratégies a été utilisée pour traiter le CHC et a montré des avantages cliniques, notamment une durée de survie prolongée, une meilleure qualité de vie, une réduction des effets indésirables, etc.7,8Cistancheest un TCM contenant des glycosides phényléthanoïdes (PhG), des iridoïdes, de la lignine et des polysaccharides qui ont diverses fonctions biologiques, telles que des fonctions anti-oxydation, anti-inflammatoire, anti-âge, d'amélioration de la mémoire et d'amélioration immunitaire.9 Les PhG ont été considérés comme les principaux composants actifs deCistanche, et ont de multiples fonctions, y compris l'anti-oxydation, l'anti-inflammation, l'anti-apoptose, l'hépatoprotection et la neuroprotection.10-12 Notre groupe avait rapporté queGlycosides phényléthanoïdes de Cistanche tubulosa(CTPG) pourrait inhiber la croissance des cellules B16-F10 du mélanome, des cellules Eca-109 du carcinome œsophagien et des cellules HCC H22 par des voies de signalisation extrinsèques ou intrinsèques in vitro ou in vivo ; de plus, le CTPG avait un effet immunostimulant.13-15

Dans cette étude, nous avons étudié l'effet antitumoral et le mécanisme du CTPG sur les cellules HepG2 et BEL-7404 in vitro, analysé la fonction immunomodulatrice du CTPG in vitro et in vivo, et évalué plus en détail l'effet thérapeutique du CTPG combiné à la chimiothérapie. médicament cisplatine sur des souris tumorales HCC H22 in vivo. Nous avons découvert que le CTPG pouvait inhiber la croissance des cellules HepG2 et BEL-7404 par l'apoptose dépendante des mitochondries et la voie de signalisation MAPK. Le CTPG a significativement inhibé la migration des cellules HepG2 en réduisant les taux de métalloprotéinase matricielle -2 (MMP-2) ​​et de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). De plus, le CTPG a favorisé la prolifération et l'activation des cellules immunitaires et renforcé l'immunité des souris. Il est important de noter que le CTPG combiné au cisplatine peut inhiber davantage la croissance des cellules H22 in vivo et réduire les effets secondaires du cisplatine.

Matériaux et méthodes

Animaux

Des souris mâles BALB/c, Kunming et femelles C57BL/6 âgées d'environ 6 à 8 semaines ont été achetées au Centre de laboratoire animalier de l'Université médicale du Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Chine) et hébergées dans une animalerie de l'Université du Xinjiang à température ambiante. (RT) de 25 ± 3 degrés et une période lumière-obscurité de 12/12 heures.

Lignées cellulaires et culture cellulaire

Les cellules murines H22 ont été achetées auprès de Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chine), et les cellules humaines HCC HepG2 et BEL-7404 ont été obtenues auprès du Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering , Université du Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Chine) et cultivés dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, États-Unis) ou du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Gibco) contenant 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (MRC, Chine), 1 % de L -glutamine (100 mM), 100 U/mL de pénicilline et 100 ug/mL de streptomycine à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.

Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

Les principaux composés du CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Shanghai, Chine) ont été qualifiés et quantifiés par HPLC comme indiqué précédemment.13 Une colonne ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm ; 5 μm) a été utilisée et la phase mobile consistait en une solution d'acide formique à 0,2 % et de méthanol avec un gradient de 23 % à 31 %. Un échantillon total de 10 μL a été injecté et détecté à 330 nm. Les standards échinacoside et actéoside (Yuanye, Shanghai, Chine) ont été utilisés pour analyser les composants du CTPG.

Analyse de la viabilité cellulaire

Les effets antitumoraux du CTPG sur les cellules HepG2 et BEL-7404 ont été évalués à l'aide de MTT (3-(4, 5-diméthyl-2-thiazolyl)-2, {{7 }}diphényl-2-bromure de H-tétrazolium). Les cellules HepG2 et BEL-7404 ont été étalées dans des plaques 96-puits (5 × 104 cellules/puits) et traitées avec 0, 200, 400 et 600 ug/mL de CTPG pendant 24 et 48 heures, respectivement, après 24 heures d'incubation à 37 degrés. Environ 35 ug/mL de cisplatine (Yuanye) ont été utilisés comme contrôle positif. Ensuite, 100 μL de MTT (0,5 mg/mL, dilué par du milieu sans milieu FBS) ont été ajoutés à chaque puits et cultivés pendant 3 heures à 37 degrés et 5 % de CO2. Après incubation, les plaques ont été centrifugées à 1200 tr/min pendant 7 minutes, le milieu a été retiré et 200 ug/mL de DMSO ont été ajoutés à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan formés. Les valeurs de DO490 ont été mesurées par un lecteur de microplaques 96-puits (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Pour évaluer les effets du CTPG sur les splénocytes, les cellules ont été isolées de souris C57BL/6 et étalées dans des plaques à puits 96- à une densité de 1 × 105 cellules/puits. Les splénocytes ont été traités avec 0, 200, 400 et 600 ug/mL pendant 24, 48 et 72 heures, respectivement. La viabilité cellulaire a été calculée selon la formule suivante : Viabilité cellulaire (pourcentage)=(ODtraitée/ODnon traitée) × 100 % .

Détection de Ki-67

La détection de Ki{{0}} a été effectuée conformément à notre étude précédente.16 En bref, les cellules BEL-7404 ont été traitées avec différentes concentrations (0, 200, 400 et 600 ug/mL) de CTPG ou cisplatine (35ug/mL). Après 24 heures, les cellules ont été récoltées et lavées avec du PBS, puis fixées et perméabilisées avec le Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, USA) selon les instructions du fabricant. La coloration intracellulaire a été réalisée à l'aide d'un anticorps Ki-67 conjugué au FITC (BD Biosciences, San Jose, Californie, États-Unis) pendant 15 minutes à température ambiante. Les échantillons ont été analysés par cytométrie en flux (BD FACSCalibur, CA, USA).

Analyse de l'apoptose cellulaire et du cycle cellulaire

Les cellules HepG2 et BEL-7404 ont été ensemencées à une densité de 2,5 × 105 cellules/boîte et incubées à 37 degrés pendant la nuit. Les cellules ont été trypsinisées et récoltées par centrifugation après traitement avec diverses concentrations de CTPG ou prétraitées avec un inhibiteur de caspase (Z-VAD-FMK) ou un inhibiteur de caspase -3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Chine) pendant 2 heures avant le traitement CTPG. Après 24 heures, l'apoptose a été détectée par cytométrie en flux. En bref, les cellules collectées ont été lavées avec du PBS froid (Gibco) et remises en suspension dans un tampon de liaison à l'annexine avec 2,5 μL d'annexine V-FITC et 5 μL de solution de coloration PI-PE (Solarbio, Pékin, Chine), puis les cellules ont été incubées à température ambiante. dans le noir pendant 15 minutes. Pour l'analyse de la distribution du cycle cellulaire, les cellules ont été récoltées après le traitement au CTPG et fixées dans de l'éthanol froid à 70 % à 4 degrés pendant 30 minutes. Les cellules ont été colorées avec du PI (BD Biosciences) dans l'obscurité pendant 30 minutes. Les échantillons ont été analysés par cytomètre en flux (BD FACSCalibur). Les niveaux d'expression de l'apoptose cellulaire et des protéines liées au cycle ont été détectés par Western blot.

Western Blot

Western blot a été effectué selon notre étude précédente. 17 HCC ont été traités avec CTPG pendant 24 heures. Après avoir lavé deux fois avec du PBS glacé, toutes les cellules adhérentes et flottantes ont été collectées et lysées dans du tampon de lyse RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) pendant 2 0 minutes sur de la glace. Après centrifugation à 12 000 tr/min à 4 degrés pendant 10 minutes, la concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un kit de dosage de l'acide bicinchoninique (Thermo Fisher Scientific, USA) conformément aux instructions du fabricant. La même concentration de protéines a été séparée par SDS-PAGE à 12 % et transférée sur des membranes de PVDF. Après lavage avec du tampon PBST (PBS avec 0,05 % de Tween-20), les membranes ont été bloquées avec 5 % de lait écrémé à 37 degrés pendant 1 heure, puis incubées avec les anticorps primaires (Cell Signaling Technology, MA, USA ) à des dilutions appropriées pendant la nuit à 4 degrés. Après avoir lavé 3 fois avec du PBST, la membrane a été incubée avec les anticorps secondaires conjugués à la HRP correspondants (eBioscience) pendant 2 heures à 37 degrés. Les protéines cibles ont été détectées à l'aide d'un kit de dosage ECL (Beyotime). Les données de numérisation en niveaux de gris ont été obtenues par Image J.

Analyse du potentiel de membrane mitochondriale (Δψm)

Δψm a été déterminé par un colorant JC -1 perméable à la membrane (Beyotime). En bref, les cellules HepG2 et BEL-7404 ont été traitées avec différentes concentrations de CTPG (0, 200, 400 et 600 ug/mL) pendant 24 heures. Toutes les cellules ont été collectées et lavées avec un tampon de lavage JC-1. Les cellules ont été colorées avec la sonde fluorescente JC-1 conformément aux instructions du fabricant pendant 20 minutes à température ambiante. Après deux lavages avec du PBS, tous les échantillons ont été analysés par cytométrie en flux (BD FACSCalibur).

Hoechst 33342 Coloration

La coloration au Hoechst 33342 a été effectuée conformément à notre étude précédente.16 Les changements morphologiques des noyaux ont été examinés à l'aide du colorant de liaison à l'ADN perméable à la membrane Hoechst 33342 (Beyotime). En bref, les cellules ont été inoculées dans une plaque à puits 6- à la concentration de 1 × 105 cellules/puits dans un milieu de 2 ml. Lorsqu'elles ont atteint 70 à 80 % de confluence, les cellules ont été traitées avec 200, 400 et 600 ug/mL de CTPG ou de cisplatine pendant 24 heures. Les cellules ont été lavées avec du PBS et fixées avec du paraformaldéhyde glacé à 4 % à 4 degrés pendant 10 minutes. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été colorées avec Hoechst 33342 à 4 degrés pendant 10 minutes. Les échantillons ont été observés au microscope inversé à fluorescence (Nikon Eclipse Ti-E, Japon).

Essai de migration

La migration des cellules HCC a été détectée par le test de cicatrisation. En bref, des cellules HepG2 (2×104/puits) ont été ensemencées dans une plaque 24-puits. Après avoir atteint 80 % de confluence, le centre de chaque puits a été rayé une fois avec une pointe de pipette de 20 μL. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été traitées avec du cisplatine (35 ug/mL) ou différentes concentrations (0, 200, 400 et 600 ug/mL) de CTPG à 37 degrés. Après 24 heures, des images de chaque échantillon ont été prises au microscope (Nikon Eclipse Ti-E). Les distances moyennes de migration cellulaire ont été analysées par l'image J. Le pourcentage de cicatrisation a été calculé par l'équation : cicatrisation (pourcentage)=(1 zone de rayure au point temporel indiqué/zone de rayure à 0 heure) × 100 pour cent. Les niveaux d'expression des protéines liées à la migration cellulaire MMP-2 et VEGF ont été détectés par Western blot.

Prolifération et apoptose des splénocytes

Pour l'analyse de la prolifération, des splénocytes ont été isolés de 3 souris C57BL/6 et colorés au CFSE (eBioscience). Les cellules marquées CFSE ont été inoculées dans des plaques 24-puits à une densité de 2 × 106 cellules dans 1 mL de milieu par puits et traitées avec différentes concentrations de CTPG (200, 400 et 600 ug/mL) ou combinées avec 35 ug /mL de cisplatine pendant 72 heures. L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée après coloration avec CD3-APC et CD19-PE (BD Biosciences). Pour l'analyse de l'apoptose, les splénocytes ont été inoculés dans des plaques 24-puits à une densité de 2 × 106 cellules dans 1 mL de milieu par puits et traités avec différentes concentrations de CTPG (200, 400 et 600 ug/mL) ou combinés avec cisplatine pendant 24 heures. L'analyse par cytométrie en flux a été réalisée après coloration avec 2,5 μL d'annexine V-FITC et 5 μL de solution PI-PE.

Évaluation de la sécurité et activités immunostimulatrices du CTPG in vivo

Pour évaluer les activités immunostimulatrices in vivo du CTPG, des souris Kunming mâles âgées de 6 à 8 semaines ont été réparties au hasard en 7 groupes (5 souris/groupe). L'injection sous-cutanée (sc, 200, 400 mg/kg), l'injection intrapéritonéale (ip, 200, 400 mg/kg) et l'administration intragastrique (ig, 200, 400 mg/kg) ont été appliquées tous les 2 jours pour un total de 7 fois , tandis que le groupe témoin n'a reçu aucun traitement. Les souris ont été pesées tous les deux jours et l'état des souris a été observé tous les jours. Après traitement au CTPG, les organes des souris ont été séparés et pesés. Les indices d'organes ont été calculés selon la formule : indice d'organe=poids d'organe (mg)/poids corporel (g). Les splénocytes ont été prélevés, comptés et colorés avec anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC ou anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Les échantillons ont été détectés par cytométrie en flux (BD FACSCalibur).

Efficacité antitumorale du CTPG combiné au cisplatine chez les souris porteuses de tumeur H22

Des souris BALB/c mâles âgées d'environ 6 à 8 semaines ont reçu une injection sous-cutanée de cellules H22 (1,0 × 106 par souris dans 100 μL de PBS). Lorsque les volumes tumoraux ont atteint environ 60 mm3, les souris porteuses de tumeurs ont été réparties au hasard en 4 groupes (6 souris/groupe) et traitées avec du cisplatine (4 mg/kg), du CTPG (400 mg/kg), du cisplatine (4 mg/kg) plus du CTPG ( 400 mg/kg), ou sans traitement (groupe témoin), respectivement. Les souris tumorales ont reçu une injection intrapéritonéale de CTPG les 5ème, 7ème, 9ème, 11ème et 13ème jours, respectivement. Le cisplatine a été injecté par voie intraveineuse les 7e et 11e jours. Le volume de la tumeur et le poids corporel ont été mesurés tous les deux jours. Le volume de la tumeur a été calculé comme suit : volume de la tumeur (V)=a × b2/2, dans lequel a et b représentent respectivement le diamètre le plus long et le plus court d'une tumeur mesurés au pied à coulisse. Au 20e jour, les organes et les tumeurs ont été isolés et pesés. Les splénocytes ont été prélevés, comptés et colorés avec anti-CD3-APC et anti-CD19-PE ou anti-CD4-FITC et anti-CD8-APC ou anti-CD11b-PE et anti-Gr-1-APC ou anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC et anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Par la suite, les fréquences et les nombres de cellules ont été analysés par cytométrie en flux (BD FACSCalibur).

Analyses statistiques

Toutes les données ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle/bidirectionnelle (ANOVA) à l'aide du logiciel Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">

Résultats

Le CTPG a inhibé la prolifération des cellules HCC in vitro

Les composants du CTPG ont été qualifiés et quantifiés par HPLC à l'aide d'étalons d'échinacoside et d'actéoside (Figure 1A supplémentaire), qui étaient les principaux composants des glycosides phényléthanoïdes de Cistanche. 18 Selon les temps de rétention des pics et les surfaces des pics, le CTPG contenait 28 % d'échinacoside et 9,9 % d'actéoside. En outre, la teneur en polysaccharides du CTPG était de 34,8 % par la méthode au phénol-acide sulfurique.19 Le test MTT a montré que le CTPG réduisait de manière significative la viabilité des cellules BEL-7404 et HepG2 en fonction de la dose et du temps ( Figure 1A). De manière constante, la prolifération des cellules BEL-7404 a été significativement inhibée par le traitement CTPG, qui a été analysé par coloration Ki-67 (Figure 1B). L'effet du CTPG sur la prolifération des splénocytes in vitro a également été analysé par dosage MTT. Nous avons observé que le CTPG augmentait la prolifération des splénocytes de manière dose-dépendante (figure 1C).

La voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) joue un rôle central dans la survie, la différenciation et la résistance aux médicaments des cellules cancéreuses humaines.20 Afin de déterminer si la voie de signalisation MAPK était impliquée dans l'effet inhibiteur du CTPG sur la prolifération des cellules HCC, les niveaux de phosphorylation de diverses protéines de la voie du signal MAPK ont été analysés dans des cellules HepG2 après traitement avec CTPG à différentes concentrations et à différents moments. La phosphorylation de JNK (P-JNK) et p38 (P-p38) a été augmentée de manière dose-dépendante par le traitement au CTPG. La phosphorylation de ERK (P-ERK) a été régulée à la baisse par un traitement CTPG à 200 et 400 ug/mL, tandis que P-ERK a été régulée à la hausse sous un traitement CTPG à 600 ug/mL (figure 1D). De plus, les niveaux de P-JNK, P-p38 et P-ERK ont été régulés à la hausse de manière dépendante du temps (Figure 1D). Ces résultats suggèrent que le CTPG pourrait inhiber la prolifération des cellules HCC via la voie de signalisation MAPK

Arrêt du cycle cellulaire du CHC induit par le CTPG en phase S

Nous avons en outre analysé si le CTPG inhibait la prolifération des cellules HCC par induction de l'arrêt du cycle cellulaire. Après traitement au CTPG, une accumulation de cellules BEL-7404 en phase S a été observée de manière dose-dépendante. De même, le CTPG a également induit l'arrêt du cycle cellulaire HepG2 en phase S et les fréquences sont passées de 40,66 % dans le groupe témoin à 61,90 % dans le groupe traité avec 600 ug/mL de CTPG (figure 2A). Les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (CDK) jouent un rôle important dans le contrôle et le développement de la division cellulaire,21 qui étaient associés à la phase G2/M.22 Progression en phase S. Les niveaux d'expression de la cycline B1, CDK1 et CDK2 ont également été réduits ; ces protéines étaient associées à la phase G2/M (figure 2B). Ces résultats suggèrent que le CTPG supprime la prolifération des cellules HCC en induisant l'arrêt du cycle cellulaire.

Voie d'apoptose dépendante des mitochondries activée par le CTPG dans les cellules HCC

Nous avons également détecté si le CTPG déclenchait l'apoptose dans les cellules HCC et avons constaté que le CTPG induisait l'apoptose dans les cellules HepG2 et BEL -7404 de manière dose-dépendante (figure 3A). En outre, les niveaux d'expression de Bax et Bcl -2 ont été augmentés et diminués par le traitement CTPG de manière dose-dépendante, respectivement (figure 3B). L'apoptose des cellules HepG2 a été en outre déterminée par coloration Hoechst 33342 après traitement au CTPG pendant 24 heures. La morphologie nucléaire a été observée par un microscope inversé à fluorescence. Comme le montre la figure 3C, les cellules HepG2 témoins ont été colorées de manière homogène tandis que les cellules HepG2 traitées avec CTPG ont montré une condensation et une fragmentation de la chromatine de manière dose-dépendante, ce qui était similaire aux cellules HepG2 traitées avec du cisplatine. Ces résultats ont indiqué que le CTPG induisait l'apoptose des cellules HCC.

L'intégrité de la membrane mitochondriale externe est strictement régulée par la famille Bcl-2 et la réduction de Δψm favorise la libération de cytochrome c qui active la cascade de caspases pour induire l'apoptose.23,24 Lorsque Δψm diminue, le JC{{ 3}} polymère (fluorescence rouge) se décompose en monomères (fluorescence verte). 25 Par conséquent, le Δψm des cellules HCC a été détecté par coloration JC-1 après traitement CTPG pendant 24 heures. Comme le montre la figure 4A, l'intensité de la fluorescence verte du canal FL-1 a été augmentée en fonction de la dose par le traitement CTPG, tandis que l'intensité de la fluorescence rouge du canal FL-2 a été diminuée en fonction de la dose dans les deux Cellules BEL-7404 et HepG2. L'observation au microscope à fluorescence inversée a montré un résultat similaire (figure 4B), indiquant que le CTPG réduit le Δψm des cellules HCC. Par la suite, nous avons observé que les niveaux de cytochrome c étaient augmentés dans les cellules BEL -7404 et HepG2 après le traitement au CTPG (figure 4C), ce qui confirmait davantage la réduction de Δψm dans les cellules HCC traitées au CTPG.

La libération de cytochrome c peut activer la caspase initiatrice-9 pour induire l'apoptose.26 Les résultats du test Western blot suggèrent que les niveaux de caspase clivée-3, -7 et{{4} } ont été augmentés tandis que le niveau de caspase clivée -8 n'a pas été modifié (Figure 5). La caspase activée-3 peut cliver l'enzyme de réparation de l'ADN de la poly (ADP-ribose) polymérase (PARP) pour empêcher la réparation de l'ADN et accumuler des dommages à l'ADN.27 Nous avons également observé des niveaux régulés à la hausse de PARP clivée. Le rôle de la cascade de caspases dans l'apoptose des cellules HCC induite par le CTPG a été déterminé en utilisant respectivement un inhibiteur de caspase (Z-VAD-FMK) et un inhibiteur de caspase-3 (Ac-DEVD-CHO). Z-VAD-FMK a inversé de manière significative l'apoptose des cellules BEL -7404 et HepG2 induite par le CTPG (Figure 1B supplémentaire). De même, Ac-DEVD-CHO a également inversé de manière significative l'apoptose des cellules HepG2 induite par le CTPG (Figure 1C supplémentaire). Les résultats ont démontré que le CTPG induisait l'apoptose des cellules HCC par une voie dépendante des mitochondries.

CTPG Suppression de la migration des cellules HCC in vitro

La migration des cellules cancéreuses est considérée comme l'un des processus critiques dans les métastases tumorales. Pour déterminer si le CTPG affecte la migration des cellules HCC, la motilité des cellules HepG2 a été évaluée par le test de cicatrisation. Comme le montrent les figures 6A et B, la migration des cellules HepG2 a été significativement inhibée par le traitement CTPG d'une manière dose-dépendante. La famille MMP et le VEGF jouent un rôle essentiel dans la migration des cellules tumorales.28 Après un traitement au CTPG pendant 24 heures, les taux de MMP-2 et de VEGF ont été considérablement réduits (Figure 6C), ce qui suggère que le CTPG pourrait supprimer l'invasion et les métastases. du HCC.

Le CTPG a amélioré l'immunité des souris

Il a été rapporté que les polysaccharides de Cistanche deserticola ont des fonctions immunomodulatrices, notamment la promotion de la prolifération des lymphocytes et l'activation des macrophages.29 Les lymphocytes T et les lymphocytes B sont les principaux lymphocytes, qui interviennent respectivement dans les réponses immunitaires cellulaires et humorales. Le CTPG contenait une teneur en polysaccharides de 34,8 %. Par conséquent, nous avons examiné les effets du CTPG sur la prolifération des lymphocytes T et des lymphocytes B. Comme le montre la figure supplémentaire 2A, le CTPG a augmenté de manière significative la prolifération des lymphocytes T et des lymphocytes B de manière dose-dépendante, même en présence de cisplatine. Fait intéressant, le CTPG a inhibé de manière significative l'apoptose des splénocytes induite par le cisplatine (Figure 2B supplémentaire), indiquant que le CTPG pourrait atténuer les effets secondaires du cisplatine sur le système immunitaire des souris.

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