Partie Ⅱ : Isolement guidé par la déréplication de nouveaux diglycosides substitués par des phénylpropanoïdes à partir de Cistanche Salsa et leur activité inhibitrice sur la production de NO dans les macrophages

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Retour à la partie Ⅰ

Un groupe 3-méthylbutényle, une sous-structure aglycone, a été suggéré par les corrélations COSY de H-2 avec H-1a et H-1b et les corrélations HMBC entre H{{ 4}} et H-5 et les carbones oléfiniques, à kC 120,7 (C-2) ​​et 136,4 (C-3). Deux fractions de sucre ont été établies par l'analyse des spectres RMN et l'analyse des spectres HPLC de l'hydrolysat acide, avec un motif de fragment MS. Leur configuration absolue a été déterminée comme étant le D-glucose et le L-rhamnose en utilisant l'analyse HPLC de l'hydrolysat acide [17]. Ces fractions de sucre ont été définies comme un -glucose et un a-rhamnose en couplant les constantes des protons anomères. Le spectre 1H-1H COSY a montré des corrélations séquentielles de H-13 à H-63 et de H-133 à H-633 (Figure 4).

Un proton de glucose rétrogradé à kH 4,70 (H -43) a suggéré un substituant acyle sur le glucose. A partir du spectre HMBC, la corrélation entre H-43 et C-9333 a confirmé la position du substituant caféoyle. Les corrélations HMBC entre H-13 et C-1 (kC 64,5) et entre H-33 (kH 3,68) et C-133 (kC 101,2) suggèrent les positions de chaque substituant . En conséquence, la structure de 6 a été déterminée comme 3-methylbutenyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D- glucose-pyranoside et nommé cistansalside B.

Le cistansalside C (12), une poudre amorphe brune, a été déterminé comme ayant une formule moléculaire de C26H38O13 par (plus)-HR-ESI-QTOF-MS, qui a montré un pic à m/z 581,2213 [M plus Na] plus (calcd .pour C26H38O13Na, 581.2205). Un ion caractéristique à m/z 163 suggérait qu'un substituant caféoyle existait dans la structure. Les ions fragments à m/z 325 et m/z 471 suggèrent l'existence d'une unité rhamnose et d'une unité glucose.

La comparaison des spectres RMN de 12 avec ceux de 6 a montré qu'ils étaient similaires à l'exception de la structure aglycone. Dans les spectres RMN de 12, deux carbones paraffiniques à kC 38.0 (C-2) et 24,4 (C-3) ​​ont été observés au lieu de deux carbones oléfiniques à kC 12{{16 }}.7 (C-2) et 136.4 (C-3) dans l'aglycone de 6. Les groupes méthyle germinaux (kH 0.88) dans l'aglycone de 12 ont été déplacés vers le haut par rapport à H-4 et H-5 (kH 1,71 et 1,63) dans l'aglycone de 6 (tableau 2). Il a été suggéré que l'aglycone de 12 était un groupe 3-méthylbutyle, ce qui a été confirmé par les spectres RMN 1H et COSY. Des pics du groupe 3-méthylbutyle ont été observés à 3,81 (1H, m, H-1a), 3,48 (1H, m, H-1b), 1,71 (1H, m , H-3), 1,44 (2H, m, H-2) et 0,88 (H-4, 5).

Deux fractions de sucre ont été réaffirmées par l'analyse HPLC de l'hydrolysat acide et l'analyse des spectres RMN ainsi que le modèle de fragment MS. Les configurations absolues des sucres ont été identifiées comme D-glucose et L-rhamnose en utilisant l'analyse HPLC de l'hydrolysat acide [17]. Un groupement -glucose et un groupement a-rhamnose ont été confirmés par des constantes de couplage des protons anomères. Le spectre 1H-1H COSY a montré des corrélations séquentielles de H-13 à H-53, de H-133 à H-333 et de H{{11} } à H-433 (Figure 4).

La position des substituants a été confirmée au moyen de l'analyse HMBC. Dans le spectre HMBC, les corrélations entre H-13 et C-1 (kC 67,2), entre H-33 (kH 3,68) et C-133 (kC 101,2) et entre H-43 (kH 4,70) et C-9333 (kC 165,7) ont été détectés. Par conséquent, la structure de 12 a été établie comme étant 3-methyl butyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucose-pyranoside et nommé cistansalside C.

Le cistansalside D (17), une poudre brune amorphe, a été déterminé comme ayant une formule moléculaire de C31H38O14 par l'ESI-QTOF-MS à haute résolution en mode positif, qui a montré un pic d'ion d'adduction à m/z 657,2147 [M plus Na] plus (calculé pour C31H38O14Na, 657,2154). Ions fragmentés comprenant un [M plus H x Aglycone x Rha x Acetyl Glc] plus un ion à m/z 147, un [M plus H x Aglycone x Rha] plus un ion à m/z 351 et un [M plus H x Aglycone] des ions plus à m/z 497 ont également été détectés. Un ion caractéristique à m/z 147 suggérait qu'un substituant coumaroyle était présent dans sa structure. Les ions fragments à m/z 351 et m/z 497 suggèrent l'existence d'une unité rhamnose et d'une unité glucose substituée par acétyle.

Cistansalside à partir deherbe de cistanche

Le spectre 13C-RMN a révélé la présence de 31 atomes de carbone. Deux protons anomères à kH 4,61 (1H, m, H-13) et 4,60 (1H, s, H{{10}}) ont été observés dans les spectres 1H et HSQC . Le spectre 1H-RMN a indiqué la présence d'un groupe méthyle à a 1,97 (3H, s, acétyl-CH3), une trans-oléfine à kH 7,55 (1H, d, J=15.9 Hz, H{{ 25}}) et 6,34 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8333) et deux cycles benzéniques para-substitués à kH 7,53 (2H, d, J=6. 9 Hz, H-3333, 5333) et 6,79 (2H, ré, J=6.9 Hz, H-2333, 6333)/ kH 6,98 (2H, ré, J {{5 0}}.0 Hz, H-2, 6) et 6.65 (2H, d, J=8.0 Hz, H-3, 5) (Tableau 2) . À partir du spectre RMN HMBC, les corrélations entre un carbone carbonyle à kc 165,5 (C-9333) et H-8333 et entre H-2333, 6333 et C-7333 (kc 145.4) suggérait un groupe (E)-coumaroyle. La corrélation HMBC entre un pic de proton méthyle et un carbone carbonyle à kc 169,0 a confirmé la présence d'un groupe acétyle.

Un groupe 4-hydroxyphényle a été suggéré sur la base des corrélations HMBC entre H-3, 5 et les carbones aromatiques quaternaires à kC 155,6 (C-4) et 128,6 (C-1) . Un groupe éthyle hydroxylé a été confirmé par les signaux RMN COSY à kH 2,66 (2H, t, J=6.1 Hz, H-7), 3,90 (1H, m, H-8a ) et 3,54 (1H, m, H-8b). Les corrélations HMBC entre H-7 et C-1 (kC 128,6) et C-2, 6 (kC 129,7) suggèrent un groupe 4-hydroxyphényléthyle, en tant que sous-structure aglycone.

Deux fractions de sucre, suggérées à partir du modèle de fragment MS, ont été reconfirmées par l'analyse HPLC de l'hydrolysat acide et les spectres RMN. Le D-glucose et le L-rhamnose ont été élucidés par analyse HPLC de l'hydrolysat acide [17]. Un groupement -glucose et un groupement a-rhamnose ont été établis en couplant les constantes des protons anomères. Le spectre 1H-1H COSY a montré des corrélations séquentielles de H-13 à H-53 et de H-133 à H-633 (Figure 4).

À partir du spectre 1H-RMN, le déplacement vers le bas de H-23 (kH 4,69) et H-43 (kH 4,80) suggère la position acyl-substituée sur le glucose. Les connexions entre le glucose et deux groupes acyle ont été confirmées par les corrélations HMBC entre H-43 (kH 4,80) et C-9333 et entre H-23 et le carbone carbonyle d'un groupe acétyle (kC 169,0 ). Les positions d'un aglycone et du rhamnose ont été données par les corrélations HMBC entre H-33 (kH 3,95) et C-1333 et entre H-8 et C-13. En conséquence, la structure de 17 a été attribuée comme 4-hydroxyphényléthyl-2-O-acétyl-O- -L-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)- coumaroyl- -D-glucopyranoside et nommé cistansalside D.

Le cistansalside E (18) a été isolé sous la forme d'une poudre brune amorphe. Sa formule moléculaire a été déterminée comme étant C31H38O14 par les données 13C-NMR et le pic ESI-QTOF-MS à haute résolution en mode positif à m/z 657,2166 [M plus Na] plus (calculé pour C31H38O14Na, 657,2154). De plus, des ions fragments comprenant un ion caféoyle à m/z 163, un ion [M plus H x Aglycone x Rha] plus à m/z 367 et un ion [M plus H x Aglycone] à m/z 513 ont également été détectés. Les ions fragments suggèrent l'existence d'une unité rhamnose et d'une unité glucose substituée par acétyle.

Le spectre 1H-RMN suggère la présence de deux protons anomères à kH 4,63 (1H, d, J=8.2 Hz, H-13) et 4,60 (1H, s, H-133 ) et deux protons de glucose substitués par un acyle à kH 4,71 (1H, dd, J=8.9, 8,2 Hz, H-23) et 4,81 (1H, dd, J=9.7 , 9,5 Hz, H-43). Les spectres 1H et HMBC suggèrent l'existence d'un groupe acétyle à kH 1,94 (3H, s, acétyl-CH3), d'un groupement (E)-caféoyle à kH 7,48 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7333), 7,02 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2333), 6,98 (1H, dd, J=8.1, 1,6 Hz, H-6333), 6,76 (1H,d, J=8.1 Hz, H-5333) et 6,21 (1H, d, J=15.9 Hz, H{ {67}}) et un cycle benzénique monosubstitué à kH 7,29 (2H, m, H-3, 5), 7,21 (2H, m, H-2, 6) et 7,20 (1H, m, H-4) (tableau 2). Un groupe phénylméthyle, une sous-structure aglycone, a été suggéré par les corrélations HMBC entre H-7 (2H, kH 2,80, m) et C-1 (kC 138,8) et entre H-7 et C -2, 6 (kC 128,9) et les signaux COSY RMN de H-7 avec H-8a (1H, kH 3,99, m) et H-8b (1H, kH 3,63, m).

Deux fractions de sucre ont été réaffirmées par l'analyse HPLC de l'hydrolysat acide et l'analyse des spectres RMN. Les configurations absolues des sucres ont été élucidées en utilisant l'analyse HPLC de l'hydrolysat acide, qui a été confirmé comme étant du D-glucose et du L-rhamnose [17]. Une fraction -glucose et une fraction -rhamnose ont été établies en couplant les constantes des protons anomères. Le spectre 1H-1H COSY a montré des corrélations séquentielles de H-13 à H-53, de H-133 à H-233 et de H{{11} } à H-333 (Figure 4).

À partir du spectre HMBC, les corrélations entre H{{0}} et C-8 (kC 69,4), entre H-23 et le carbone carbonyle d'un groupe acétyle (kC 169,1), entre H-33 (kH 3,95) et C-133 (kC 102,0) et entre H-43 (kH 4,81) et C-9333 (kC 165,6) ont confirmé la position des substituants dans la structure. Par conséquent, la structure de 18 a été déterminée comme étant le phényléthyl-2-O-acétyl-OaL-rhamnopyranosyl-(1→3)-4-O-(E)-caffeoyl- -D-glucopyranoside et nommé cistansalside E.

La plupart des substituants trans-cinnamoyle ont été isomérisés en isoforme cis in vitro. Il a été rapporté que la lumière convertit les dérivés de l'acide trans-cinnamique en cis-isoformes [18,19]. L'équilibre de la conversion trans-cis des substituants cinnamoyle a été observé pour maintenir environ 70 pour cent des isolats dans l'isoforme trans. Pour les protons d'oléfine de la forme cis, culmine à environ 6,90 ppm (d, J=12~13 Hz, H-7333) et 5,80 ppm (d, J=12~13 Hz, H-8333) étaient assignables dans les spectres 1H-RMN, tandis que les pics à environ 7,55 ppm (d, J=15.8 Hz, H-7333) et 6,40 ppm (d, J { {28}}.8 Hz, H-8333) ont été observés pour la transformée [20]. Dans le spectre 1H-RMN des mélanges trans-cis, des pics pour deux protons oléfiniques (H-7333 et H-8333) ont été observés dans le rapport de 7:3 (trans:cis). Les pics 13C-RMN de la forme cis étaient similaires à ceux de la transformée.

Ingrédients efficaces du cistanche : les actéosides

Tous les isolats ont été testés pour leurs effets inhibiteurs sur la production de NO induite par LPS dans RAW

Tous les isolats ont été testés pour leurs effets inhibiteurs sur la production de NO induite par le LPS dans les cellules RAW 264.7. La dexaméthasone a été utilisée comme contrôle positif et son IC50 était de 7,0 uM. Parmi les composés testés, les composés 5 (IC50 42.7 o 6.6 uM), 11 (IC50 37.3 o 2.2 uM), 13 (IC50 40.{{2{{ 24}}}} o 4.0 uM) et 18(IC50 27.9 o 0.8 uM) ont montré des activités inhibitrices modérées sur la NO synthase inductible, tandis que les autres composés étaient inactifs dans ce test (IC50 valeurs > 100 µM). Pour vérifier si ces composés avaient une cytotoxicité, la viabilité cellulaire a été mesurée en utilisant le test MTT. En conséquence, aucun d'entre eux n'a présenté de cytotoxicité significative (Figure supplémentaire S6-1). Ces quatre composés ont été sélectionnés pour évaluer leur activité inhibitrice contre la voie NF-λB ​​dans les cellules RAW 264.7 stimulées par le LPS. La stimulation des cellules RAW 264.7 avec du LPS a induit la phosphorylation de I入B et NF-入B (p65) après 0,5 h d'incubation. La phosphorylation de NF-A B (p65) a été significativement réduite par un prétraitement avec les composés 11, 13 et 18, comme le montre l'analyse Western blot (figure 5). Par conséquent, les composés 11, 13 et 18 pourraient exercer des effets anti-inflammatoires via l'inhibition de NF-入B dans les macrophages.

Figure 5.Effet de quatre composés sur la phosphorylation de I入B et NF-入B (p65) dans des cellules RAW 264.7 stimulées par LPS. (A) Les Western blots ont été réalisés dans du LPS et des cellules RAW 264.7 traitées avec des échantillons ; (B, C) Les signaux d'immunoblot ont été quantifiés à l'aide du logiciel de densitométrie Molecular Analyst/PC (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). L'analyse densitométrique des isoformes phosphorylées est rapportée. NF- 入 B dans la cellule RAW 264.7 a été normalisé au contenu de -actine.

3. Matériaux et Méthodes

3.1. Expérience générale Procédure

Les rotations optiques ont été mesurées avec un polarimètre numérique Jasco P-2000 (Jasco, Tokyo, Japon). Les spectres UV ont été enregistrés sur un spectromètre Chirascan plus dichroïsme circulaire (Chirascan, APL, Royaume-Uni). Les spectres IR ont été enregistrés à l'aide du spectrophotomètre Jasco FT/IR-4200. La spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire à ionisation par électrospray haute résolution (HR-ESI-qTOF-MS) a été réalisée sur un Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS équipé de la série Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc. , Palo Alto, CA, USA), et la colonne utilisée était une colonne Jasco SFCpak Crest C18T-5 (id 150 4.6 mm, 5 um). Le logiciel MassHunter Workstation a été utilisé pour l'acquisition des données.

Les spectres RMN 1D (1H et 13C) et 2D (1H-1H COSY, HSQC, HMBC, NOESY) ont été obtenus avec un Jeol LA 300 (Jeol, Tokyo, Japon), Bruker AVANCE-400, Bruker Spectromètres AVANCE-500, Bruker AVANCE-600 et Bruker AVANCE 800 HD couplés à une cryosonde (Bruker, Ettlingen, Allemagne). Le DMSO-d6 (Cambridge Isotope Laboratories, In Cistanche Andover, MA, USA) a été utilisé comme solvant RMN et pics de référence (kH 2,50 et kC 39,5). La chromatographie sur colonne (CC) a été réalisée à l'aide de Sephadex LH -20 (25–100 um; Pharmacia, Uppsala, Suède) ou de gel de silice Kieselgel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385; Merck, Darmstadt , Allemagne). La chromatographie en couche mince (CCM) a été réalisée sur des plaques de gel de silice F254 pré-enduites de Kieselgel 60 (Art. 5715; Merck). Les taches sur TLC ont été détectées à l'aide d'une lampe UV à 254 nm et 365 nm (VL-4.LC, 365/254 ; Vilber Lourmat, Torcy, France). La chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) a été réalisée sur une colonne flash de silice RediSep 120 g (Isco, Lincoln, NE, USA) et du gel de silice Kiesegel 60 (40–63 um, 230–400 mesh, Art. 9385 ; Merck) à l'aide d'un Compagnon Combiflash (Isco). Le système de chromatographie liquide à haute pression (HPLC) était un HPLC Gilson équipé d'une pompe Gilson 321 et d'un détecteur UV.VIS 151 (Gilson, Middleton, WI, USA), utilisant des colonnes ODS semi-préparatives (Luna 5 um C18 (2) 100 Å, id 250 : 10 mm, 5 um, Phenomenex Inc., Torrance, CA, USA ; Hypersil GOLD™ aQ 175 Å, id 250 : 10 mm, 5 um, Thermo Scientific™, Hennigsdorf, Allemagne ; Colonne Inno C18 120 Å, id 250 : 10 mm, 5 um, Young Jin Biochrom Co., Ltd., Seongnam, Corée). Le système analytique RP-HPLC était un système d'alliance Waters 2695 avec un détecteur à réseau de photodiodes (PDA) 996 (Waters Corp, Milford, MA, USA), et la colonne utilisée était une colonne Hypersil™ BDS C18 (130 Å, id 150 : 4,6 mm, 5 um, Thermo Scientific™). L'acide formique a été acheté auprès de Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd. (Séoul, Corée). Les solvants de qualité HPLC ont été achetés auprès de Fisher Scientific Korea Ltd. (Séoul, Corée). H2SO4, Na2CO3 et des solvants de première qualité pour l'extraction, le fractionnement et l'isolement ont été achetés auprès de Daejung Chemical & Metals Co. Ltd. (Séoul, Corée). Le chlorhydrate d'ester méthylique de L- et D-cystéine et l'isothiocyanate d'o-tolyle ont été achetés auprès de Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japon).

3.2. Plante Matériel

Les plantes entières deSalsa Cistanche, qui ont été collectés auprès du Shinjang Uyghur, ont été importés par Daerim Pharmaceutical Wholesale Company (Cheongju, Corée). Ils ont été identifiés par le Prof. Dr. Jehyun Lee (Université Dongguk, Séoul, Corée). Le spécimen de référence (SNUPH2016-03) a été déposé à l'herbier du jardin des plantes médicinales, faculté de pharmacie de l'université nationale de Séoul.

3.3. Extraction et Isolation

Les plantes entières séchées deSalsa Cistanche(5,7 kg) ont été hachés et extraits trois fois avec MeOH (20 L) à température ambiante avec sonication pendant 99 min. Après élimination du solvant sous vide, l'extrait brut (1,35 kg) a été mis en suspension dans H2O (5 L), puis partagé avec EtOAc (5 L). Le résidu EtOAc (55,3 g) a été séparé en 16 fractions (E01-16) par chromatographie sur gel de silice en éluant avec CHCl3/MeOH (50:1–0:1, système de gradient par étapes).

E08 (611,7 mg) a été soumis à une chromatographie liquide à moyenne pression sur gel de silice (25 g) et élue avec CHCl3/MeOH (18 : 1–0 : 1, système de gradient par étapes) et a donné 11 fractions (E08a-k). A partir de E08g, les composés 13 (0,7 mg) et 18 (0,6 mg) ont été purifiés en utilisant une colonne HPLC Luna 5 um et une élution isocratique avec une solution aqueuse à 28 pour cent. MeCN. La purification par HPLC (Hypersil GOLD, MeCN aqueux à 25 pour cent) de E08h (138,5 mg) a fourni les composés 7 (10,6 mg), 8 (17,2 mg), 14 (13,4 mg) et 17 (4,9 mg).

E09 (1,15 g) a ensuite été purifié sur une colonne de silice-MPLC (20 g) en éluant avec CHCl3/MeOH (10 : 1–0 : 1, étape- système de gradient) pour donner 11 sous-fractions (E09a-k). E09e (398,7 mg) a été soumis à Sephadex LH-20 (MeOH) et a donné huit sous-fractions (E09e1-8). E09e6 a ensuite été purifié en utilisant une colonne HPLC Hypersil GOLD (MeCN aqueux à 22 pour cent) pour donner le composé 11 (0,4 mg). A partir de E09e7, le composé 5 (0,6 mg) a été purifié par élution isocratique à partir d'une colonne HPLC Luna 5 um avec 40 % de solution aqueuse. MeOH.

E10 (1,20 g) a été séparé en neuf fractions (E10ai) sur une colonne Sephadex LH-20 en éluant avec MeOH. À partir de E10g (147,5 mg), les composés 4 (13,4 mg), 9 (8,0 mg) et 15 (5,0 mg) ont été isolés par séparation HPLC (Inno, 23 % aq. MeCN). La fraction ElOh (470,0 mg) a été purifiée sur une colonne Hypersil GOLD par élution isocratique (MeOH aqueux à 40 %) pour donner les composés 1 (3,8 mg), 10 (42,1 mg) et 16 (3,0 mg).

E11 (2,96 g) a été soumis à Sephadex LH -20 en éluant avec MeOH pour donner neuf fractions (E11a-i). E11e a été séparé par une cartouche Sep-Pak C18 en éluant par étapes avec 10 %, 20 %, 30 %, 50 % et 100 % aq. MeOH pour donner sept fractions (E11e 1-7), suivies de Luna 5 um HPLC (28 % aq. MeCN) pour donner les composés 3 (3,4 mg), 6 (1,4 mg) et 12 (1,2 mg).

E12 (19.0 g) a été soumis à une MPLC de silice (120 g) à l'aide d'un système de gradient par étapes CHCl3/MeOH pour donner six fractions (18:1–0:1 , E12a-f). E12f a été chromatographié sur une colonne Sephadex LH-20 (MeOH), donnant sept fractions (E12f1-7). La purification HPLC (Hypersil GOLD, MeCN aqueux à 25 pour cent) de E12f7 a fourni le composé 2 (3,3 mg). Tous les solvants utilisés pour HPLC étaient un tampon d'acide formique à 0,05 %. Le débit commun pour la chromatographie HPLC et MPLC était de 3 et 40 ml/min, respectivement.

3.4.Caractérisation

Cistansalside A (5) : poudre brune amorphe ; [ |20 x33,7 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 332 (3,18); IR (pur) vmax 3359, 1748, 1705, 1602, 1516 cmx1; Données 1H-NMR (800 MHz) et 13C-NMR (200 MHz), voir tableau 2 ; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 645,2146 (calculé pour C30H38O14Na, 645,2154).

Cistansalside B (6) : poudre brune amorphe ; [ |20 x72,9 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 333 (3,32); IR (pur) vmax 3400, 1705, 1603, 1516 cmx1 ; Données 1H-NMR (500 MHz) et 13C-NMR (125 MHz), voir tableau 2 ; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 579,2054 (calculé pour C26H36O13Na, 579,2048).

Cistansalside C (12) : poudre brune amorphe ; [ |20 x61,6 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 337 (3,25); IR (pur) vmax 3359, 1704, 1602, 1508 cmx1; Données 1H-NMR (800 MHz) et 13C-NMR (200 MHz), voir tableau 2 ; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 581,2213 (calculé pour C26H38O13Na, 581,2205).

Cistansalside D (17) : poudre brune amorphe ; [ |20 x51,1 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 221 (3,53), 315 (3,52); IR (pur) vmax 3358, 1746, 1722, 1603, 1516, 1232, 1157, 1039 cmx1; Données 1H-NMR (400 MHz) et 13C-NMR (75 MHz), voir tableau 2 ; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2147 (calculé pour C31H38O14Na, 657,2154).

Cistansalside E (18) : poudre brune amorphe ; [ |20 x59,2 (c 0,1, MeOH); UV(MeOH) Amax nm (log e) 336 (3,22); IR (pur) vmax 3370, 1741, 1712, 1602, 1231, 1157 cmx1; Données 1H-NMR (800 MHz) et 13C-NMR (200 MHz), voir tableau 2 ; HRMS (ESI-TOF) m/z [M plus Na] plus 657,2166 (calculé pour C31H38O14Na, 657,2154)

3.5.HPLC-QTOF-MS Une analyse

L'analyse chromatographique-spectrométrie de masse a été réalisée sur un système LC série Agilent 1260 Infinity (Agilent Technologies, Inc., États-Unis). La colonne analytique était une colonne SFCpak Crest C18T-5 (id 15{{10}} : 4,6 mm, 5 um, Jasco, Japon). La phase mobile consistait en 0.1 % (v/v) d'acide formique dans du MeCN (A) et de l'eau (B) en utilisant un gradient d'élution de 0 à 35 min (23 % A), 35 à 45 min ( 23–28 % A), 45–75 min (28 % A) et 75–80 min (90 % A). Le débit a été maintenu à 0,3 mL/min. L'absorbance a été mesurée à 320 nm. Les conditions de la source ESI étaient les suivantes : débit de gaz de séchage (N2), 10 L/min ; température du gaz de séchage, 350 degrés ; nébuliseur, 30 psig ; débit de gaz gaine, 12,0 L/min ; température du gaz gaine, 350 degrés ; capillaire, 4000 V; écumoire, 60 V; RF octapolaire, 750 V ; tension du fragmenteur, 180 V ; mode positif. Le système fonctionnait sous le logiciel de station de travail Masshunter. La plage de masse a été fixée à m/z 50–1000.

3.6.Acide Hydrolyse

Les composés ont été hydrolysés à l'aide de 1 N H2SO4 (100 uL) chauffé avec un bain-marie à 90 degré pendant 2 h, puis neutralisés avec une solution aqueuse saturée de Na2CO3. Après séchage des solutions sous un courant de N2, les produits et les sucres standards (D-Glc, L-Glc, L-Rha) ont été dissous dans de la pyridine (100 µL) contenant du chlorhydrate d'ester méthylique de L-cystéine (0,5 mg). Un échantillon de L-rhamnose a été dissous dans de la pyridine (100 ul) contenant du chlorhydrate d'ester méthylique de D-cystéine (0,5 mg). Après cela, ils ont été chauffés à 60 degrés pendant 1 h. Les solutions ont été traitées avec 1 ul (1,11 mg) d'o-tolylisothiocyanate, qui ont été à nouveau chauffées à 60 degrés pendant 1 h. Chaque mélange final a été directement analysé par RP-HPLC analytique (colonne Hypersil™ BDS C18, MeCN aqueux à 17 %, 0,8 ml/min, 40 min, 35 degrés). Le tR du pic à 21,9 et 40,4 min a coïncidé avec celui du dérivé thiocarbamoyl thiazolidine du D-glucose et du L-rhamnose, respectivement.

3.7. Cellule Culture

Les macrophages murins, RAW 264.7, ont été obtenus auprès du Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology (Daejeon, Corée) et cultivés dans un milieu RPMI contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 100 U/mL de pénicilline/sulfate de streptomycine. Les cellules ont été incubées dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C.

3.8.Drogues et produits chimiques

Le RPMI, la pénicilline et la streptomycine ont été achetés chez HyClone (Logan, UT, USA). L'albumine de sérum bovin et le LPS ont été achetés chez Sigma (St. Louis, MO, USA).

3.9.Mesure de la production de NO

La concentration en nitrite dans le milieu de culture a été mesurée comme indicateur de la production de NO selon la réaction de Griess. Les cellules ont été ensemencées à 2 : 105 cellules/puits dans des 96-plaques de culture à puits. Après pré-incubation des cellules RAW 264.7 pendant 18 h, les cellules ont été prétraitées avec des composés (50 uM, 10 uM, 5 uM ou 1 uM) et stimulées avec du LPS (500 ng/mL) pendant 24 h. Composés d'essai dissous dans du DMSO. Les cellules ont également été traitées avec du DMSO à 0,05 % comme véhicule témoin. Les cellules RAW 264.7 (2 : 105 cellules/puits) ont été cultivées dans des plaques à puits 96- en utilisant du RPMI sans rouge de phénol et prétraitées avec des échantillons pendant 0,5 h. La production de NO cellulaire a été induite par l'ajout de 500 ng/mL de concentration finale de LPS et une incubation de 24 h. Après incubation, 100 ul de milieu conditionné ont été mélangés avec le même volume de réactif de Griess et incubés pendant 15 min. L'absorbance du mélange à 540 nm a été mesurée avec un lecteur de microplaques ELISA (Benchmark, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Les valeurs obtenues ont été comparées à celles des concentrations standard de nitrite de sodium dissous dans du RPMI, et les concentrations de nitrite dans le milieu conditionné des cellules traitées avec l'échantillon ont été calculées.

3.10.3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Test de bromure de diphényltétrazolium (MTT) pour la viabilité cellulaire

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques {{0}}puits à une densité de 5 : 104 cellules/puits et incubées avec un milieu sans sérum en présence d'échantillons. Composés d'essai dissous dans du DMSO. Les cellules ont également été traitées avec du DMSO à 0,05 % comme véhicule témoin. Après incubation pendant 24 h, 10 uL de MTT (5 mg/mL dans une solution saline) ont été ajoutés et l'incubation a été poursuivie pendant 4 h supplémentaires. La succinate déshydrogénase mitochondriale dans les cellules vivantes convertit le MTT en cristaux de formazan visibles pendant l'incubation. Les cristaux de formazan ont ensuite été solubilisés dans du diméthylsulfoxyde et l'absorbance a été mesurée à 540 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) (Benchmark, Bio-Rad Laboratories). La viabilité cellulaire relative a été calculée par rapport à l'absorbance du groupe témoin non traité. Toutes les expériences ont été réalisées en triple.

3.11.Analyse d'immunoblot

L'expression des protéines a été évaluée par western blot selon les procédures standard. Brièvement, les cellules RAW264.7 ont été cultivées dans des boîtes de culture de 6{{20}} mm (2 : 106/mL), suivies d'un prétraitement de 50 uM de composés . Les cellules ont été lavées deux fois dans du PBS glacé (pH 7,4), les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un tampon de lyse sur de la glace pendant 15 min, puis les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation. La concentration en protéines a été déterminée à l'aide du réactif de dosage des protéines Bio-Rad conformément aux instructions du fabricant. La protéine (20 à 30 ug) a été mélangée 1: 1 avec 2 : tampon d'échantillon (20 % de glycérol, 4 % de SDS, 10 % 2- ME, bleu de bromophénol à 0,05 % et Tris 1,25 M [pH 6,8]), chargé sur des gels SDS-PAGE à 8 ou 15 % et exécuté à 150 V pendant 90 min. Les protéines cellulaires ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène Immunoblot (Bio-Rad) en utilisant un système de transfert semi-sec Bio-Rad conformément aux instructions du fabricant. Les membranes ont ensuite été incubées pendant une nuit avec les anticorps primaires respectifs p-NF-入B, NF-入B, pI入B et -actine (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 5 % de lait écrémé et 0,1 % de Tween. 20. Le lendemain, les transferts ont été lavés trois fois avec une solution saline tamponnée au Tris (0,1 % de Tween 20) et incubés pendant 1 h avec un anticorps secondaire anti-IgG conjugué à la HRP (dilué 1 :2000–1 :20 000). Les transferts ont été lavés à nouveau trois fois avec une solution saline tamponnée au Tris (0, 1% de Tween 20) et des bandes immunoréactives ont été développées à l'aide du substrat chimioluminescent ECL Plus (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).

3.12.Analyse statistique

Les données expérimentales sont présentées comme la moyenne de SEM. Le niveau de signification statistique a été déterminé par analyse de variance (ANOVA) suivie du test t de Dunnett pour les comparaisons multiples.p Les valeurs inférieures à 0.05 ont été considérées comme significatives.

Extrait de salsa Cistanche

4. conclusion

Dans cette étude, nous avons isolé et élucidé les structures de cinq nouveaux glycosides substitués par des phénylpropanoïdes, nommés cistansalside AE ​​(5, 6, 12, 17 et 18), en plus d'isoler et d'identifier 13 composés connus, en utilisant une stratégie de déréplication. Les composés connus ont été déterminés comme étant le lipédoside AI (1) [21], le 23-acétylactéoside (2) [22], l'isocistanoside C (3) [15], l'osmanthuside B (4) [21], l'épiméridinoside A ( 7) [15], cistanoside D (8) [23], salsaside B (9) [6], tubuloside E (10) [16], cistanoside M (11) [15], isomartynoside (13) [24], salsaside C (14) [6], jionoside C (15) [25] et salsaside F (16) [6]. Leurs structures ont été établies par l'analyse de nombreuses données spectroscopiques et par comparaison avec les données rapportées dans la littérature. Il a été confirmé que les structures provisoirement prédites des glycosides substitués par des phénylpropanoïdes correspondaient correctement à leurs structures réelles.

Bénéfice de l'extrait de salsa Cistanche

Références

1. Shimamura, H. ; Miyazawa, M.; Enomoto, K.; Nakamura, S.-I. ; Kameoka, H. Suppression de l'activité d'induction de SOS du Trp-P-1 par les acides gras de la salsa de Cistanche dans le test Salmonella Typhimurium TA1535/pSK1002 umu. Nat. Prod. Lett. 1997, 10, 261–265. [Référence croisée]

2. Jeon, E.; Chung, K.-S.; An, H.-J. Effets anti-prolifération de la salsa Cistanches sur la progression de l'hyperplasie bénigne de la prostate. Boîte. J. Physiol. Pharmacol. 2016, 94, 104-111. [Référence croisée] [PubMed]

3.Xu, C. ; Jia, X.; Xu, R.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Sun, S. Discrimination rapide des Herba Cistanches par macro-empreinte digitale infrarouge en plusieurs étapes combinée à une modélisation indépendante douce de l'analogie de classe (SIMCA). Spectrochim. Acta Partie A Mol. Biomol. SpectrosCistanche2013, 114, 421–431. [Référence croisée] [PubMed]

4. Jiang, Y. ; Li, SP; Wang, YT ; Chen, XJ; Tu, PF Différenciation des Herba Cistanches par empreintes digitales avec chromatographie liquide haute performance-diode détection-spectrométrie de masse. J. Chromatogr. 2009, 1216, 2156-2162. [Référence croisée] [PubMed]

5. Kobayashi, H. ; Karasawa, H.; Miyase, T.; Fukushima, S. Études sur les constituants de Cistanchis Herba. V. Isolement et structures de deux nouveaux glycosides phénylpropanoïdes, les cistanosides E et F. Chem. Pharm. Taureau. 1985, 33, 1452–1457. [Référence croisée]

6. Lei, L. ; Jiang, Y.; Liu, X.-M.; Tu, P.-F. ; Wu, L.-J.; Chen, F.-K. Nouveaux glycosides de salsa Cistanche. Helv. Chim. Acta 2007, 90, 79–85. [Référence croisée]

7. Kartbaeva, EB ; Sakipova, ZB; Ibragimova, LN; Kapsalyamova, EN; Ternynko, II Étude de la composition des composés phénoliques de la salsa Cistanche (CA Mey) G. Beck, poussant dans la République du Kazakhstan. J. Chem. Pharm. Rés. 2015, 7, 120–122.

8. Liu, J.-Y. ; Guo, Z.-G. ; Zeng, Z.-L. Amélioration de l'accumulation de glycosides phényléthanoïdes par l'alimentation en précurseur de la culture en suspension de la salsa Cistanche. Biochimie. Ing. J. 2007, 33, 88–93. [Référence croisée]

9. Maruyama, S. ; Akasaka, T.; Yamada, K.; Tachibana, l'extrait de salsa H. Cistanche agit de la même manière que les protéines liées

polysaccharide-K (PSK) sur divers types de lignées cellulaires. J. Tradition. Méd. 2008, 25, 166-169.

10. Tian, ​​X.-F. ; Pu, X.-P. Les glycosides phényléthanoïdes de la salsa de Cistanches inhibent l'apoptose induite par l'ion 1-méthyl-4-phénylpyridinium dans les neurones. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 59–63. [Référence croisée] [PubMed]

11.Michel, T. ; Halabalaki, M.; Skaltsounis, AL Nouveaux concepts, approches expérimentales et stratégies de déréplication pour la découverte de nouveaux phytoestrogènes à partir de sources naturelles. Planta Med. 2013, 79, 514-532. [Référence croisée] [PubMed]

12. De Medeiros, LS ; Abreu, LM; Nielsen, A.; Ingmar, H.; Larsen, TO ; Nielsen, KF; Rodrigues-Filho, E. Isolement guidé par la déréplication des depsides théaflavines ST et lecanora DF du champignon endophyte Setophoma sp. Phytochimie 2015, 111, 154–162. [Référence croisée] [PubMed]

13.Rakotondraibe, LH ; Rasolomampianina, R.; Park, H.-Y. ; Li, J.; Slebodnik, C.; Brodie, PJ; Blasiak, LC; Colline, R. ; TenDyke, K.; Shen, Y.; et coll. Composés antiprolifératifs et antiplasmodiaux d'espèces Streptomyces sélectionnées. Bioorg. Méd. Chim. Lett. 2015, 25, 5646–5649. [Référence croisée] [PubMed]

14.Jiang, Y. ; Liu, F.-J.; Wang, Y.-M.; Li, H.-J. Isolement guidé par la déréplication de nouvelles saponines triterpénoïdes hépatoprotectrices de Celosiae Semen par chromatographie liquide à haute performance couplée à une spectrométrie de masse quadripolaire à temps de vol en tandem à ionisation par électrospray. J.Pharm. Biomédical. Anal. 2017, 132, 148–155. [Référence croisée] [PubMed]

15.Zhang, J. ; Li, C.; Che, Y.; Wu, J.; Wang, Z.; Cai, W.; Li, Y.; Ma, Z.; Tu, P. Stratégie basée sur LTQ-Orbitrap pour la médecine traditionnelle chinoise ciblée sur la découverte de classe, l'identification et la recherche heromique: une étude de cas sur les glycosides phényléthanoïdes chez trois espèces différentes d'Herba Cistanches. RSC Adv. 2015, 5, 80816–80828. [Référence croisée]

16. Yoshizawa, F. ; Deyama, T.; Takizawa, N.; Usmanghani, K.; Ahmad, M. Les constituants de Cistanche tubulosa (Schrenk) Hook. F. II. Isolement et structures d'un nouveau glycoside phényléthanoïde et d'un nouveau glycoside de néolignan. Chim. Pharm. Taureau. 1990, 38, 1927-1930. [Référence croisée]

17. Tanaka, T. ; Nakashima, T. ; Ueda, T.; Tomii, K.; Kouno, I. Discrimination facile des énantiomères d'aldose par HPLC en phase inverseistancheChem. Pharm. Taureau. 2007, 55, 899–901. [Référence croisée] [PubMed]

18. Wong, WS ; Guo, D.; Wang, XL; Yin, ZQ; Xia, B.; Li, N. Etude de l'acide cis-cinnamique chez Arabidopsis thaliana. Physique Végétale. Biochimie. 2005, 43, 929-937. [Référence croisée] [PubMed]

19.Kahnt, G. Trans-Cis-Equilibrium des acides hydroxycinnamiques lors de l'irradiation de solutions aqueuses à différents pH. Phytochimie 1967, 6, 755–758. [Référence croisée]