PARTIE Ⅰ : Effets des conditions environnementales sur le nombre de néphrons
Mar 20, 2022
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PARTIE Ⅰ : Effets des conditions environnementales sur le nombre de néphrons : modélisation des maladies maternelles et régulation épigénétique dans le développement rénal
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse & et al.
1. Introduction
Le développement fœtal est affecté par l'environnement in utero, et un milieu défavorable peut prédisposer à des maladies telles que l'hypertension, les maladies cardiovasculaires et les maladies rénales chroniques plus tard dans la vie [1-4]. Une gamme de perturbations intra-utérines peut entraîner une réduction de la dotation en néphrons et une altération de la fonction rénale chez la progéniture. Chez les rongeurs, les conditions conduisant à une réduction du nombre de néphrons à la naissance comprennent le retard de croissance intra-utérin (RCIU), le régime maternel pauvre en protéines, les médicaments (y compris les corticostéroïdes ou les anti-inflammatoires non stéroïdiens), les mutations monogénétiques et les faibles niveaux de vitamine A, ainsi que le diabète maternel. et carence en fer [5-10]. Chez l'homme, il n'existe actuellement aucune méthode non invasive de mesure du nombre de néphrons. Cependant, des études postmortelles ont démontré une corrélation négative entre le nombre de néphrons et la pression artérielle [4,11]. De plus, les affections intra-utérines associées à un nombre réduit de néphrons, telles que l'IUGR, sont connues pour être associées à des taux accrus d'hypertension et d'IRC [12].
Des expériences in vivo où des conditions intra-utérines défavorables sont artificiellement induites chez des animaux gravides se sont révélées inestimables pour la détection et la description des altérations rénales induites chez la progéniture. Cependant, toute intervention expérimentale pendant la gestation entraîne des altérations complexes de la physiologie maternelle, placentaire et fœtale qui peuvent elles-mêmes affecter l'environnement des métanéphros en développement. Les techniques de modélisation ex vivo contournent cela en permettant l'étude du développement des reins complètement séparé de l'influence de l'animal mère, du placenta ou d'autres organes du fœtus. Des cultures isolées de métanephroi sur une interface milieu-air ont été initialement réalisées par Trowell en 1950 [13] et ont ensuite été raffinées en cultivant des reins sur des membranes filtrantes [14], fournissant une base pour des conditions de culture à variable unique.
En résumé, il existe un nombre croissant de preuves suggérant que les insultes prénatales associées à un faible nombre de néphrons sont pertinentes pour les facteurs de risque d'hypertension et d'IRC. Afin de développer des stratégies préventives pour assurer une dotation adéquate en néphrons à la naissance, une compréhension mécaniste des facteurs influençant le développement rénal et la néphrogénèse est nécessaire. Dans le présent travail, la culture d'organes métanéphriques a été utilisée pour modéliser différents aspects de la régulation environnementale afin d'étudier leurs effets sur la croissance rénale et les implications possibles pour la fonction rénale à long terme et utilisée pour dépister les régulateurs épigénétiques à l'aide de petits composés approuvés par la FDA.
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2. Résultats
2.1. Utilisation de cultures d'organes métanéphriques pour étudier l'effet des conditions environnementales sur le développement rénal
Pour modéliser des conditions environnementales défavorables, les reins des embryons du jour embryonnaire (E) 12,5 ont été cultivés à l'interface air-moyen (figure 1A). Pour faciliter la surveillance du développement des néphrons et des glomérules, Six2. Cre et Pod. Des souris rapporteurs à double fluorescence Cre ont été utilisées, respectivement (figure 1B, C). Une affection courante pendant la grossesse est la fièvre, qui affecte plus de 10 % des grossesses au cours des 16 premières semaines de gestation [15]La chaleur est un tératogène bien caractérisé, et il a été démontré que l'hyperthermie pendant la grossesse entraîne un avortement fœtal, un retard de croissance, et des anomalies du développement, telles que l'agénésie rénale, l'hypoplasie et le faible poids à la naissance chez plusieurs espèces [16-21]. Pour évaluer l'impact des conditions hyperthermiques prolongées dans la plage de fièvre sur la croissance rénale et la formation de néphrons, les reins ont été isolés et maintenus à 37 ou 40 degrés (figure 1D). Après 7 jours de culture, les reins cultivés à 40 °C étaient, en moyenne, 18,36 % plus petits que leurs homologues cultivés dans des conditions physiologiques (figure 1E). Cependant, aucune différence significative dans le nombre de glomérules par rein n'a été trouvée entre les groupes (figure 1F). Néanmoins, la diminution de la croissance globale des reins démontre un effet négatif de l'augmentation de la température sur la croissance métanéphrique.
Avec environ 19 % des femmes enceintes souffrant d'anémie ferriprive [22], la carence en fer est l'une des affections les plus répandues, susceptible de perturber le développement rénal [23]. Des données in vivo ont montré que la croissance rénale, le nombre de glomérules et l'absorption rénale de fer sont réduits pendant les grossesses affectées par une carence en fer de la mère [24]. Afin d'évaluer l'impact d'un apport réduit en fer lié à la transferrine sur la croissance rénale et la néphrogenèse, des explants ont été cultivés dans un milieu contenant 50 ug/mL d'holo-transferrine saturée en fer ou 50 ug/mL d'apo-transferrine appauvrie en fer, respectivement. Les reins restreints en fer sont restés beaucoup plus petits que leurs homologues suffisants en fer et ont montré une apoptose accrue dans les bourgeons urétéraux et une ramification et une prolifération réduites des bourgeons urétéraux (Figure 1G, Figure supplémentaire S1A-F). Alors que la population de néphrons n'était pas affectée morphologiquement, une diminution de la partie distale en développement du néphron, ainsi que des tubules distaux, a pu être observée (Figure 1H, I, Figure supplémentaire S1G-J). Les reins carencés en fer représentaient en moyenne 47,9 % de la taille de leurs homologues cultivés en holo-transferrine (Figure 1) et présentaient une réduction du nombre total de glomérules par rein de 69,9 % après 7 jours de culture (Figure 1K) . Ainsi, la déplétion en fer par l'apo-transferrine a montré des effets graves sur la croissance rénale avec un phénotype de néphrogénèse tout proximal.
Figure 1. Utilisation de cultures d'organes métanéphriques pour étudier l'effet des conditions environnementales sur le développement rénal.(A) La crête urogénitale des embryons de souris E12.5 (panneau de gauche) a été extraite par microchirurgie (deuxième panneau) et les reins ont été isolés (troisième panneau) et placés sur des inserts Transwell (panneau de droite). Barres d'échelle∶ 1 mm (panneau de gauche), 500 μm (troisième panneau). (B) Des souris transgéniques avec une double expression tomate/EGFP ont été utilisées pour le marquage conditionnel de cellules positives Six 2- et de leur progéniture à l'aide de Six2. Cellules positives à la podocine Cre ou (C) utilisant Pod. Souris Cre. (D) Des explants du même embryon ont été cultivés pendant 7 jours à 37 ou 40 degrés. Barres d'échelle∶ 500 μm. （E） Surfaces des explants cultivés pendant 7 jours à 37 ou 40 degrés .n=40 paires, test t apparié, moyenne ± SD.(F) Le nombre de glomérules dans les groupes d'explants après 7 jours.n{{ 17}} paires, test t apparié, moyenne ± SD. （G） Des explants du même embryon ont été cultivés pendant 7 jours dans un milieu contenant de l'holo-Tf ou de l'apo-Tf. Barres d'échelle∶ 500 μm. (H) Les images à champ large de la paire d'explants cultivés holo-Tf et apo-Tf colorées contre SIX2 et E-cadhérine après 48 h de culture montrent un pool de cellules progénitrices normales et des défauts dans la morphologie précoce du néphron. Barre d'échelle∶100 μm.（I） Images à champ large de la paire d'explants cultivés holo-Tf et apo-Tf colorées contre WT1 et JAG1. Barres d'échelle∶100 μm. （） Surfaces des explants cultivés holo-Tf et apo-Tf après 7 jours.n=30 paires, test t apparié, moyenne ± SD.(K) Nombre de glomérules dans les groupes d'explants après 7 jours.n =17 paires, test t apparié, moyenne ± ET.
2.2. Une exposition élevée au glucose ex-vio entraîne des changements associés à la néphropathie diabétique dans le rein en développement
Le diabète maternel est une autre affection courante pendant la grossesse, avec une prévalence mondiale de l'hyperglycémie pendant la grossesse d'environ 17 % et plus de 20 millions de naissances vivantes chaque année [25]. Il a été démontré que le diabète induit dans des modèles de souris et de rats conduit à une progéniture avec un nombre de néphrons inférieur [10, 26, 27]. La culture d'organes métanéphriques a déjà été utilisée pour étudier l'effet d'une glycémie élevée sur le développement rénal [27-29]. Auparavant, nous avons signalé une réduction de la taille, du nombre de néphrons et de la méthylation de l'ADN dans des conditions de glucose élevé de 55 mM [30]. Contrairement aux données publiées [28], aucun effet sur la taille de l'explant ou le nombre de glomérules n'a pu être observé dans nos échantillons lorsqu'ils étaient cultivés dans différents milieux de glucose de 30 mM par rapport aux conditions de contrôle de 5 mM après 7 jours (Figure supplémentaire S2A, B). De plus, aucune diminution de la méthylation de l'ADN à LINE -1 et aux principaux sites satellites n'a pu être détectée (Figure supplémentaire S2C, D). L'effet de 55 mM de glucose élevé sur le développement rénal après une culture de période de 7- jours a été analysé plus en détail, montrant une diminution du taux de croissance à partir du jour 3 en culture (figure 2A, B). Les colorations par immunofluorescence n'ont montré aucun défaut morphologique du pool de cellules progénitrices positives SIX 2- (figure 2C), mais ont montré une coloration réduite de la podocalyxine marqueur des podocytes (PODXL, figure 2D). Les glomérules se sont avérés contenir une matrice de sous-sol glomérulaire épaissie visible dans les colorations histologiques (figure 2E). Des découvertes similaires ont été faites en microscopie électronique, montrant une augmentation de l'épaisseur de la membrane basale glomérulaire (Figure 2F), l'un des premiers marqueurs de pré-diabète et de néphropathie diabétique (DN) [31,32], dans cinq reins sur six et aucun de sept reins témoins de même portée. Pour démêler davantage les changements dans le transcriptome, une analyse de l'expression génique différentielle (DGE) par paires de cultures rénales de trois portées a été réalisée, avec un rein de chaque embryon cultivé avec du glucose élevé et l'autre avec un milieu de contrôle et les reins regroupés pour analyse ( n=3).DGE a confirmé la régulation à la hausse des composants de la matrice extracellulaire en tant que principal processus biologique régulé à la hausse (tableau supplémentaire S1). Les gènes régulés à la baisse étaient principalement impliqués dans l'activation des cellules (immunitaires) et l'exocytose / sécrétion (tableau supplémentaire S1). L'ontologie du phénotype de mammifère a indiqué une morphologie anormale du cortex rénal et du corpuscule rénal en raison de gènes régulés à la baisse tels que Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb et Vegfa (tableau supplémentaire S1). L'expression rénale de plusieurs gènes, tels que Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa et Txnip, dont il a été démontré qu'ils étaient régulés à la hausse dans la néphropathie diabétique [33-36], s'est avérée augmentée dans des conditions hyperglycémiques. Pour comparer le profil d'expression génique de la culture rénale à haute teneur en glucose au DN humain, les données DGE ont été appariées aux données humaines provenant de glomérules et de tubules microdisséqués provenant de biopsies de patients atteints de néphropathie diabétique de la Banque européenne d'ADNc rénal (ERCB). Parmi les 216 gènes régulés de manière différentielle appariés après analyse par lots, 94 gènes ont été régulés de manière correspondante de manière différentielle dans les fractions glomérulaires et/ou tubulaires (figure 2G). Le chevauchement de notre modèle et des gènes DN humains a montré 40 gènes sur 95 régulés positivement dans les glomérules et 34 gènes dans les tubules (25 gènes en commun) (figure 2H). Les gènes étaient principalement impliqués dans une organisation matricielle extracellulaire (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) et l'adhésion cellulaire (ITGBL1, CLDN15). De plus, les gènes associés au diabète tels que TXNIP, SPON2 et PAPPA ont été régulés positivement. Sur 120 gènes régulés à la baisse provenant des cultures rénales, 22 ont également été régulés à la baisse dans les glomérules et 39 ont également été régulés à la baisse dans les tubules (16 en com-mon (Figure 2I). Ces gènes ont été impliqués en réponse à un stimulus endogène (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), le développement de l'épithélium néphronique (PTPRO, PODXL, VEGFA) et la régulation positive de la chimiotaxie des cellules endothéliales (LGMN, P2RX4, VEGFA). De plus, les gènes associés au diabète tels que RASGRP3, SIRPA, GATM et ESM1 ont été régulés à la baisse [ 37-39]. Les gènes à régulation différentielle ne se chevauchant pas avec les données de l'ERCB reflétaient également des changements associés au diabète, tels que la matrice extracellulaire (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) ou le diabète gestationnel (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1) Ainsi, le développement rénal dans des conditions de glucose élevé présentait des similitudes remarquables avec la néphropathie diabétique humaine adulte.
Figure 2. Une exposition ex vivo à un taux élevé de glucose entraîne des modifications associées à la néphropathie diabétique dans le rein en développement.(A) reins embryonnaires de Pod.Cre ; Animaux tomate/EGFP cultivés pendant 7 jours dans des conditions de glucose faible (LG, 5,5 mM -D-glucose, 55 mM de mannitol) ou de glucose élevé (HG, 55 mM -D-glucose). Barre d'échelle : 500 um.(B) Surface rénale des conditions HG et LG.*,p=0.0474 ;*,p=0.0052 ;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. L'exposition ex vivo au glucose élevé influence la formation de la mémoire à long terme via la méthylation de l'ADN
Pour mieux comprendre les changements moléculaires induits par un environnement hyperglycémique, les cultures rénales ont été cultivées dans des conditions de glucose élevé pendant 3,5 jours, puis changées dans des conditions de glucose bas pendant la même durée (figure 3A). Remarquablement, l'incubation dans des conditions physiologiques après la période d'incubation plus courte dans un milieu à haute teneur en glucose n'a pas inversé la réduction de la croissance après 7 jours de culture, les cultures se développant au même rythme que sous un traitement continu à haute teneur en glucose (figure 3B). En outre, la méthylation de l'ADN a montré une hypométhylation de l'élément LINE -1 et des principaux locus satellites (Figure 2C, D), ainsi qu'une hyperméthylation soutenue de l'ADN du promoteur Ppargcla, dans des conditions à la fois élevées et inversées (Figure 3E), indiquant la formation de mémoire métabolique via la méthylation de l'ADN en raison des conditions environnementales défavorables antérieures comme moyen de programmation fœtale.
Figure 3. L'exposition ex vivo au glucose élevé influence la formation de la mémoire à long terme via la méthylation de l'ADN.(A) Imagerie des reins embryonnaires E12.5 du jour 0 au jour 7 dans un milieu à faible teneur en glucose (5,5 mM), à teneur élevée en glucose (55 mM) ou à teneur élevée en glucose pendant 3,5 jours et inversion en milieu à faible teneur en glucose pour les jours restants. Barre d'échelle : 500 um. (B) Surface rénale sur 7 jours. Moyenne ± SD. n=36 reins. LG, traitement hypoglycémiant ; HG, traitement hyperglycémique ; HG à LG, 3,5 jours de traitement avec une glycémie élevée et 3,5 jours avec une hypoglycémie.***,LG-HG (test t non apparié) :p=0.0004 ;**,LG-HG à LG (test t apparié ):p<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4.Ex Vivo Small Compound Screen identifie les régulateurs épigénétiques du développement rénal
Les résultats de ce travail ainsi que des travaux antérieurs suggèrent que les mécanismes épigénétiques jouent un rôle dans le développement du rein [30, A40-45]. Par conséquent, nous avons voulu évaluer systématiquement l'effet des modulateurs épigénétiques des différentes classes d'enzymes sur le développement rénal. Pour cela, nous avons sélectionné une bibliothèque de 22 petits composés approuvés par la FDA avec une activité inhibitrice démontrée [46-56] (Figure 4A). En utilisant des souris rapporteurs Six2.Cre pour évaluer le développement des néphrons, les structures rénales ont été cultivées pendant 3 jours avec les inhibiteurs dans le milieu. Augmentation de la taille au fil du temps par rapport aux organes de contrôle de la même portée, et la morphologie a été vérifiée pour les anomalies de développement (figure 4B). Il a été démontré que plusieurs inhibiteurs interfèrent avec le développement rénal ex vivo normal. L'entinostat, inhibiteur d'HDAC, un inhibiteur de la benzamide histone désacétylase avec une forte affinité pour HDAC1,2 et 3 [57], a montré une réduction constante de la croissance et un manque de différenciation et de prolifération après 3 jours (Figure 4C). HDAC 8 88 nM, 26- fois sélectif contre HDAC1, 28- fois sélectif contre HDAC6 [56]), a montré une inhibition de croissance tout aussi sévère par rapport aux organes témoins de même portée. De plus, les chélateurs du fer et les inhibiteurs du déférasirox et de la déféroxamine JmJC ont montré une réduction de la croissance analogue au milieu déficient en fer. De plus, la cyproheptadine, un inhibiteur de SET7/9 [58,59], a montré une réduction de la croissance et un manque de différenciation et de prolifération par rapport aux reins témoins (Figure 4D), mais a également semblé interférer avec la signalisation Wnt (Figure supplémentaire S3). Les autres inhibiteurs de HDAC, HAT, HDM et HMT et l'inhibiteur de DNMT 5- azacytidine n'ont pas montré de réduction de croissance ou d'anomalies de développement dans le laps de temps mesuré (figure 4A).
Figure 4. Ex vivo petit écran composé identifie les modulateurs du développement rénal.(A) La liste des petits composés, leurs cibles épigénétiques et la concentration utilisée montre une réduction de la croissance rénale avec l'entinostat, le TH39, le déférasirox, la déféroxamine et la cyproheptadine dans Supérieur ou égal à 3 expériences indépendantes après 3 jours de culture. Les cultures témoins ont été traitées avec du DMSO. ***, valeur p<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
