Première partie DsbA-L interagit avec VDAC1 dans l'apoptose des cellules tubulaires médiée par les mitochondries et contribue à la progression de l'insuffisance rénale aiguë

Résumé

1. Origines

nous avons démontré que la protéine de type oxydoréductase A à liaison disulfure (DsbA-L) était impliquée dans la progression de la fibrose rénale. Cependant, la fonction précise de DsbA-L dans l'insuffisance rénale aiguë (IRA) et les mécanismes impliqués restent à élucider.

2. Méthodes

Nous illustrons l'interaction entre DsbA-L et VDAC1 par co-IP (co-immunoprécipitation) in vitro et Viv et avons trouvé leurs parties d'interaction par expérience de mutation. Les résultats ci-dessus ont été vérifiés par leur co-localisation. De plus, nous avons construit les deux modèles de souris PT-DsbA-L et VDAC1 KO pour vérifier la fonction de DsbAL et VDAC1 dans les modèles d'AKI induite par VAN, CL, P et I/R.

3. Conclusions

Les souris PT-DsbA-L-KO ont montré une amélioration de la progression de l'IRA induite par I/R, VAN et CLP via la régulation à la baisse de VDAC1. Enfin, nous avons confirmé ces changements dans les molécules signal en examinant les cellules HK-2 et les biopsies rénales prélevées chez des patients atteints d'IRA induite par une néphrite interstitielle aiguë (AIN) ou ischémique. Mécaniquement, DsbA-L a interagi avec les acides aminés 9-13 et 22-27 de VDAC1 dans les mitochondries des cellules BUMPT pour induire l'apoptose des cellules rénales et des lésions mitochondriales.

4. Interprétation

Ce travail a suggéré que DsbA-L, situé dans les cellules tubulaires proximales, entraîne la progression de l'IRA, en régulant directement à la hausse les niveaux de VDAC1. Titre courant : Le rôle de DsbA-L dans l'IRA.

5. Financement

National Natural Science Foundation of China, une subvention du Key Project of Hunan provincial science and technology innovation, Department of Science and Technology of Hunan Province Project of International Cooperation and Exchanges, Changsha Science and Technology Bureau project, Natural Science Foundation of Hunan Province, Fundamental Fonds de recherche pour les universités centrales de l'Université Central South, Hunan Provincial Innovation Foundation For Postgraduate China Hunan Provincial Science and Technology Department.

Mots clés

DsbA-L ; VDAC_I; bax ; Cyt-c; AKI

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Introduction

L'insuffisance rénale aiguë (IRA), complication clinique dévastatrice aux taux élevés de morbidité et de mortalité, touche des millions de patients dans le monde entier(1). L'IRA est généralement induite par une septicémie, des agents néphrotoxiques et une lésion d'ischémie-reperfusion (IRI) (2). Pour l'instant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'IRA n'ont pas encore été complètement élucidés. Par conséquent, il n'existe aucune stratégie de traitement efficace disponible pour l'IRA.

Les lésions des cellules tubulaires sont reconnues depuis des décennies comme un facteur important de l'IRA.3 Au fur et à mesure que la recherche progresse, un nombre croissant de chercheurs ont identifié que les dommages mitochondriaux jouent un rôle clé dans les lésions des cellules tubulaires et que ces dommages initiaux sont causés par l'accumulation de ROS, la production de cytokines et la mort cellulaire (comprenant à la fois la nécrose et l'apoptose); collectivement, ces processus contribuent tous à l'IRA.4-6 Bien qu'un nombre croissant de recherches se soit concentré sur les mécanismes sous-jacents aux dommages mitochondriaux dans l'IRA,7- 12 le mécanisme précis responsable des lésions mitochondriales n'a pas encore été identifié.

La liaison disulfure Une protéine de type oxydoréductase (DsbAL) a été identifiée pour la première fois comme une protéine mitochondriale dans les cellules hépatiques de rat.13 Des études antérieures ont démontré que DsbA-L empêchait l'obésité, l'inflammation, la résistance à l'insuline ou lésion rénale. 14-18 Fait intéressant, notre étude récente a révélé que la DsbA-L médiait la fibrose rénale induite par l'obstruction urétérale unilatérale (UUO). Cependant, le rôle et le mécanisme de la DsbA-L tubulaire dans l'IRA sont encore totalement inconnus.

Dans la présente étude, la suppression tubulaire proximale de DsbA-L (PT-DsbA-L-KO) dans un modèle murin a entraîné une atténuation notable de l'I/R, ainsi que de la vancomycine (VAN) et de la ligature et ponction cæcales (CLP )-induit AKI. De manière constante, DsbA-L a également médié l'apoptose induite par I / R, VAN et LPS dans les cellules épithéliales tubulaires proximales rénales (BUMPT) de souris. Fait intéressant, nous avons constaté que DsbA-L interagissait avec les régions 9-13 et 22 27 du canal anionique voltage-dépendant 1 (VDAC1), un membre clé de la famille de protéines VDAC19 21 ; ces effets ont été observés dans des échantillons mitochondriaux in vivo et in vitro et des échantillons d'IRA humaine. De plus, nous avons démontré que le PTVDAC1-KO améliorait également l'apoptose des cellules rénales dans les modèles in vitro et in vivo d'IRA. Collectivement, nous avons démontré que DsbA-L interagissait avec VDAC1 dans l'apoptose cellulaire tubulaire médiée par la mitochondrie et provoquait donc la progression de l'IRA.

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Matériels et méthodes

1. Déclaration d'éthique

L'étude a été approuvée par le comité d'examen du deuxième hôpital de Xiangya, République populaire de Chine (NO. 2018065) ​​et cette étude a recruté 18 patients. Tous les participants avant leur inclusion dans l'étude ont été recrutés avec un consentement éclairé écrit. Toutes les expérimentations animales étaient conformes aux principes directeurs approuvés par le comité d'éthique des soins aux animaux du deuxième hôpital Xiangya, République populaire de Chine (NO. 2020310).

2. Anticorps et réactifs

Anti-COXIV (ab33985, RRID: AB_879754), VDAC1 (ab14734, RRID: AB_443084), and PGC-1a (ab191838, RRID: AB_2721267) antibodies were obtained from Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, UK). Anti-Caspase3 (9662, RRID: AB_331439) and cleavedcapase3 (9664, RRID: AB_2070042) antibodies were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-Bax (50599-2-Ig, RRID: AB_2061561), Cyt-c (10993-1-AP, RRID: AB_2090467), NRF1 (12482- 1-AP, RRID: AB_2282876), GAPDH (60004-1-Ig, RRID: AB_2107436), and b-tubulin (10094-1-AP, RRID: AB_2210695) antibodies were obtained from Proteintech (Rosemont, IL, USA). The anti-DsbA-L antibody was provided by Dr. Feng Liu(14). All secondary antibodies (MitoTracker Green FM and MitoTracker Red CMXRos) were obtained from Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). The calcium ionophore was purchased from Sigma-Aldrich (Shanghai, China). Antimycin A (>95 % pur, ab141904) et un kit de fractionnement Mitochondria/Cytosol (ab65320) ont été achetés auprès d'Abcam (Cambridge Science Park, Cambridge, Royaume-Uni). La séquence cible de la souris DsbAL a été décrite précédemment.22

3. La création de modèles AKI par reperfusion ischémique, CLP et VAN

Des souris mâles C57BL/6J (RRID : MGI : 5657312) âgées de 8-10 semaines ont été achetées auprès de Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. Des souris présentant une délétion DsbA-L ou VDAC1 spécifique au tubule proximal ont été produites en croisant DsbA-L (flox/flox) (fournies par le Dr Feng Liu) ou des souris VDAC1 (flox/flox) (obtenues à partir d'organismes modèles de Shanghai) avec des souris PEPCK-Cre (fournies par le Dr Volker Haase (Université de Pennsylvanie, Philadelphie, PA) ) comme décrit précédemment.22,23 Des souris mâles (âgées de 8-10 semaines) ont été soumises à l'ischémie, à la CLP et à l'IRA néphrotoxique VAN, comme décrit précédemment.23,27 Pour l'IRA ischémique, l'artère rénale bilatérale a été coupée en continu pour 28 min suivie d'une reperfusion pendant 24 h ou 48 h. La température corporelle des souris a été maintenue à environ 37 degrés. Pour l'IRA induite par le CLP, le caecum a été étroitement ligaturé à une position à 1,5 cm de l'extrémité. Cela a été suivi d'une ponction pendant 18 h. Pour les lésions VAN, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale d'une dose unique de VAN à une dose de 600 mg/kg pendant 7 jours consécutifs, comme décrit précédemment.28,29 De plus, les souris C57BL/6 ont reçu une injection de Plasmides DsbA-L ou VDAC1, ou siRNA VDAC1 (à la dose de 15 mg/kg) via la veine caudale 2 fois par semaine22 ; une solution saline a été utilisée comme injection témoin. Pour chaque étude, nous avons analysé les échantillons ensemble pour éviter les biais, sur la base des études précédentes, et avons utilisé le logiciel PASS pour déterminer la taille de l'échantillon (n=6). Nous avons exclu l'échantillon qui est décédé ou qui a échoué à l'établissement du modèle avant le critère d'évaluation. Les souris expérimentales ont été regroupées par table de nombres aléatoires. Les enquêteurs n'ont pas été mis en aveugle pendant l'expérience, mais l'ont été pendant l'attribution, la collecte des échantillons et l'analyse des données. Toutes les expérimentations animales se sont conformées aux principes directeurs approuvés par le comité d'éthique des soins aux animaux du deuxième hôpital de Xiangya, en République populaire de Chine. Les souris ont été logées dans un environnement 12-h clair/obscur avec un accès libre à un régime alimentaire standard pour rongeurs et à de l'eau.

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4. Culture cellulaire et modèle d'ischémie-reperfusion

Les cellules BUMPT obtenues auprès du Dr Wilfred Lieberthal (Boston University School of Medicine) ou les cellules HK{{0}} obtenues auprès de Shanghai Zhongqiaoxinzhou Biotech ont été cultivées avec du DMEM (Gibco, 11965092) additionné de 10 % de FBS (Gibco,10100147) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Gibco, 15140163) à 37 degrés dans 5 % de CO2. Pour le modèle de cellules ischémiques, les cellules BUMPT ont été traitées avec 10 mM d'antimycine A (un inhibiteur du complexe mitochondrial III, Abcam, ab141904) et 1,5 mM d'ionophore de calcium (Sigma, A23187) dans une solution saline équilibrée de Hanks (Hyclone, SH30030.02) pour 2 h.30 Nous avons ensuite remplacé le HBSS par du milieu DMEM pendant 0, 2 et 4 h pour l'étape de reperfusion. L'apoptose cellulaire a été détectée par morphologie et immunotransfert pour les indicateurs apoptotiques, y compris la caspase3 clivée, Bax et Cyt-c. Plusieurs plasmides ont été créés et transfectés dans des cellules par lipofection : DsbA-L, HA-VDAC1-1-25, HA-VDAC1-26-366, HA-VDAC1-pleine longueur, HA-VDAC{{33 }}D9-13,22-27, HAVDAC1-D39-45,55-57 et HA-VDAC1-D9-13, 22-27 D39-45,55-57 et siRNA pour DsbA-L et VDAC1. Six à huit heures après la transfection, le milieu de culture a été remplacé par du DMEM. Les séquences d'ARNsi DsbA-L et d'ARNsi VDAC1 pour souris étaient 50 - GCAUGGAGCAAACCAGAGAUTT -30 et 50 - CCAGAGCAACTTCGCAGTT -30, respectivement ; les séquences de l'ARNsi NC brouillé étaient 50 -UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-30. Les séquences d'ARNsi DsbA-L et d'ARNsi VDAC1 pour l'homme étaient 50 - UCAUUUGCCAUGUAUAGUCCU-30 et 50 -UAUUAAGCCAAAUCCAUAGCC -30, respectivement ; les séquences de l'ARNsi NC brouillé étaient 50 -AACCACUCAACUUUUUCC CAA -30. Le modèle d'IR a ensuite été induit lorsque la densité cellulaire a atteint 90 %.

5. Cytométrie en flux

La cytométrie en flux a été opérée selon les instructions du FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD, 556547). Les cellules BUMPT ou HK-2 avec différents traitements ont été collectées à l'aide de trypsine sans EDTA et lavées trois fois avec du PBS suivi du FITC pendant 15 min et du PI pendant 5 min à température ambiante, et enfin examinées par cytométrie en flux.

6. Patients atteints d'IRA et prélèvement d'échantillons

Le protocole a été approuvé par le comité d'examen du deuxième hôpital de Xiangya, en République populaire de Chine. Cette étude a recruté 18 patients, dont 12 hommes et 6 femmes. Le principe de recrutement reposait sur la biopsie rénale. Les informations sur les patients sont complétées dans le tableau 1. Les échantillons de biopsie rénale ont été obtenus auprès de patients vivant avec des maladies à changement minime (MCD) (n=6) et une IRA induite par une néphrite interstitielle aiguë (NIA) (n{{6} }). Nous déclarons que toutes les études sont conformes à toutes les réglementations éthiques pertinentes pour la recherche avec des participants humains et ont été réalisées conformément aux principes de la Déclaration d'Helsinki et que l'étude est conforme aux directives du ministère de la Science et de la Technologie pour l'examen et l'approbation des Ressources génétiques humaines. Les critères d'inclusion et d'exclusion de la MCD ont été décrits dans notre étude précédente.23 Pour l'IR : Critères d'inclusion :1 Biopsie pour les patients en ischémie-reperfusion,2 Âge inférieur à 75 ans ; Critères d'exclusion1 : exclure les patients présentant des tumeurs découvertes lors des examens médicaux postopératoires2, exclure les patients ayant respectivement des antécédents de diabète, de goutte, d'hypertension, de tuberculose ou d'infection urinaire. Pour l'AIN : Critères d'inclusion1 : Diagnostic clinique de néphrite interstitielle aiguë2 Patients atteints d'AIN confirmés par biopsie,3 Âge inférieur à 75 ans ; Critères d'exclusion1 : Exclure les patients présentant une créatininémie anormale avant l'admission2, exclure les patients ayant des antécédents de diabète, de goutte, d'hypertension, de tuberculose ou d'infection urinaire. Ces échantillons ont ensuite été utilisés pour la coloration de HE, TUNEL et l'immunohistochimie ainsi que l'immunoprécipitation (IP) et l'immunotransfert.

7. Immunoprécipitation

Le cytoplasme et les mitochondries des cellules BUMPT et des tissus rénaux de souris et de patients atteints d'IRA ont été séparés à l'aide du kit de fractionnement Mitochondria/Cytosol (Abcam, ab65320) ; le kit a été utilisé selon les instructions du fabricant. Les anticorps (DsbA-L, VDAC1, HA ou IgG) ont été liés sur les billes magnétiques. Ensuite, nous avons ajouté le lysat de mitochondries/cytoplasme et l'avons incubé pendant trois heures. Ensuite, le mélange a été élué et étudié pour l'expression de marqueurs associés par immunotransfert.

8. PCR quantitative relative (qPCR)

L'ARN a été extrait des cellules BUMPT ou du tissu rénal par le réactif Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). L'ARN a ensuite été transcrit en ADNc premier brin à l'aide du kit Prime Script RT Reagent et du gDNA Eraser (TaKaRa, RR037A), comme décrit précédemment.31'34 Ensuite, nous avons utilisé l'ADNc comme matrice avec TB green (TaKaRa, RR820A) et un Light cycler 96 (Roche) avec les paires d'amorces suivantes : DsbA-L : 5 - AAATATGGGCCTT TGGGCT-3'(avant) et 5'- TAGCAACTCCAAGCGGTCA G-3'(inverse); et GAPDH : 5'-GGTCTCCTTCTGACTTCACA-3'(avant) et 5'-GTGAGGGTC TCTCTCTCT-3'(inverse); PGC- 1a : 5'-ATGTTGTCGCCTTCTTGCTCTTCC-3 (vers l'avant) et 5'-CTCCCGCTTCTCGTGCTCTTTG-3'(inverse); NrF1:5'-TCTGCTGTGGCTGATGGAGA GG-3'(avant) et NrF1:5'-GATGCTTGCGTCGTCTGGATGG-3 (arrière);

9. BUN et détection de la créatinine

La détection de BUN et de la créatinine a été réalisée selon le protocole de BUN (Urea Nitrogen Content Assay Kit Beijing Boxbio Science & Technology Co, Ltd.) et Creatinine Assay kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Chine).

10. Coloration HE, coloration TUNEL, immunochimie, immunofluorescence et immunotransfert

Le tissu rénal a été inclus dans de la paraffine puis découpé en sections pour divers types de coloration, comme décrit précédemment.26,35 L'histologie a été évaluée par coloration à l'hématoxyline et à l'éosine. Les critères utilisés pour évaluer les lésions tubulaires rénales ont été décrits précédemment.23 La coloration TUNEL a été utilisée pour évaluer l'apoptose dans les cellules rénales. La proportion (pourcentage) de cellules TUNEL-positives dans 10-20 champs microscopiques par coupe de tissu a été utilisée comme indicateur quantitatif de l'apoptose.26 Pour la coloration immunochimique, les coupes de tissu ont été incubées pendant une nuit à 4 °C avec un anticorps primaire spécifique ( DsbA-L 1 : 200 ou VDAC1 1 : 100). Le lendemain matin, les coupes ont été incubées avec un anticorps secondaire pendant 30 min à 37 degrés, puis mises à réagir avec du DAB pendant 5-10 min. Pour la coloration par immunofluorescence, les coupes ont été incubées avec un anticorps primaire spécifique (DsbA-L 1 : 200, VDAC1 1 : 100) pendant une nuit à 4 degrés, suivi d'un anticorps fluorescent secondaire pendant 1 h à 37 degrés dans l'obscurité. Le DAPI a ensuite été ajouté pendant 3-5 min et les coupes ont été observées par microscopie à fluorescence. La coloration mitochondriale a été réalisée par un protocole standard. Des lysats protéiques de cellules BUMPT ou de reins ont été récoltés puis centrifugés pour recueillir le surnageant contenant les protéines. Le surnageant a été soumis à SDS-PAGE puis transféré sur une membrane PVDF. Les membranes ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire pendant une nuit à 4 degrés suivi d'un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. La concentration d'antiCOXIV, VDAC1, PGC-1a, Bax, Cyt-c, NRF1, GAPDH et b-tubuline est de 1:1000. La concentration d'anti-caspase3 et de capase3 clivée est de 1:2000.

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11. Statistiques

Toutes les données ont été présentées sous forme de moyennes § SD. Des tests t de Student bilatéraux ont été utilisés pour les comparaisons de deux groupes. L'ANOVA unidirectionnelle suivie de l'analyse post hoc de Tukey a été utilisée pour les comparaisons multiples. Le test de Kruskal Walls a été utilisé pour les données avec une distribution non normale. Le logiciel Graph Pad 8.0 a été utilisé pour analyser les données et P<0.05 was considered statistically significant.

12. Rôle de la source de financement

Les bailleurs de fonds n'ont pas été impliqués dans la conception de l'étude, la collecte des données, l'analyse, l'interprétation ou la rédaction du manuscrit.

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Xiaozhou Li,a,b,1 Jian Pan,a,b,1 Huiling Li,c Guangdi Li,g Bohao Liu,a,b Xianming Tang,a,b Xiangfeng Liu,f Zhibiao He,a,b Zhenyu Peng,a ,b Hongliang Zhang,a,b Luxiang Wang,a,b Yijian Li,d Xudong Xiang,a,b Xiangping Chai,a,b Yunchang Yuan,e Peilin Zheng,h et Dongshan Zhang a,b *

a Département de médecine d'urgence, République populaire de Chine

b Institut de médecine d'urgence et des maladies difficiles, Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410011, République populaire de Chine

c Département d'ophtalmologie, République populaire de Chine

d Département de chirurgie urinaire, République populaire de Chine

e Département de chirurgie thoracique, République populaire de Chine

f Département de chirurgie générale, deuxième hôpital de Xiangya, République populaire de Chine

g Département de santé publique, Central South University, Changsha, Hunan, République populaire de Chine

h Département d'endocrinologie, Hôpital populaire de Shenzhen, Deuxième faculté de médecine clinique de l'Université de Jinan, Premier hôpital affilié de l'Université des sciences et technologies du Sud, Shenzhen, République populaire de Chine

1 Xiaozhou Li et Jian Pan ont contribué à parts égales à cette étude