Partie Ⅰ : Pertinence possible du récepteur de l'hormone lutéinisante soluble au cours du développement et de l'âge adulte chez les garçons et les hommes

Résumé simple

L'hormone lutéinisante (LH) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG), deux agonistes du récepteur de l'hormone lutéinisante (LHCGR), sont essentielles à la reproduction masculine pendant le développement et l'âge adulte. lHCGR est exprimé et stimule la production de testostérone par les cellules testiculaires de Leydig. Dans cette étude, nous démontrons que le LHCGR soluble est présent dans le sang, l'urine et le sperme de garçons et d'hommes en bonne santé, ainsi que chez les patients présentant des aberrations chromosomiques sexuelles. Nous montrons comment les niveaux circulants de sLHCGR sont en corrélation avec le développement pubertaire, la fonction testiculaire et la qualité du sperme, et démontrons que le LHCGR est libéré du tissu non gonadique humain fœtal. L'HCG est libérée dans le sérum via les testicules et d'autres organes, suggérant un rôle extragonadique possible pour la LH ou l'hCG chez les garçons et les hommes.

Abstrait

L'hormone lutéinisante (LH) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) sont des agonistes du récepteur de l'hormone lutéinisante (LHCGR), qui régule la fonction reproductive masculine. lHCGR peut être libéré dans les fluides corporels. Nous avons voulu déterminer si le LHCGR soluble est un marqueur de la fonction gonadique. Des études transversales, longitudinales et interventionnelles ont été réalisées sur 195 garçons et hommes en bonne santé et 396 hommes atteints d'infertilité, de déficience ou du syndrome de Klinefelter (SK) pour lier le LHCGR mesuré dans le sérum, le sperme, l'urine et les artères hépatiques / rénales à la fonction gonadique . LHCGR a été mesuré dans des modèles in vitro et in vivo de tissus testiculaires humains et de lignées cellulaires, des modèles de souris xénogreffes et les résultats de Western blot humains ont montré que des fragments de LHCGR ont été détectés dans des tissus sériques et gonadiques de taille similaire à l'aide de trois anticorps différents. Même après des xénogreffes humaines, le LHCGR-ELISA n'a montré aucune réactivité croisée interspécifique ou réactions non spécifiques dans le sérum de souris. En revanche, le sLHCGR a été libéré dans le milieu de culture après la culture du rein fœtal humain et de la glande surrénale. Le sLHCGR sérique était significativement plus faible chez les garçons en bonne santé à la puberté (p=0.0001). Chez les hommes sains, le sLHCGR sérique était négativement corrélé au rapport inhibine B/FSH (-0.004,p=0.027). Chez les hommes infertiles, le sLHCGR du sperme était négativement corrélé à la FSH sérique ( 0,006, p=0.009), à la concentration de spermatozoïdes (-3.5, p=0.003) et au nombre total de spermatozoïdes (-3.2, p=0.007). L'injection d'hCG a réduit le sLHCGR dans le sérum et l'urine d'hommes en bonne santé (p <0,01). En conclusion, le sLHCGR est libéré dans les fluides corporels et est associé au développement pubertaire et à la fonction gonadique. Le sLHCGR circulant chez les orchidées mâles suggère que le sLHCGR dans le sérum peut provenir de tissus non gonadiques et peut fonctionner dans des tissus non gonadiques. (Essais cliniques : NTC01411527, NCT01304927, NCT03418896).

Mots clés

récepteur LH; puberté; développement; infertilité;Avantages Cistanche; effets extra-gonadiques ; gonadotrophines; rein fœtal; glande surrénale fœtale; TCAM2 ; NTera2

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Introduction

L'hormone lutéinisante (LH) et la gonadotrophine chorionique humaine (hCG) sont toutes deux des agonistes du récepteur de l'hormone lutéinisante (LHCGR), essentiel à la reproduction masculine au cours du développement et de l'âge adulte [1]. HCG est un récepteur couplé aux protéines G connu pour être exprimé dans les cellules de Leydig, de lutéine granulaire et membranaire et est un puissant régulateur de la production de stéroïdes sexuels [1]. L'hCG est un agoniste puissant et persistant, mais n'est physiologiquement important que pendant le développement fœtal [2]. À l'exception de certains cancers des cellules germinales et cancers du pancréas, l'hCG n'est pas produite à l'âge adulte, bien qu'une étude antérieure ait révélé une faible sécrétion pulsatile d'hCG hypophysaire chez les hommes et les femmes adultes. L'hCG est utilisée pour traiter les femmes pour induire l'ovulation pendant le traitement de fertilité, pour les hommes pour stimuler la synthèse de testostérone et la spermatogenèse potentielle chez les hommes hypogonadiques, ou comme test de diagnostic pour la production endogène de testostérone [4]. L'ablation du récepteur LH de la souris (LHCGR) entraîne une diminution spectaculaire de la testostérone et de la qualité du sperme [5], et plusieurs groupes de recherche ont identifié des mutations et des SNP dans le LHCGR, démontrant son importance pour la fonction reproductive humaine [6-8].

Le gène LHCGR est situé sur le chromosome 2 et se compose de 11 exons, dont les exons 1-10 codent pour des domaines structurels extracellulaires et l'exon 11 code pour 7 domaines structurels transmembranaires et intracellulaires [9]. Il existe plusieurs isoformes de LHCGR, dont l'une serait sécrétée car dépourvue d'ancrage transmembranaire [10]. Une autre possibilité est que la libération de LHCGR dans les fluides corporels dépende du clivage enzymatique des protéines sur la membrane cellulaire, telles que les ADAM, les MMP et d'autres protéines transmembranaires connues clivées. En effet, il a été démontré que l'hCG régule positivement spécifiquement MMP-2 et MMP-9 [11,12], et plusieurs études ont montré une régulation post-transcriptionnelle du LHCGR [13,14]. Le LHCGR soluble (LHC) a été mesuré dans le sérum et le liquide folliculaire féminins par la plateforme ELISA [15,16]. La spécificité des anticorps utilisés dans le test ELISA a été validée en exprimant différents fragments de LHCGR dans des cellules CHO pour la localisation des épitopes et en détectant l'expression dans le placenta humain [15-17]. Le sLHCGR a été détecté dans le sérum par LC-MS/MS [18]. les concentrations sériques de sLHCGR chez les femmes étaient associées au traitement de la fertilité, à la prééclampsie, à l'accouchement prématuré et à la grossesse chez les enfants porteurs du syndrome de Down taux d'implantation [15,16], mais n'ont pas été validées par d'autres groupes de recherche à ce jour. À notre connaissance, le sLHCGR n'a jamais été décrit dans les fluides corporels d'hommes en bonne santé, d'adolescents en développement ou d'hommes présentant des aberrations chromosomiques sexuelles. Le sLHCGR peut fonctionner dans la circulation masculine en tant que marqueur de la fonction gonadique par le biais d'un transport de liaison à haute affinité ou d'une altération de l'activité LH ou hCG.

Matériels et méthodes

1. Cohortes

Jeunes hommes de la population générale

Au Danemark, tous les jeunes hommes en bonne santé de plus de 18 ans doivent subir un examen physique pour déterminer leur aptitude au service militaire. Depuis 1996, environ 300 appelés, représentant la population générale, ont été examinés chaque année pour la qualité du sperme. Ils ont tous fourni des échantillons de sperme, rempli un questionnaire, subi des examens échographiques de leurs testicules et fait prélever des échantillons de sang. Des échantillons de sérum et de sperme de la biobanque, ainsi que des évaluations échographiques et des informations sur l'IMC et l'âge de 148 hommes interrogés en 2013 et 2014, ont été inclus dans l'étude actuelle (approbation du comité d'éthique : H-KF-289428).

Garçons en bonne santé pré- et post-pubères

L'étude sur l'adolescence de Copenhague est une étude transversale et longitudinale combinée d'enfants danois en bonne santé [20]. Dans des écoles publiques sélectionnées au hasard, 6203 enfants ont été invités à participer. Le nombre total de participants était de 2020 enfants. Un suivi longitudinal de 209 enfants (101 garçons) a été effectué tous les 6 mois et comprenait un examen physique, une évaluation Tanner des stades pubertaires et des échantillons de sang et d'urine. Trente-six garçons avec un suivi longitudinal ont été inclus dans cette étude pour évaluer le sLHCGR pendant la puberté (essai clinique : NTC01411527).

Hommes infertiles sans comorbidité grave

L'étude Copenhagen-Bone-Gonad est une étude de cohorte de 307 hommes infertiles sans comorbidités graves qui ont fréquenté notre clinique masculine de 2011 à 2015, dont un total de 1427 hommes [21,22]. Tous les hommes ont été référés à notre clinique en raison de la faible qualité de leur sperme et de leur désir d'être parents. Tous ont subi un examen physique, y compris une échographie testiculaire, ont fait prélever des échantillons de sang et ont fourni des échantillons de sperme. Un spécialiste a obtenu leurs antécédents médicaux détaillés. Les hommes ont été suivis pendant 150 jours par les chercheurs et ont pris de la vitamine D ou un placebo comme décrit précédemment. Toutes les données fournies dans cette étude provenaient de la visite initiale de pré-intervention et toutes les variables incluses étaient prédéfinies (essai clinique : NCT01304927).

Cistanche normalisé

Hommes et garçons atteints du syndrome de Klinefelter et patients atteints d'anorchie

Nous avons identifié 64 garçons et hommes atteints du syndrome de Klinefelter (SK), 47 post-pubères et 16 pré-pubères, définis selon la stadification de Tanner, dans notre clinique masculine. Nous avions des aberrations chromosomiques exactes, des antécédents médicaux, le statut de début pubertaire et des informations sur le sérum disponibles pour tous. 7 garçons ont subi un suivi longitudinal avec une évaluation clinique régulière et des prélèvements sanguins avant et pendant le début de la puberté.

Nous avons également inclus 8 hommes avec un nombre de chromosomes normal qui s'étaient fait retirer des testicules bilatéraux pour des affections antérieures : carcinome germinal testiculaire (n=4), cancer diffus de la prostate (n=1), cryptorchidie bilatérale et orchidectomie pédiatrique ( n=1), néoplasie bilatérale des cellules germinales in situ (n=1) et cancer testiculaire avancé après ablation des testicules restants en raison d'un traumatisme (n=1).

Adultes subissant une mesure du débit splanchnique

Nous avons inclus trois hommes et trois femmes ménopausées ayant une fonction hépatique normale qui ont été admis pour suspicion d'ischémie mésentérique et référés pour une mesure du débit sanguin viscéral mais qui n'ont montré aucune ischémie mésentérique. Des échantillons de sang ont été prélevés simultanément du foie, du rein, de la veine fémorale et de l'artère correspondante (approbation du comité d'éthique : H.18048245)

Étude d'intervention : hommes en bonne santé exposés à la gonadotrophine chorionique humaine

Onze hommes en bonne santé ont été recrutés pour participer à l'intervention clinique par le biais d'une annonce du Rigshospitalet danois. Les volontaires ont été traités avec 5000 UI de gonadotrophine chorionique humaine et leur production maximale de testostérone endogène a été mesurée en comparant des échantillons de sang et d'urine de base avec des échantillons de suivi prélevés 8, 24 et 72 heures après l'injection d'hCG (essai clinique : NCT03418896).

2. Souris, tissus humains et lignées cellulaires

Deux souches de cellules cancéreuses testiculaires humaines NTera-2 et TCam-2, représentant respectivement un carcinome embryonnaire et un séminome, ont été utilisées et cultivées comme décrit précédemment [23].

Des sérums ont été prélevés sur des souris nude sans tumeur (WT) et des souris nude xénogreffées TCam-2 traitées avec le vecteur, LH ou hCG, respectivement (Inspection de l'expérimentation animale, Copenhague, Danemark, numéro de licence : 2012-15-2934-00051) .

Des tissus fœtaux humains du premier trimestre ont été prélevés sur des tissus de femmes données après des avortements planifiés. Le rein fœtal et le tissu surrénalien fœtal ont été cultivés dans des modèles de suspension en goutte comme décrit précédemment et le milieu a été collecté pour analyse [24,25] (approbation du comité d'éthique : H-1-2012-007).

Des échantillons de testicules adultes ont été obtenus d'hommes ovariectomisés atteints d'un cancer des testicules (approbation du comité d'éthique : H{{0}}). Le tissu péritumoral contenant des zones non malignes a été stocké à - 80◦ C ou fixé pendant la nuit à 4◦ C dans du formol ou un fixateur de Stieve modifié (200 mL de formaldéhyde à 37 %, 40 mL d'acide acétique dans 1 L de phosphate 0,05 M tampon, pH 7,4).

3. Analyses biochimiques

La détection du sLHCGR total dans le sérum, le sperme, l'urine et divers milieux de culture a été réalisée dans un processus de validation à l'aide de kits ELISA du New Dutch Biomarker Catalyst Laboratory (NBCL) utilisant l'anticorps LHR029 contre le LHCGR humain et mesurant tous de ceux-ci à plusieurs reprises. le test ELISA avait une limite de détection de 0,01 pmol/mL et un niveau maximum de 15,55 Six hommes de la population générale avec des niveaux de sLHCGR au-dessus de la limite supérieure de détection ont vu leurs échantillons dilués et remesurés, montrant des niveaux allant jusqu'à 30 pmol/mL. les performances de la plateforme ELISA ont été décrites en détail précédemment [15-17].

Suppléments Cistanche

Nous avons également mis en place deux ELISA internes différents, mis en place par nos techniciens de laboratoire, et tous les autres réactifs ont été fournis par Origin Biomarkers Ltd, Royaume-Uni, selon leur configuration suggérée [26]. Tout d'abord, le sLHCGR circulant lié à l'hCG a été détecté à l'aide de kits ELISA en sandwich avec les anticorps 5A10C9 (ProMab) et am0{{20}}904pun ( OriGene) dirigés contre LHCGR et hCG, respectivement. Deuxièmement, nous avons également utilisé l'ELISA interne pour déterminer les échantillons artériels et veineux totaux du foie, des reins et des membres inférieurs de six sLHCGR adultes, où nous avons utilisé le même anticorps LHR029 (NBCL Holland) contre le sLHCGR. Deux protocoles différents ont été testés. Toutes les mesures de sLHCGR décrites dans cet article ont été effectuées à l'aide de NBCL ELISA, à l'exception du complexe hCG-sLHCGR et des échantillons artériels/veineux des organes décrits ci-dessus. Chez les garçons en bonne santé, la testostérone a été analysée à l'aide du kit RIA revêtu de DPC (Diagnostic Products, Los Angeles, CA) avec une limite de détection (LOD) de 0,23 nmol/L et un CV de 8,6 % en utilisant l'immunofluorescence à résolution temporelle. (Delfia ; Wallac, Turku, Finlande), la limite de détection était de 0,20 nmol/l avec un CV de 6,4 %. Chez l'adulte, la testostérone et la globuline liant les hormones sexuelles (SHBG) ont été analysées par dosage immunologique par chimiluminescence (Access, Beckman Coulter, USA) avec des LOD de 0,35 nmol/L et 0,33 nmol/L, respectivement. Les taux sériques et urinaires de FSH et de LH ont été mesurés par immunofluorescence à résolution temporelle (Delfia ; Wallac, Turku, Finlande) avec des limites de détection de 0,06 et 0,05 UI/L, respectivement, et CV et lt ; les deux à 5 pour cent. Le dosage de l'inhibine B a été réalisé à l'aide d'un dosage immunoenzymatique bilatéral spécifique (inhibine B genII, Beckman Coulter, USA) CV <11 pour cent . Pour l'AMH, nous avons utilisé le test immunoenzymatique Beckman Coulter (Immunotech, Beckman Coulter, Marseille, France) et un CV <8 %. Enfin, IGF1 et IGF-BP3 ont été déterminés à l'aide du test de chimioluminescence du système d'immunodiagnostic IDS-iSYS avec des CV de 10 % et 9 %, respectivement. L'estradiol libre a été calculé à l'aide de la constante de Mazer et la testostérone libre (FT) a été calculée à l'aide de la formule de Vermeulen [27,28].

Analyse de sperme

De jeunes hommes en bonne santé et des participants adultes infertiles ont fourni des échantillons de sperme et obtenu des informations autodéclarées sur la durée de l'abstinence éjaculatoire. L'analyse du sperme a été effectuée par des techniciens formés comme décrit précédemment [19]. Le volume de sperme a été estimé par pesée. Pour l'évaluation de la viabilité des spermatozoïdes, 10 μ L de répliques de sperme bien mélangées ont été placées sur des lames et examinées au microscope × 400x dans une section chauffée à 37◦ C. Les spermatozoïdes ont été classés comme viable avancé (OMS classe a plus B), viable non progressif (classe C) ou inactif (classe D). La moyenne des deux évaluations de viabilité a été utilisée. Pour évaluer la concentration de sperme, les échantillons ont été dilués dans une solution d'eau distillée de 0,6 mol/L de NaHCO3 et 0,4 % (v/v) de formaldéhyde, puis évalués à l'aide d'un hémocytomètre Bürker-Türk et la moyenne des évaluations a été utilisée. Seuls les spermatozoïdes à queue ont été comptés. Enfin, des frottis ont été préparés et colorés avec une coloration Pap, et la morphologie des spermatozoïdes a été évaluée strictement selon les critères de [29].

Western blot

Le tissu testiculaire humain a été homogénéisé dans un tampon de lyse, dilué dans un tampon de charge SDS, puis chauffé à 95°C pendant 5 min. Les échantillons ont été chargés sur 4-20 % de gels de polyacrylamide prémoulés (BioRad, cat # 456-8096) et exécutés à 100 V pendant 1 h pour séparer les protéines. Pour détecter le sLHCGR dans le sérum, l'albumine et les IgG ont été éliminés à l'aide du kit d'élimination d'albumine/IgG Pierce (Thermo Scientific, Waltham, MA, États-Unis, cat # 89875) avant de charger les échantillons sur le gel. après électrophorèse sur gel, les protéines ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène à l'aide d'un buvard humide (BioRad). Les membranes ont été fermées dans une solution saline tamponnée au tris et du lait en poudre écrémé à 5% pendant 1 heure, puis incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires et pendant 1 heure à température ambiante avec des anticorps secondaires. Les membranes ont été lavées avec une chimiluminescence améliorée (substrat sensible maximum Thermo Scientific Super Signal West Femto, Cat # 34095) et un photodétecteur avec un système d'imagerie chemiDoc MP (BioRad, Cat # 17001402). Trois anticorps différents ont été utilisés pour détecter le LHCGR dans les tissus et le sérum : Aviva System Biology (OASG04237) ; NBCL Holland, le même anticorps que dans le kit ELISA sérique (LHR029) et Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA, SC- 26341). La -2 microglobuline a été utilisée comme contrôle de charge.

Immunohistochimie

L'immunohistochimie a été réalisée comme décrit précédemment [25]. En bref, les coupes ont été fixées avec un fixateur Stiff modifié, déparaffinées et réhydratées. L'extraction de l'antigène a été réalisée dans un autoclave contenant un tampon d'extraction au citrate (10 mM, pH 6.0). La peroxydase endogène a été bloquée avec 3 % (v/v) de H2O2 dans du méthanol pendant 30 min. Entre chaque étape, les coupes ont été lavées au TBS. Les coupes ont été incubées avec du sérum de cheval BSA à 0,5 % pendant 30 minutes, suivies d'une incubation d'une nuit avec deux anticorps primaires différents pendant 1 heure à température ambiante (LHR029 pour WB/ELISA, Santa Cruz Biotechnology SC- 25828). Les coupes ont été incubées avec des anticorps secondaires pendant 30 minutes. Les images ont été visualisées avec de l'aminoéthylcarbazole (AEC, Invitrogen, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Les témoins négatifs étaient dépourvus d'anticorps primaires. Aucun des contrôles négatifs n'a été coloré. La contre-coloration a été réalisée avec de l'hématoxyline de Mayer et le montage a été réalisé avec Aquatex. Les sections ont été évaluées sur un microscope Nikon Microphot-FXA (Nikon Corporation, Melville, NY, USA). L'analyse finale a été réalisée à l'aide du logiciel NDPview version 1.2.36 (Hamamatsu Photonics, Iwata City, Japon.

Avantages de l'extrait de Cistanche pour le rein

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29. Menkveld, R.; Stander, FS ; Kotze, TJ; Kruger, TF ; van Zyl, JA L'évaluation des caractéristiques morphologiques des spermatozoïdes humains selon des critères plus stricts. Hum. Repr. 1990, 5, 586–592.

Li Juel Mortensen¹, Mette Lorenzen¹, Anne Jorgensen², Jacob Albrethsen², Niels Jørgensen²,Søren Møller^3,4, Anna-Maria Andersson², Anders Juul^2,4et Martin Blomberg Jensen^1,5

1. Groupe d'endocrinologie squelettique, minérale et gonadique, Département universitaire de croissance et de reproduction, Rigshospitalet, 2100 Copenhague, Danemark ; li.juel.mortensen@regionh.dk (LJM); mette.lorenzen.01@regionh.dk (ML)

2. Département de la croissance et de la reproduction et Centre international de recherche et de formation à la recherche sur les perturbations endocriniennes de la reproduction masculine et de la santé infantile (EDMaRC), Rigshospitalet, Université de Copenhague, Blegdamsvej 9, 2100 Copenhague, Danemark ; Anne.Joergensen.02@regionh.dk (AJ); Jakob.Christian.Albrethsen@regionh.dk (JA); Niels.Joergensen@regionh.dk (NJ); Anna-Maria.Andersson@regionh.dk (A.-MA); Anders.Juul@regionh.dk (AJ)

3. Centre d'imagerie et de recherche fonctionnelles et diagnostiques, Département de physiologie clinique et de médecine nucléaire 260, Hôpital Hvidovre, 2650 Copenhague, Danemark ; Soeren.Moeller@regionh.dk

4. Département de médecine clinique, Faculté des sciences de la santé, Université de Copenhague, 2200 Copenhague, Danemark

5. Division of Bone and Mineral Research, Harvard School of Dental Medicine/Harvard Medical School, Boston, MA 02115, États-Unis