PARTIE Ⅰ : L'administration de la souche synbiotique Lactobacillus Bulgaricus 6c3, de l'inuline et du fructo-oligosaccharide diminue les concentrations de sulfate d'indoxyle et les lésions rénales
Mar 23, 2022
ali.ma@wecistanche.com
AlonsoJerez-Morales,JoseS.Merino,Sindy T.Diaz-Castillo & et al.
1. Introduction
Maladie rénale chronique(IRC) est considérée comme une altération permanente duun reinstructure, sa fonction ou, dans les cas les plus graves, les deux. L'IRC affecte directement la santé et la qualité de vie de l'individu [1,2]. Au niveau physiologique, les changements provoqués par la MRC sont fréquemment observés : augmentation des taux sériques de créatinine, cystatine Cor azote uréique [2]. La surveillance intensifiée et la sensibilisation de la population ont augmenté les diagnostics d'IRC atteignant, par exemple, à déterminer qu'un 15 pour cent de la population américaine est affectée par cette pathologie [3]. La progression de la maladie, ainsi que les effets des métabolites mentionnés ci-dessus, ont un impact sérieux sur plusieurs systèmes de l'organisme, y compris les systèmes cardiovasculaire et gastro-intestinal, la présence de ces métabolites étant associée à une mortalité accrue chez les premiers. et affectant l'assimilation, la motilité et la perméabilité de ce dernier [4,5]. Les altérations gastro-intestinales provoquent une absorption accrue des métabolites dans l'intestin contribuant à entretenir une inflammation systémique qui, à son tour, affecte la composition du microbiote normal et ses fonctions métaboliques et peut provoquer une dysbiose intestinale [6].
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L'association entre IRC et dysbiose intestinale pourrait ne pas s'expliquer uniquement par des modifications du régime alimentaire mais aussi, par ailleurs, par l'augmentation du pH luminal, secondaire à une concentration accrue en ammonium [7]. Les patients atteints d'IRC en phase terminale présentent des différences marquées dans l'abondance de plusieurs taxons bactériens dans leurs selles par rapport aux individus en bonne santé [8]. En particulier, au niveau du genre bactérien, les patients atteints d'IRC présentent une augmentation d'Enterorhabdus, Blautia, Ruminococcus, Parasutterella, Bacteroides, Clostridium (sensu stricto), Escherichia, Shigella et Allobaculum et une diminution d'Akkermansia, Bifidobacterium, Clostridium IV, Lactobacillus, Lactococcus , Leuconostoc, Alkaliphilus et Pseudomonas [9-11]. Soit par la mauvaise dépuration rénale, soit par la dysbiose intestinale, il y a une diminution des genres bactériens capables de métaboliser et d'inhiber les pathogènes produisant des métabolites toxiques, entraînant leur augmentation [12]. Wang et al. [8] ont démontré que les patients souffrant d'IRC avancée présentaient une augmentation des groupes bactériens possédant des enzymes telles que l'uréase, l'uricase et ceux produisant du p-crésol et de l'indole.
L'accumulation de métabolites de rétention urémique (URM) dans le sang, y comprissulfate d'indoxyle(IS), le sulfate de p-crésyle (pCS), la triéthylamine et le N-oxyde de triméthylamine (TMAO) [5] sont postulés comme des accélérateurs de l'IRC [13]. EST(Sulfate d'indoxyle), l'indole urémique le plus connu, est sécrété par les tubules contournés proximaux duun reinet il provient du métabolisme du tryptophane par la tryptophanase bactérienne. Les preuves issues de modèles animaux montrent que IS(Sulfate d'indoxyle)peut affecter la fonction rénale et peut endommager les cellules des tubules générant un stress oxydatif dans les cellules endothéliales, inhibant les mécanismes de réparation et favorisant la fibrose tubulaire interstitielle car il augmente l'expression génique du TGF-1, inhibiteur tissulaire des métalloprotéinases (TIMP -1) et de collagène [14]. Néanmoins, le déséquilibre du microbiote intestinal, et la production concomitante de métabolites toxiques peuvent être modifiés. Il a été décrit qu'une supplémentation avec certains probiotiques et prébiotiques peut réduire la production de certaines toxines urémiques et restaurer le microbiote normal [5]. Par exemple, des études de méta-analyse ont conclu que les patients atteints d'IRC recevant une supplémentation avec des souches probiotiques augmentaient leurs cytokines anti-inflammatoires et diminuaient leurs niveaux de toxines urémiques [15,16]. Certaines études ont rapporté que l'administration de synbiotiques, une combinaison de probiotiques et de prébiotiques, est capable de diminuer la progression de l'IRC avec des résultats favorables [12]. Dans le cadre du présent travail, les fructanes de type inuline sont des prébiotiques pertinents car ils ont montré leur capacité à ralentir la progression de la MRC [17] et à réduire les MRN, comme le pCS et l'IS(Sulfate d'indoxyle)[18]. Panza et al. (2017) ont administré les probiotiques L.acidophlilus et Bifidobacterium longum plus des fructo-oligosaccharides (FOS) à des patients atteints d'IRC de stade 2-5 et ont rapporté que les patients non traités avaient significativement plus de pCS et sont(Sulfate d'indoxyle)dans le sang que les patients ayant reçu le traitement synbiotique [19]. Dans ce travail, nous avons d'abord évalué la capacité des souches probiotiques à réduire l'IS(Sulfate d'indoxyle)in vitro pour sélectionner le plus prometteur. Ensuite, cette souche a été combinée avec les prébiotiques inuline et fructo-oligosaccharides (FOS) pour obtenir un symbiotique putatif. Ces prébiotiques ont été sélectionnés car ils ont montré qu'ils pouvaient diminuer pCS et IS(Sulfate d'indoxyle)concentration dans le sang [17,18]. Enfin, l'efficacité du symbiotique putatif a été testée in vivo, évaluant l'IS sanguin(Sulfate d'indoxyle)et les niveaux de créatinine etun reinet des lésions cardiaques à l'aide d'un modèle de rat (rats Sprague-Dawley) comprenantun reinanimaux carencés (néphrectomisés) et non traités.
2. Résultats
2.1.Isolation des souches capables de réduire l'IS(Sulfate d'indoxyle)In vitro
A partir de 36 échantillons de produits laitiers, 84 souches ont été isolées en gélose MRS additionnée de bleu de bromophénol (MRS-BFB), utilisée comme milieu différentiel. Ce milieu permet de différencier les bactéries lactiques. A pH 3 les colonies seront colorées en jaune et à pH proche de 5 elles seront colorées en bleu [19]. Toutes les 84 souches isolées ont été testées in vitro pour déterminer leur capacité à médier la réduction de l'IS(Sulfate d'indoxyle). Pour cela, les souches ont été cultivées en bouillon MRS additionné d'IS 2,8 mM(Sulfate d'indoxyle)pendant 48 h, puis IS(Sulfate d'indoxyle)a été mesurée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Les souches lc2, 6c3 et VIc2 ont pu réduire significativement (p<0.05) the="" concentration="" of="" the="" compound="" (table="" 1).="" furthermore,="" the="" three="" strains="" were="" cultured="" together="" for="" 48="" h="" in="" the="" presence="" of="">(Sulfate d'indoxyle)pour évaluer s'ils ont agi en synergie pour réduire l'IS(Sulfate d'indoxyle). Lorsque les trois souches ont été cultivées ensemble en présence d'IS(Sulfate d'indoxyle), la concentration de IS(Sulfate d'indoxyle)a également été significativement réduite mais inférieure à celle obtenue par les souches seules, excluant la possibilité d'une activité synergique (tableau 1).
Tableau 1.Diminution in vitro, sisulfate d'indoxyle(IS), est évaluée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC), médiée par des souches bactériennes.
2.2. Identification des souches sélectionnées
Les trois souches sélectionnées en raison de leur capacité à réduire l'IS(Sulfate d'indoxyle)ont été identifiés par séquençage de l'ARNr 16S après amplification par PCR de l'ADN. Les souches 6c3 et VIc2 étaient toutes deux des bacilles à Gram positif et amplifiées avec des amorces LbG pour identifier le genre Lactobacillus. L'analyse du séquençage de l'ARNr 16Sr a permis d'identifier la souche lc2 comme Streptococcus thermophilus (97,3 % de similarité ; numéro d'accès : AY188354.1), la souche 6c3 comme Lactobacillus bulgaricus (99,7 % de similarité ; numéro d'accès : CR954253) et la souche VIc2 comme Lactobacillus acidophilus ( 99,5 % de similarité ; numéro d'accès : AY773947.1).Une seule des trois souches a été sélectionnée pour préparer le symbiotique et effectuer les tests suivants. La souche Streptococcus thermophilus 1c2 a été rejetée car elle présentait un faible taux de croissance. Parmi les deux souches restantes, la souche Lactobacillus bul-garicus 6c3 a été sélectionnée car elle présentait de meilleures fonctionnalités probiotiques et caractéristiques de sécurité que la souche Lactobacillus acidophilus VIIc2.
2.3. Effet du synbiotique sur la créatinine sanguine et IS(Sulfate d'indoxyle)Niveaux
Le probiotique L. bulgaricus 6c3 a été lyophilisé en association avec les prébiotiques Inuline et FOS, soit la concentration du probiotique 10 degrés UFC/g de produit lyophilisé. Dix grammes de symbiotique ont été administrés quotidiennement, dans l'eau de boisson, au groupe de rats Sprague-Dawley traités par symbiotiques néphrectomisés (Lac). Le groupe non traité néphrectomisé (Nef) et le groupe témoin non néphrectomisé n'ont pas reçu le syn-biotique. Créatinine sérique et IS(Sulfate d'indoxyle)les niveaux des rats ont été mesurés par HPLC au début (une semaine après la néphrectomie) et à la fin de l'essai. De plus, les hématocrites des animaux de tous les groupes ont été enregistrés. La variation des taux de créatinine sérique à la fin du test était significativement différente (p<0.05) in="" the="" nef="" and="" lac="" groups,increasing="" 127%and="" 121%,="" respectively,="" when="" compared="" to="" their="" initial="" values(figure="" 1).="" the="" control="" group="" showed="" a="" non-significant="" creatinine="" increase="" of="" only="" 2%.="" the="" increase="" of="" creatinine="" serum="" levels="" in="" the="" nef="" and="" lac="" groups="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" control="" group="" but="" not="" significantly="" different="" between="" the="" nef="" and="" lac="" groups.="" nevertheless,="" all="" three="" groups="" maintained="" their="" creatinine="" levels="" within="" de="" normal="" limits="" for="" these="" rats.="" on="" the="" other="" hand,="" serum="">(Sulfate d'indoxyle)les niveaux n'ont augmenté de manière significative que dans le groupe Nef correspondant aux animaux néphrectomisés (déficients rénaux) n'ayant pas reçu le symbiotique (38,8 pour cent )(p<0.05).>(Sulfate d'indoxyle)les niveaux ont montré une augmentation non significative de 0,5 % dans le groupe témoin et une diminution non significative de 0,8 % dans le groupe Lac (Figure 2). Lorsque les groupes d'animaux néphrectomisés ont été comparés, le groupe ne consommant pas le symbiotique (Nef) a montré un niveau significativement plus élevé d'IS(Sulfate d'indoxyle)en comparaison avec le groupe ayant consommé le symbiotique (Lac). Il n'y avait pas de différence significative entre le groupe Lac et le groupe témoin. L'analyse des données à la recherche d'une éventuelle corrélation entre la créatinine et l'IS(Sulfate d'indoxyle)les niveaux ont montré que cette corrélation n'était pas présente (Matériel supplémentaire : Figures S1-S3). Enfin, les résultats des hématocrites n'ont montré aucune différence significative entre les trois groupes (Figure 3).
Figure 1. ( a ) Taux de créatinine sérique de rats Sprague-Dawley au début et à la fin des 16 semaines d'administration du symbiotique. (b) Différences des moyennes des concentrations finales de créatinine avec des intervalles de confiance simultanés à 95 % de Tukey (si un intervalle ne contient pas zéro, les moyennes correspondantes sont significativement différentes). Nef : rats néphrectomisés ne recevant pas le synbiotique, Lac : rats néphrectomisés recevant le synbiotique, Témoin : rats néphrectomisés de façon fictive.
Figure 2.(a) Sérumsulfate d'indoxyle(IS) des rats Sprague-Dawley au début et à la fin des 16 semaines d'administration du symbiotique. (b) Différences des moyennes pour l'IS final(Sulfate d'indoxyle)concentrations avec des intervalles de confiance simultanés de Tukey à 95 % (si un intervalle ne contient pas zéro, les moyennes correspondantes sont significativement différentes). Nef : rats néphrectomisés ne recevant pas le synbiotique, Lac : rats néphrectomisés recevant le synbiotique, Témoin : rats néphrectomisés simulacrement.
2.4.L'analyse histologique a montré que l'administration du sybiotique diminuait la progression de l'IRC
À la fin de l'expérience, les rats ont été euthanasiés pour obtenir des échantillons de la gauchereinset les cœurs à traiter pour l'analyse histologique. La zone fibrotique a été déterminée par la coloration au trichrome de Masson (MT) à l'aide de l'outil informatique Image-Pro Plus 3.0 (Media Cybernetics, Rockville, MD, USA) pour calculer le pourcentage de zone endommagée (c'est-à-dire fibrotique) (Tableau 2) et par microscopie d'excitation à deux photons, une méthode qui détecte le collagène par l'émission de deux photons, amenant le collagène à générer une deuxième harmonique, qui peut être visualisée par microscopie confocale obtenant une image spécifique proche de l'organisation et distribution du collagène à l'intérieur du tissu. En comparant les zones fibrotiques des reins, évaluées par la coloration MT, il a été possible d'observer que les zones fibrotiques étaient 25% plus grandes dans le groupe Nef mais seulement 12% plus grandes dans le groupe Lac, administré le snbiotic par rapport au sham- animaux témoins néphrectomisés. Les lésions observées avec cette procédure de coloration étaient localisées au niveau de la couche pariétale de la capsule de Bowman et de la membrane basale des tubules contournés proximaux et distaux des animaux des groupes Nef et Lac. Dans le cas du groupe Nef, y compris les animaux n'ayant pas reçu le synbiotique, une perte de cytoplasme des cellules des tubules contournés a été observée avec développement concomitant de tissu fibrotique. Lorsque les tissus des reins ont été analysés par microscopie d'excitation à deux photons, le collagène a été observé dans tous les échantillons ayant une conformation de type maillage. Les groupes Nef et Lac ont montré plus de lésions que le groupe témoin, dans lequel une seule zone fibrotique a été retrouvée (Figure 4). Aucune lésion n'a été trouvée dans les corpuscules rénaux dans aucun échantillon lorsqu'elle a été observée sous microscopie d'excitation à deux photons.
Tableau 2.Pourcentage de surface fibreuse dans le trichrome de Masson coloréun reincoupes histologiques. Les résultats sont exprimés en moyenne plus erreur standard.
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| Figure 3.Valeurs d'hématocrite de rats Sprague-Dawley à la fin des 16 semaines d'administration du symbiotique. Nef : rats néphrectomisés ne recevant pas le synbiotique, Lac : rats néphrectomisés recevant le synbiotique, Témoin : rats néphrectomisés simulacrement. | Figure 4.Coupes histologiques de reins de rats Sprague-Dawley.(AC) : Coloration trichrome de Masson des néphrons. Les zones fibrotiques sont observées en bleu (flèches). (DF) : même tissu observé par microscopie d'excitation à deux photons. Le tissu fibrotique est observé en vert. Nef : rats néphrectomisés ne recevant pas le synbiotique, Lac : rats néphrectomisés recevant le synbiotique, Témoin : rats néphrectomisés simulacrement. Barre d'échelle∶ 100 μum pour les micrographies （AC） et 50 μm pour les micrographies （DF）. |
2.5.L'administration du synbiotique n'a pas atténué la fibrose cardiaque
Au niveau du cœur, la coloration MT a montré la présence de zones fibrotiques dans les tissus des rats néphrectomisés, alors que ces zones étaient absentes chez les animaux témoins. L'induction de l'IRC chez le rat génère une fibrose cardiaque qui n'a pas été prévenue par l'administration du traitement synbiotique chez le rat néphrectomisé (Figure 5).
Figure 5.Coloration au trichrome de Masson (MT) du cœur de rats Sprague-Dawley. Les zones fibrotiques sont colorées en bleu (flèches). Nef : rats néphrectomisés ne recevant pas le synbiotique, Lac : rats néphrectomisés recevant le synbiotique. Témoin : rats ayant subi une néphrectomie fictive. Barre d'échelle 100 um.
