PARTIE Ⅰ : le processus inflammatoire module l'expression et la localisation de WT1 dans les podocytes, entraînant des lésions rénales
Mar 23, 2022
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MARIELA ARELLANO-RODRÍGUEZ, PABLO ZAPATA-BENAVIDES & ET AL.
Introduction
Gène -1 de la tumeur de Wilm(WTI) est l'un des principaux gènes impliqués dans la survie des podocytes et l'inefficacité de la filtration rénale. Les processus inflammatoires entraînentun reinéchecet cela pourrait éventuellement se produire par la modulation de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm). WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) code pour un facteur de transcription, une protéine à doigt de zinc qui possède quatre isoformes majeures par épissage alternatif dans l'exon 5(17AA±) et l'exon 9(KTS±)(1). L'isoforme KTS a une plus grande affinité pour l'ADN, KTS plus co-localise avec les protéines de spliceosome dans le cytoplasme (2, 3).WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) joue un rôle crucial dans l'embryogenèse, principalement dans les gonades etun reindéveloppement; chez l'adulte, son expression est limitée aux cellules viscérales spécialisées duun rein(podocytes) et est essentiel pour le maintien et la modulation de plusieurs gènes, tels que la podocalyxine, la néphrine (NPHS1) et le facteur de transcription à boîte appariée (4-6). Les mutations ou la réduction de l'expression de WTl peuvent conduire à une expression réduite de la néphrine et de la podocalyxine et sont associées à des néphropathies telles que la glomérulosclérose(5, 7-10).
Le syndrome néphrotique est le syndrome rénal le plus fréquent chez l'enfant, sa classification histologique est Changement néphrotique minimal, glomérulosclérose segmentaire focale et sclérose mésangiale diffuse, et selon son étendue de la réponse aux stéroïdes est classé comme un syndrome néphrotique sensible et résistant (11) .
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Mutation de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) est fréquemment signalé chez les enfants atteints du syndrome néphrotique résistant aux stéroïdes, une maladie rare qui touche 10-15 % des patients atteints du syndrome néphrotique(12,13). Environ 80 pour cent de tous les enfants atteints du syndrome néphrotique sporadique répondent au traitement stéroïdien, cependant, aucune mutation n'a été trouvée dans WT1 (Gène -1 de la tumeur de Wilm) dans une vaste étude de cohorte(14).Réduction de l'expression du syndrome néphrotique cortico-résistant et dans une moindre mesure chez les patients atteints du syndrome néphrotique cortico-sensible(15).Dans un modèle murin d'inflammation systémique induite par le lipopolysaccharide (LPS), 24 h après l'administration du LPS, WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) a été transloqué vers le cytoplasme et a été associé à une diminution de l'expression de la néphrine, un élément clé pour le maintien du diaphragme à fente dans les podocytes et essentiel pour une filtration glomérulaire correcte, montrant ainsi WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) agit comme un facteur de transcription pour la régulation positive du gène de la néphrine(16).
Dans les cellules cancéreuses du poumon A459 traitées avec le facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa), la translocation de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) protéine au cytoplasme a été observée, suggérant qu'un stimulus inflammatoire peut altérer sa localisation intracellulaire et sa fonction transcriptionnelle (17). La phosphorylation peut jouer un rôle dans la modulation de l'activité régulatrice transcriptionnelle de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) par interférence avec la translocation nucléaire, ainsi que par inhibition de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) Liaison à l'ADN (18) par la phosphorylation médiée par la protéine kinase dépendante de l'AMPc de Ser-365 et Ser-393 dans le domaine du doigt de zinc (19).
La septicémie est le résultat de la réponse inflammatoire systémique et se caractérise par la libération de cytokines pro- et anti-inflammatoires induites par l'infection. Les lésions rénales aiguës sont fréquentes chez les patients gravement malades en présence d'une inflammation aiguë et ont un lien étroit avec la progression des lésions rénales chroniques (20,21). Il existe des preuves que l'inflammation joue un rôle important dans les lésions de divers organes, y comprisreins(22). Dans ce travail, nous avons évalué l'effet des cytokines pro-inflammatoires sur la modulation de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) et sa translocation vers le cytoplasme.
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Matériaux et méthodes
Modèle animalier. Des souris BALB/c femelles (8-10 semaines) ont été obtenues auprès de Harland Mexico (Mexico, Mexique). Les souris ont été mises en cage sous température ambiante, humidité et lumière contrôlées (cycle lumière-obscurité 12/12h) avec de l'eau et de la nourriture à volonté. LPS d'Escherichia coli O111: B4 (Sigma Aldrich, Toluca, Mexico, Mexique) et un l'injection de LPS a été administrée à la dose de 8 mg/kg par voie intrapéritonéale(16) ; la solution saline a été utilisée pour les souris témoins non traitées. Les souris ont été sacrifiées avec une injection intrapéritonéale de 200 mg/kg de solution de pentobarbital sodique à 12, 24, 36, 48 et 72 h, avec n=5 à chaque instant, puisun reindes tissus et du sang ont été prélevés. L'urine a été recueillie avant de sacrifier les animaux.
Deux souris pourun reinles explants ont été injectés avec 1 mg/kg de LPS tous les 2 jours pour induire uneun rein blessurecomme contrôle positif (21). Toutes les expériences ont été réalisées conformément à l'approbation préalable du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la Faculté des sciences biologiques (CEIBA-2016-034).
Un reinexplants. Duun reinde souris BALB/c, des tranches de tissu 250-300 um d'épaisseur ont été préparées avec une trancheuse de tissu Krumdieck (Alabama Research and Development, Munford, AL, USA) à 4 degrés avec le flux constant de tampon de bicarbonate de Krebs Henseleit (KB) qui a été aéré avec 5 pour cent de CO2. Les tranches ont été récoltées dans un tampon KB à 4 degrés.Un reinles explants ont été étalés dans des plaques 12-puits avec du milieu d'Eagle modifié de Dulbecco/milieu F12 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal et de 5 % d'agent antibiotique-antifongique, et incubés à 37 °C, avec 5 % de CO et sous agitation à 25 °C. tr/min. Les explants ont été traités avec 10 ng/ml de TNFa(R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), 20 ng/ml d'interleukine 1 (IL1 ; R&D Systems) et 100 ng/ml de LPS et analysés à 6, 12 et 24h plus tard.
Protéine urinaire. Des échantillons d'urine ont été prélevés à chaque instant ci-dessus. La concentration en protéines a été mesurée à l'aide du kit DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) et l'albuminurie a été évaluée par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide et basée sur la taille de la bande d'albumine sérique bovine (16).
Cytokines pro-inflammatoires. Les niveaux d'IL6, d'IL1 et de TNFa ont été mesurés à l'aide de kits de dosage immuno-enzymatique sandwich (PeproTech, Mexico, Mexique).
Réaction en chaîne par polymérase quantitative (qPCR). L'ARN total a été isolé des tissus rénaux à l'aide du réactif Trizolw (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) conformément aux instructions du fabricant. L'ADNc simple brin a été synthétisé par transcription inverse à l'aide du kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) conformément aux instructions du fabricant. La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide du système de PCR en temps réel 7500 (Applied Biosystems) avec des tests d'expression génique TaqMan. Des essais comparatifs de PCR en temps réel ont été effectués pour chaque échantillon en triple exemplaire. Les amorces pour WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) étaient en avant :5-TCTGCGG AGCCCAATACAG-3' ; inverse :5-CACATCCTGAATGCCTCT GAAGA-3' ; et sonde FAM :5-CACCGTGCGTGTGTATT-3'NFQ ; le protocole a été effectué à 95 degrés pendant 10 min et 40 cycles à 94 degrés pendant 30 s et 64 degrés C pendant les 30 s. L'expression relative du WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) a été calculé à l'aide de l'équation 2-AACT(23) avec le gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (Applied Biosystems) utilisé pour la normalisation.
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L'expression de l'ARNm de la néphrine a été déterminée avec 3 ug d'ADNc et les amorces suivantes : sens : 5'-CCCCAACATCG ACTTCACTT-3'et sens inverse :5'-GGCAGGACCATCCATGTAGAG-3'à 94 degrés pendant 30 s, 60 degré degré pendant 30 s et 72 degré degré pendant 30 s pendant 30 cycles (372 pb) (16). TCCACCACCC TGTTGCTGTA-3', avec les conditions de réaction suivantes : 94 degrés pendant 40 s, 60 degrés pendant 30 s et 72 degrés pendant 40 s pendant 35 cycles (452 bp). Expression de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) : 5'-CACATGAGAGAAACGCCCCTTCATGTG-3', 5'-TTTGAGCTGGTCTGAACGAGAAA-3' à 94 degrés pendant 40 s, 64 degrés pendant 30 s et 72 degrés pendant 30 s pendant 35 cycles (160 bp). L'expression de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) isoformes KTS± et 17 AA± (amorces F2-R2 pour détecter 17 AA plus /-et F3-R3 pour détecter les isoformes KTS plus /-épissage) a été réalisée par PCR conventionnelle selon Oji et .al.(24). La détermination de l'expression de -actine a été réalisée selon Laux et al. (25). Les produits ont été observés en utilisant une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10 % pour l'isoforme KTS+ et un gel d'agarose à 2 % pour l'isoforme 17AA+.
Immunofluorescence. Lareinsdes souris traitées au LPS et des témoins ont été fixés dans du formol à 10% et traités pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, l'immunohistochimie et l'immunofluorescence.
Pour déterminer l'emplacement de WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) chez des souris traitées avec du LPS,{{0}}des sections de tissu rénal d'une épaisseur de um montées sur des lames de microscope ont été utilisées. Les échantillons ont été déparaffinés, perméabilisés avec du Triton X-100 [0,1 % de Triton avec 1 % de citrate de sodium dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)] et lavés trois fois avec du PBS. Les tissus ont été bloqués avec du sérum bovin fœtal à 20 % dans du PBS pendant 30 min et incubés à 4 degrés pendant la nuit avec un anticorps monoclonal anti-WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) sc{{0}}(F-6)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis) dilué à 1:100 dans du sérum bovin fœtal à 10 % dans du PBS. Après lavages avec du PBS, la présence d'anticorps liés a été identifiée par coloration avec de l'IgG de chèvre anti-souris Texas Red sc -2979 (Santa Cruz Biotechnology). Les lames ont été contre-colorées avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole. Enfin, les lames ont été montées et examinées qualitativement à l'aide d'un microscope confocal Olympus BX61W1 avec un objectif à immersion dans l'eau 40 × et du logiciel Fluoview 4.0a (Olympus, Tokyo, Japon).
Immunohistochimie. Pour déterminer le (p)-WT1( phosphoryléGène -1 de la tumeur de Wilm) dans des podocytes de souris traitées au LPS, des anticorps polyclonaux anti-p-WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) sérine 393,sc-12933 et 363,sc-12934-R(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ont été utilisées. Des lames contenant des coupes de 4-μm de tissu rénal ont été déparaffinées et perméabilisées L'immunohistochimie a été réalisée à l'aide d'Universal Quick Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) selon le protocole du fabricant. Les lames ont été examinées à l'aide d'un microscope optique avec un objectif à immersion d'huile 100× (Primo Star, Carl Zeiss, GmbH, Allemagne) .
Western blot. La protéine totale a été isolée avec 200 ul de tampon de lyse (1% Triton, 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7,6) et la concentration a été mesurée à l'aide d'un kit DC Protein Assay (Bio-Rad). La protéine (50 ug) a été séparée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 12 % et analysée par Western blot avec WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) [F6] anticorps sc-7585(Santa Cruz Biotechnology). Les échantillons ont été normalisés à l'aide d'anti-GAPDH (AB2302 ; Sigma, San Louis, MO, USA). Les protéines ont été visualisées à l'aide d'un système Lumi-Light Western Blotting sc-2048(Santa Cruz Biotechnology).
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Résultats
Intronisation deun reindégâtschez les souris BALB/c par le LPS. Il est bien établi que la lésion des podocytes est associée à une protéinurie accrue. L'albumine et les protéines totales dans l'urine ont été déterminées par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide et kit de dosage des protéines DC (Bio-Rad). Une augmentation significative (p=0.001) de l'albumine urinaire a été observée 12 h après le traitement au LPS, avec une augmentation maximale à 24 h (215,87 ± 1,41 ug/ml) par rapport au témoin (15,53 ±5,0 ug/ml）（Figure 1A）. La concentration de protéines urinaires totales a atteint un pic à 36 h (26,02 ± 2,43 mg/ml) et était significativement plus élevée par rapport au témoin (p=0.01) comme le montre la figure 1. Les dommages rénaux induits par le LPS ont été analysés par histologie À 24 h après le traitement, une glomérulonéphrite focale a été observée dans le tissu rénal, les dommages les plus importants étant observés à 36 h, augmentant la taille du glomérule, avec mésangial prolifération cellulaire A 48 h après, une récupération progressive du glomérule a été observée jusqu'à 72 h, comme le montre la figure 1C.
Figure 1. Effet de l'inflammation systémique sur le rein.Concentrations d'albumine urinaire (A) et de protéine urinaire (B) en tant que marqueurs de lésions rénales chez des souris traitées avec du lipopolysaccharide. C : Une image représentative de l'histologie rénale de souris (coloration à l'hématoxyline et à l'éosine) à différents temps (12,24,36,48 et 72 h) après injection de lipopolysaccharide, avec la comparaison d'un modèle d'inflammation chronique, grossissement 100x. Significativement différent à : *n<><0,0]><0.00>
Production des cytokines pro-inflammatoires TNFa et IL1 dans le sérum de souris traitées au LPS. Pour confirmer que des lésions rénales ont été induites par le LPS, les niveaux de cytokines pro-inflammatoires ont été mesurés par dosage immuno-enzymatique. Une augmentation du TNFa et de l'I1 a été observée après 12 h(3,6±0.9 ng/ml, 11,9±5ng/ml) et jusqu'à 36h(4,44±0.1 ng/ml,18 ±0.9 ng/ml respectivement) de traitement avec LPS, commençant à décliner par la suite (Figure 2A et B). L'expression de l'IL6 a augmenté à 12 h (49,5 ng/ml) et 36 h (23,5 ng/ml) après le traitement, ce qui est significativement plus élevé que le témoin (figure 2C).
Figure 2. Évolution dans le temps des taux de cytokines pro-inflammatoires facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa).(A), interleukine 1 (LL1)(B) et IL6(C) dans le sérum de souris après administration intrapéritonéale de lipopolysaccharide. Significativement différent à : *p Inférieur ou égal à 0.05,**p Inférieur ou égal à 0.01 et ***p Inférieur ou égal à 0,001 .
Expression du gène WTI dans le tissu rénal de souris traitées au LPS. Afin de répondre à notre question centrale de savoir si WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) était modulée par le processus inflammatoire, ce qui avait des effets rénaux, l'expression totale du WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) a été déterminé dans des échantillons rénaux de souris présentant une inflammation systémique à différents moments au cours de l'inflammation. WT1(Gène -1 de la tumeur de Wilm) l'ARNm était plus faible à tout moment analysé par rapport au contrôle, avec l'expression relative la plus faible à 36 h et la plus élevée à 12 h après l'induction de l'inflammation systémique comme le montre la figure 3A. De plus, il a été déterminé si le traitement avec les LP induit une modification de l'expression de l'exon5 de l'isoforme (17 AA±) et du KTS± du WTI par PCR. Les données ont montré qu'il n'y avait pas de dérégulation de l'expression de ces isoformes car le même comportement a été observé que le groupe témoin sans traitement tout au long du processus inflammatoire systémique induit par le LPS (Figure 3B). La protéine WT1 a été montrée par Western blot pour diminuer tout au long du processus inflammatoire, avec une légère récupération à 36 h après le traitement, cependant, la quantité de WT1 était inférieure à celle du témoin non traité (Figure 3C et D).
Figure 3. Effet du lipopolysaccharide (LPS) sur l'expression du gène de la tumeur de Wilms I (WT1) dans le tissu rénal de souris présentant une inflammation systémique.A : Expression relative de l'ARNm du WTI.B : Expression relative des isoformes KTS± et 17IAA± du WT1.C : Niveaux de protéine WTI par immunotransfert après traitement au LPS et D : Densité d'immunotransfert pour le WT1. Significativement différent à :**p Moins supérieur ou égal à 0.01 et ***p inférieur ou égal à 0,001,
Phosphorylation et localisation du WTI dans les biopsies rénales de souris traitées au LPS. Un événement important dans la modulation post-traductionnelle de la protéine WTI est la phosphorylation de l'acide aminé 393, qui induit le déplacement de la protéine vers le cytoplasme. La phosphorylation et la localisation de WT1 dans des échantillons de rein de souris traitées avec du LPS ont été déterminées. La phosphorylation de WT1 a été analysée par histochimie, indiquant la présence de WT1 phosphorylé dans le cytoplasme des cellules dans des coupes de tissu rénal commençant 12 h après l'induction de l'inflammation systémique et se maintenant jusqu'à 72 h. WT1 a été phosphorylé aux acides aminés 393 et 363 comme le montre la figure 4A. La localisation de la protéine WT1 a été analysée par immunofluorescence. L'emplacement de WT1 dans les podocytes dans les échantillons de rein de souris traitées au LPS était principalement cytoplasmique, alors que dans les podocytes des échantillons témoins, l'emplacement n'était pas clair (figure 4B).
Figure 4. Phosphorylation et localisation de la tumeur de Wilms I (WTI) dans des échantillons de rein de souris traitées au lipopolysaccharide.A : Coloration immunohistochimique pour le (p)-WTI phosphorylé montrant une augmentation des phosphorylés à la sérine 393 et 363 à partir de 12 h après l'administration de LPS (grossissement 100x au microscope optique). B : Localisation du WTI par immunofluorescence dans le rein ; exemples montrant une localisation nucléaire mineure de WT1 (carrés) 36 h après l'administration de lipopolysaccharide (grossissement 40 x au microscope confocal). DAP1 : 4, 6-Diamidino-2-phénylindole.
Modulation de l'expression du WTI et de la néphrine dans les reins de souris traitées au LPS. La localisation de WT1 dans la cellule influence son activité biologique. Il a été rapporté que le WT1 cytoplasmique n'exerce pas d'activité transcriptionnelle ; pour cette raison, l'expression de l'ARNm de WT1 et de la néphrine a été analysée par PCR dans des échantillons de rein de souris traitées avec du LPS (Figure 5A). La PCR a indiqué une diminution de l'ARNm de la néphrine de 24 à 48 h, avec une augmentation à 72 h (Figure 5B ), tandis que l'expression de l'ARNm du WTI a augmenté à 12 h puis a diminué pendant les heures critiques d'inflammation et de lésions rénales (24 et 36 h) et (Figure 5B).
Figure 5. Analyse de l'expression de l'ARNm de la néphrine (NPHS1) et de la tumeur de Wilms 1 (WT1).A: Dans l'analyse de l'expression de l'ARNm, NPHSI et WTI ont diminué à 24, 36 et 48 h après l'induction d'une inflammation systémique à l'aide de lipopolysaccharide. B : Quantification des bandes représentées en A par densitométrie et normalisées par expression à la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase.
Les explants de rein traités au TNFa et à l'IL1 modulent l'expression du WTI et de la néphrine. Pour déterminer si les cytokines modulent l'expression de WT1, des explants rénaux ont été cultivés et traités avec les cytokines TNFa et IL1 pendant 6, 12 et 24 h pour analyser l'expression de WT1 et de la néphrine par PCR. L'expression de l'ARNm de la néphrine a diminué et l'expression de l'ARNm du WTI a augmenté à 24 h dans les explants rénaux traités avec le TNFa et l'ILlb (Figure 6).
Figure 6. Analyse de l'expression de la néphrine (NPHS1) et de l'ARNm de la tumeur de Wilms 1 (WT1) dans des explants rénaux.A : Niveaux d'expression des ARNm de NPHSi et de WTI à différents moments dans des explants rénaux exposés à 10 ng/ml de facteur de nécrose tumorale alpha (TNF) et à 20 nglml d'interleukine 16 (IL16)B : Expression relative obtenue à l'aide de l'analyse densitométrique du signal produit. Les bandes ont été quantifiées par normalisation à la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase.
Localisation du WTI dans les explants rénaux par immunofluorescence. Pour déterminer si TNFa et IL étaient responsables du changement de localisation de la protéine WT1, des explants de rein de souris ont été traités avec TNFa et L1 et LPS pendant 24 h. Dans les explants traités avec ILlb et LPS, une localisation noyau/cytoplasmique de la protéine WTl était apparente, et dans les explants traités avec TNFa, une localisation cytoplasmique de la protéine WT1 a été observée ; pendant ce temps, chez les témoins non traités, une localisation principalement nucléaire de WT1 a été observée (Figure 7).
Figure 7. Localisation de la protéine Wilms'tumor 1(WTI) par immunofluorescence à l'aide de Red TX (WT1) et de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)(noyau) dans les podocytes d'explants rénaux traités avec l0 ng/ml de facteur de nécrose tumorale alpha (TNFa), 20 ng/ml d'interleukine 16 (L1B) et de lipopolysaccharide (LPS).Localisation nucléaire réduite de WTas montrée dans les explants traités avec TNFa par rapport à la localisation nucléaire/cytoplasmique de WTI sous traitements IL1 et LPS. Grossissement, 40×.
