Part1 Les mutations ERCC1 entravent la réparation des dommages à l'ADN et provoquent un dysfonctionnement du foie et des reins chez les patients

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Katja Apelt et al

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Introduction

Les six milliards de paires de bases du génome humain sont continuellement exposées à des agents endommageant l'ADN, provoquant une grande variété de lésions de l'ADN génomique, notamment des photoproduits induits par la lumière UV, des liaisons croisées intra- et interbrins (ICL) et des doubles-liens d'ADN. ruptures de brins (DSB). Pour assurer l'intégrité génomique, ces lésions de l'ADN doivent être réparées de manière spécifique et efficace. Différents mécanismes de réparation de l'ADN ont évolué, chacun agissant sur un sous-ensemble spécifique de lésions de l'ADN. Alors que de nombreuses protéines de réparation de l'ADN sont impliquées dans une seule voie, l'endonucléase hétérodimériqueERCC1-XPF est partagé entre plusieurs voies de réparation de l'ADN mécaniquement distinctes (Manandhar et al., 2015).

Le XPF est instable et se dégrade rapidement, ce qui est empêché par son hétérodimérisation avecERCC1(Biggerstaff et al., 1993). L'interaction entre ces deux protéines est médiée par un motif double hélice-hélice en épingle à cheveux (HhH)2 situé dans leur extrémité C-terminale respective, ainsi que par le domaine central deERCC1, et le domaine nucléase de XPF (de Laat et al., 1998b ; Jones et al., 2020 ; Tripsianes et al., 2005 ; Tsodikov et al., 2005). La liaison à l'ADN double brin est facilitée par ERCC1, tandis que XPF assure la médiation de l'association avec l'ADN simple brin (ssDNA) via son domaine (HhH)2 (Tsodikov et al., 2005). Une fois positionné, le XPF utilise son activité catalytique grâce à son motif nucléase hautement conservé pour cliver différents substrats d'ADN au niveau des 59 jonctions de bulles et des 39 surplombs simple brin s'étendant à partir d'une double hélice d'ADN (de Laat et al., 1998a; Enzlin et Sch¨ are, 2002 ; Matsunaga et al., 1996). Un rôle clé de l'ERCC1- XPF a été démontré pour la première fois dans la réparation par excision de nucléotides (NER), où il clive l'ADN endommagé 59 à la lésion (Sijbers et al., 1996a).

Le NER reconnaît une grande variété de lésions de l'ADN structurellement indépendantes, y compris les photoproduits induits par les UV, via ses deux sous-voies : la réparation globale du génome (GGR) et la réparation couplée à la transcription (TCR). La majeure partie de l'activité NER repose sur GGR, où la protéine XPC reconnaît les photoproduits dans tout le génome et recrute le complexe du facteur de transcription IIH (TFIIH) (Sugasawa et al., 1998; Volker et al., 2001). Les lésions de l'ADN qui provoquent le blocage de l'ARN polymérase II (RNAPII) pendant la transcription déclenchent le recrutement de protéines spécifiques au TCR, telles que CSB, CSA et UVSSA, qui à leur tour recrutent le complexe TFIIH (Nakazawa et al., 2020 ; van der Weegen et al., 2020). Suite au recrutement de TFIIH dans la lésion de l'ADN, GGR et TCR se dirigent vers un mécanisme moléculaire commun impliquant l'association de XPA et XPG (Marteijn et al., 2014), qui stimulent l'activité hélicase de TFIIH et forment un complexe de précision stable avec RPA ( Kokic et al., 2019 ; Riedl et al., 2003 ; Wakasugi et Sancar, 1998). LaERCC1-L'hétérodimère XPF est recruté dans le complexe NER par XPA via le domaine de liaison XPA deERCC1(Tsodikov et al., 2007 ; Volker et al., 2001). Une double incision par l'activité coordonnée des endonucléases XPF (59 de la lésion) et XPG (39 de la lésion) libère un tronçon d'ADNsb contenant la lésion d'ADN (Li et al., 1995 ; Matsunaga et al., 1995 ; O 'Donovan et al., 1994 ; Staresincic et al., 2009), après quoi l'écart généré est rempli et ligaturé pour terminer la réparation.

En plus du NER, il a été montré queERCC1-XPF joue également un rôle essentiel dans la réparation ICL (Klein Douwel et al., 2014). Cette voie de réparation est initiée par une réplication bloquée et implique la reconnaissance de la fourche de réplication bloquée par l'ICL par le complexe d'anémie de Fanconi (FA) à noyau multiprotéique, qui sert de complexe E3 ubiquitine ligase pour FANCD2. La mono-ubiquitylation de FANCD2 déclenche le recrutement de SLX4, qui à son tour cibleERCC1-XPF aux ICL (Abdullah et al., 2017 ; Klein Douwel et al., 2014 ; Walden et Deans, 2014 ; Wood, 2010). Une fois recruté, ERCC1-XPF assure le décrochage de l'ICL en incisant le brin d'ADN parental de chaque côté de la lésion pour permettre un contournement et une réparation ultérieurs de la lésion (Kuraoka et al., 2000). Enfin, ERCC1-XPF a également été impliqué dans la réparation des DSB par recombinaison homologue (Ahmad et al., 2008), au cours de laquelle il peut cliver efficacement différents intermédiaires de recombinaison (Wyatt et al., 2017). Alternativement, les cellules utilisent la voie d'annelage simple brin dépendante de RAD 52- sujette aux erreurs, qui implique l'annelage de régions avec microhomologie et l'élimination ultérieure des 39 queues d'ADNsb non homologues parERCC1-XPF (Adair et al., 2000 ; Li et al., 2013, 2019). Cependant, le rôle précis d'ERCC1-XPF dans ces voies de réparation DSB n'est pas entièrement compris.

L'importance des voies de réparation de l'ADN est soulignée par le phénotype clinique des personnes atteintes de troubles héréditaires de la réparation de l'ADN. L'inactivation de GGR entraîne Xeroderma pigmentosum (XP ; MIM 278700, 610651, 278720, 278730, 278740, 278760 et 278780 ; DiGiovanna et Kraemer, 2012), qui se caractérise par une photosensibilité et un risque multiplié par 2000- du cancer de la peau. Une neurodégénérescence, un retard de croissance et une maladie multisystémique sans cancer de la peau sont observés dans le syndrome de Cockayne (CS ; MIM 216400 et 133540). Les patients atteints de CS ont un défaut génétique sélectif dans le TCR qui empêche le traitement du RNAPII bloqué par les dommages à l'ADN (Karikkineth et al., 2017 ; Nakazawa et al., 2020 ; Nakazawa et al., 2012 ; Ribeiro et al., 2018 ; Tufegdˇzi´ c Vidakovic et al., 2020). Mutations dans les gènes de réparation ICL essentiels Cause FA (MIM 227650, 300514, 227645, 605724, 227646, 600901, 603467, 614082, 609053, 609054, 614083, 614087, 610832, 613390 , malformations d'organes et instabilité génomique (Auerbach, 2009). Le rôle deERCC1-XPF dans la réparation de l'ICL est souligné par l'existence de mutations dans XPF qui donnent lieu au phénotype FA (Bogliolo et al., 2013 ; Ceccaldi et al., 2016 ; Kashiyama et al., 2013). Les défauts héréditaires de la réparation des DSB provoquent un large éventail de troubles associés à la radiosensibilité, à la prédisposition au cancer, à l'immunodéficience et à la neurodégénérescence (Helfricht et al., 2020 ; McKinnon et Caldecott, 2007).

Les troubles de réparation de l'ADN-déficit sont rares et surviennent avec une fréquence estimée à ∼1 pour 200000 naissances vivantes dans le monde pour XP, CS et FA. Cependant, seuls deux rapports d'individus porteurs de mutations bi-alléliques ERCC1 (MIM 126380) ont été décrits à ce jour (Jaspers et al., 2007 ; Kashiyama et al., 2013). Les deux individus présentaient des caractéristiques compatibles avec le CS et sont décédés à 14 mois et 2,5 ans. Le premier individu et le plus sévèrement atteint (165TOR) portait un codon stop prématuré (Q158X) sur un allèle et une variante faux-sens F231L sur l'autre (Jaspers et al., 2007). Le deuxième individu (CS20LO) était homozygote pour la variante faux-sens F231L (Kashiyama et al., 2013). Les cellules des deux individus ont montré une sensibilité aux dommages de l'ADN induits par les UV, et 165TOR, en particulier, était également légèrement sensible aux agents induisant l'ICL. Les deux individus sont décédés dans la petite enfance (1 à 2 ans ; Jaspers et al., 2007 ; Kashiyama et al., 2013). Un troisième individu (XP202DC) avec des mutations bi-alléliques ERCC1 décédé à 37 ans est cité dans un résumé de réunion (Imoto, K., et al. 2007. Patients présentant des défauts dans les protéines de réparation d'excision de nucléotides en interactionERCC1ou XPF montrent xeroderma pigmentosum avec une dégénérescence neurologique sévère d'apparition tardive. [Résumé] J. Invest. Dermatol. 127:S92). Cet individu était hétérozygote composé pour une mutation non-sens (K226X) et une mutation d'épissage dansERCC1. Une description phénotypique détaillée n'est pas disponible et l'impact de ces mutations ERCC1 est inconnu.

Le phénotype des deux individus susmentionnés est plus grave que celui attendu du seul déficit en NER, ce qui correspond à l'implication de l'ERCC1-XPF dans plusieurs voies de réparation de l'ADN. Dans cette optique, les souris ERCC1 ou XPF-KO ont présenté une létalité embryonnaire élevée et une durée de vie réduite et sont décédées en raison d'une insuffisance hépatique grave (McWhir et al., 1993; Tian et al., 2004; Weeda et al., 1997), ce qui n'est pas observé chez les souris XPA-KO déficientes en NER (de Vries et al., 1995; Nakane et al., 1995).

Dans la présente étude, nous décrivons deux frères et sœurs porteurs de mutations bi-alléliquesERCC1 qui ont un phénotype unique de petite taille, de photosensibilité, de maladie hépatique cholestatique progressive et de tubulopathie rénale. Les deux individus ont développé une insuffisance hépatique progressive et ont nécessité des transplantations hépatiques avant l'âge de 10 ans. Des études fonctionnelles montrent que le niveau de protéines à l'état d'équilibre d'ERCC1 et de XPF a été considérablement réduit dans les cellules de patients hospitalisés et dans les cellules épithéliales knock-in portant la variante faux-sens trouvée chez les patients. De plus, la protéine mutante ERCC1 n'a interagi que faiblement avec les autres protéines de réparation NER et ICL. Nous rapportons un nouveau cas de déficit en ERCC1 qui affecte fortement le NER et a un impact considérable sur la réparation de l'ICL, qui ensemble aboutissent à un phénotype unique combinant petite taille, photosensibilité et foie etdysfonctionnement rénal.

Résultats

Deux frères et sœurs présentant une photosensibilité, une petite taille et un dysfonctionnement hépatique et rénal progressif

Le frère 1 (PV50LD ; Fig. 1 A) est âgé de 13 ans, l'aîné de trois frères et sœurs de parents sains et non apparentés d'ethnies mixtes comprenant des origines australiennes, maltaises et anglo-celtiques. Pendant la grossesse, sa mère a eu une cardiomyopathie dilatée transitoire qui s'est résolue après l'accouchement. Elle est née à 39 semaines de gestation et son poids à la naissance était de 1,9 kg (Z=−3,8), sa taille de 44 cm (Z=−2,44) et son tour de tête de 29,5 cm (Z {{ 17}} -3,8). Elle avait une faible croissance pendant la petite enfance et, à l'âge de 18 mois, on a noté qu'elle souffrait d'un dysfonctionnement hépatique avec un schéma principalement cholestatique. L'échographie hépatique et la cholangiopancréatographie par résonance magnétique étaient normales. La fonction hépatique a progressivement diminué, comme en témoignent les augmentations progressives des taux de -glutamyltransférase (GGT), d'alanine transaminase (ALT) et de bilirubine (Fig. S1, A – C). Lors d'une biopsie hépatique (à l'âge de 3,5 ans), le parenchyme lobulaire a montré une variation de la morphologie nucléaire des hépatocytes, avec des noyaux beaucoup plus gros et des cellules à double noyau (Fig. S1 D) dans les zones où les cellules ont de petits noyaux sans particularité. Il y avait une légère fibrose portale et une légère expansion fibreuse du portail et une légère inflammation de l'interface focale sans ductopénie ni fibrose périductale (Fig. S1 E).

Elle a souffert d'un grand nombre d'infections récurrentes, notamment d'amygdalite, de varicelle, de fièvre aphteuse, de pneumonie, de bronchite et d'épisodes récurrents de fièvre, de douleurs abdominales et de selles pâles sans cause trouvée. Les investigations immunologiques n'ont pas identifié d'immunodéficience. Elle a développé des épisodes de photosensibilité oculaire et cutanée. À l'âge de 6 ans, un dysfonctionnement rénal a été détecté, avec des signes suggérant un dysfonctionnement tubulaire proximal caractérisé par une albuminurie (gamme sous-néphrotique) et une hypercalciurie. Sa fonction rénale fluctuait, avec des épisodes intermittents delésion rénale aiguë, progressiveinsuffisance rénaleavec des niveaux croissants de créatinine (Fig. S1 F) et une réponse minimale à l'inhibition de l'acétylcholinestérase. L'échographie rénale a montré de petitesreinsavec une échogénicité accrue et une différenciation corticomédullaire réduite. Les tests de la fonction pulmonaire ont montré une maladie pulmonaire restrictive légère à modérée.

Les étapes du développement étaient normales, mais certaines difficultés d'apprentissage étaient évidentes à l'âge scolaire sans signe de régression. La vision et l'ouïe étaient normales. La croissance est restée très lente malgré une alimentation complémentaire. Elle était relativement stable jusqu'à l'âge de 9,5 ans, lorsqu'elle présentait des signes de décompensation hépatique avec une augmentation progressive du taux de bilirubine (Fig. S1 C) et du rapport international normalisé. Elle a subi une transplantation hépatique orthotopique à l'âge de 9 ans et 10 mois. Suite à une greffe du foie, sa tubulopathie s'est stabilisée, bien que sa créatinine sérique continue d'augmenter à un rythme plus lent (Fig. S1 F). Elle est cliniquement stable. À l'âge de 12 ans, une insuffisance ovarienne a été diagnostiquée. L'imagerie par résonance magnétique (IRM) cérébrale à l'âge de 12 ans a montré une légère atrophie cérébrale avec une atrophie cérébelleuse modérée et une légère atrophie du tronc cérébral. Lors de la dernière évaluation (13,5 ans), la croissance était lente (poids 22,4 kg [Z=-6,08] et taille 134,7 cm [Z=-3,72]). Elle avait une carrure très mince avec une faible masse musculaire et une rareté de graisse sous-cutanée. Elle avait développé des taches de rousseur sur les zones exposées au soleil (Fig. 1 A). Elle avait les yeux légèrement enfoncés et ses cheveux étaient fins. Il n'y avait pas d'anomalies des rayons radiaux. L'examen neurologique a montré une légère faiblesse, une ataxie minime et des réflexes déprimés.

Le frère 2 (PV46LD ; Fig. 1 A) a 11 ans, une sœur cadette du frère 1. La grossesse a été compliquée par un placenta praevia et une cardiomyopathie maternelle transitoire, et le frère 2 est né à 35 semaines de gestation avec un poids à la naissance de 1,79 kg (troisième centile), une longueur de 45 cm (50e centile) et une circonférence avant de 29 cm (inférieure au troisième centile). Elle avait un manque de graisse sous-cutanée et des traits faciaux similaires à ceux de son frère aîné. Elle a présenté un retard de croissance au cours de la première année de vie et une insuffisance hépatique à partir de 2 ans, avec une augmentation significative des taux de GGT, d'ALT et de bilirubine (Fig. S1, A – C). La biopsie hépatique à l'âge de 6 ans a montré des dommages aux voies biliaires intrahépatiques, entraînant une fibrose péricanalaire. Comme pour la biopsie du foie de sa sœur, un nombre modéré d'hépatocytes à double noyau a été observé, certains avec de gros noyaux et de gros nucléoles.

Elle a eu des épisodes de photosensibilité oculaire et cutanée. Elle présentait une tubulopathie rénale avec une insuffisance rénale légère, avec une augmentation progressive des taux de créatinine (Fig. S1 F). L'échographie rénale a montré de petitesreinsavec néphrocalcinose. Les étapes du développement étaient normales, mais une déficience intellectuelle légère (QI 66) a été diagnostiquée à l'âge scolaire. Il y a eu des progrès lents avec les jalons du développement neurologique et aucune régression définitive. La vision et l'ouïe étaient normales. L'insuffisance hépatique était progressive et à l'âge de 8 ans, elle a subi une transplantation hépatique. L'IRM cérébrale à l'âge de 5 ans était normale, mais une nouvelle IRM à 10 ans montrait une atrophie cérébelleuse modérée et une atrophie cérébrale légère. À l'âge de 11 ans, la mesure des œstrogènes, de l'hormone folliculo-stimulante et de l'hormone lutéinisante a montré un schéma suggérant une insuffisance ovarienne. Lors de la dernière évaluation à l'âge de 11 ans, la croissance était lente (poids 20 kg [Z=-3,89] et taille 120,7 cm [Z=-3,17]). Elle avait une carrure très mince avec un minimum de graisse sous-cutanée et une faible masse musculaire, des traits faciaux familiaux, des yeux légèrement enfoncés et des taches de rousseur sur les zones exposées au soleil (Fig. 1 A). Elle n'avait aucune anomalie des rayons radiaux. L'examen neurologique a montré une légère faiblesse avec une ataxie légère et des réflexes absents.

L'analyse moléculaire identifie de nouvelles mutations bi-alléliques ERCC1

Exome sequencing revealed that both siblings harbor a novel missense variant in exon 4 of the ERCC1 gene (p.R156W; c.466C>T) on the paternal allele (Fig. S2 A). The presence of the c.466C>La variante T faux-sens a été confirmée par séquençage de Sanger chez les deux frères et sœurs affectés (Fig. 1 B). Le séquençage du génome entier a révélé une délétion dans l'exon 4 sur l'allèle maternel (hg19 : chr19:45,922,224- 45,924,375 ; Fig. S2 B), qui a été confirmée par PCR quantitative comparative (qPCR) de l'exon 4 et de l'exon 5 de ERCC1 chez les frères et sœurs et la mère (Fig. 1, C et D). La délétion, qui devrait être un allèle nul, n'a été détectée ni chez le père ni dans quatre échantillons témoins négatifs (Fig. 1 D).

While a previously described pathogenic ERCC1 missense variant (p.F231L; c.693C>G) est situé dans le domaine (HhH)2 (Fig. 1 E), le variant faux-sens (p.R156W) est situé dans le domaine central de ERCC1 et se trouve à proximité de la poche de liaison XPA (110–154 aa) de ERCC1 (Fig. 1E). L'analyse structurelle du domaine central d'ERCC1 a révélé une poche hydrophobe étroite en forme de V qui lie un court motif (67–80 aa) présent dans XPA (Fig. 1 F; Tsodikov et al., 2007). Les acides aminés qui tapissent la poche de liaison XPA dans ERCC1 (Fig. 1 F) sont importants pour le NER mais indispensables pour les autres voies de réparation dépendantes de l'ERCC 1- (Orelli et al., 2010). Le résidu R156 qui est substitué chez les patients est situé juste en dessous de la poche de liaison XPA et forme un pont salin avec l'acide aminé opposé D129 (Fig. 1 F). La substitution R156W affecte donc probablement la stabilité de la poche de liaison XPA. Il est possible que cette substitution affaiblisse également l'interaction entre le domaine central d'ERCC1 et le domaine nucléase de XPF (Jones et al., 2020), et nous prédirions que cela pourrait conduire à une déstabilisation légère à modérée de l'interface hétérodimère, résultant en une stabilité réduite de la protéine.

Les fibroblastes PV46LD et PV50LD présentent un grave défaut NER Une caractéristique du déficit NER est une forte sensibilité à l'irradiation UV-C. Pour traiter l'impact du déficit en ERCC1 sur la fonction NER, nous avons obtenu des fibroblastes primaires à partir de biopsies cutanées des deux frères et sœurs affectés. Pour permettre des tests de survie clonogéniques, nous avons immortalisé les cellules PV50LD en introduisant hTERT (Fig. S3 A). En guise de contrôle, nous avons généré des cellules ERCC 1- KO complètes dans des cellules RPE 1- hTERT par CRISPR-Cas9 (Fig. 2 A). Le test de survie clonogénique UV-C a montré que les cellules PV50LD-hTERT sont hypersensibles à l'irradiation UV-C, mais pas dans la même mesure que les cellules ERCC 1- KO complètes (Fig. 2 B), ce qui suggère un grave défaut de NER.

Les lésions d'ADN induites par les UV rencontrées lors de la transcription sont réparées par le TCR, qui peut être mesuré par le test de récupération de la synthèse d'ARN (RRS) (Nakazawa et al., 2010). Nous avons mesuré la RRS dans les fibroblastes 48BR (WT), les fibroblastes de patients et inclus les fibroblastes primaires déficients en XPA (XP1PD) comme contrôle. Le marquage des transcrits naissants par l'incorporation de 5-éthynyl-uridine a montré une forte diminution induite par les UV des transcrits naissants dans toutes les lignées cellulaires 3 h après UV-C. Alors que 48BR a complètement récupéré la transcription dans les 18 h après l'irradiation UV-C, les deux fibroblastes de patients ont récupéré encore moins que les cellules de patients XP-A déficientes en NER (Fig. 2, C et D), ce qui suggère que le TCR est pratiquement absent dans ces conditions.

Pour examiner l'activité GGR, nous avons mesuré la synthèse d'ADN non programmée (UDS) dans des cellules qui ne se divisent pas (Nakazawa et al., 2010). À cette fin, les fibroblastes primaires ont été irradiés localement avec de la lumière UV-C, suivis d'un marquage pulsé avec l'analogue de la thymidine 5- éthynyl-désoxyuridine (EdU) pour mesurer la réparation. L'incorporation claire d'EdU a été détectée dans les cellules 48BR aux sites de dommages locaux à l'ADN induits par les UV. Cependant, seuls de très faibles niveaux d'incorporation d'EdU étaient détectables dans les fibroblastes des patients à des niveaux similaires à ceux des fibroblastes déficients en XPA (XP1PD; Fig. 2, E et F). Les niveaux d'UDS dans les cellules PV46LD et PV50LD étaient comparables, voire inférieurs, aux niveaux mesurés dans le 165TOR déficient en ERCC 1- décrit précédemment (Jaspers et al., 2007) et CS20LO (Kashiyama et al., 2013) cellules, que nous avons inclus en parallèle (Fig. 2 G et Fig. S3 B). Il est important de noter que la réexpression de ERCC1 étiqueté par menus dans les deux fibroblastes a complètement sauvé l'incorporation d'EdU (Fig. 2, E et F; et Fig. S3 C), confirmant que le fort défaut UDS est dû à un déficit en ERCC1. Nous avons également obtenu des fibroblastes primaires des parents, qui présentaient une UDS normale sur les sites de lésions UV locales (Fig. 2 H), suggérant que le défaut ERCC1 hétérozygote respectif chez les parents est entièrement compensé par l'allèle WT.

Les fibroblastes PV46LD et PV50LD ont de très faibles niveaux de protéines ERCC1 et XPF

Le NER implique l'assemblage hautement coordonné et séquentiel de complexes de réparation de l'ADN, au cours duquel le recrutement de XPA se produit en aval de TFIIH mais en amont de ERCC1-XPF (Volker et al., 2001). Pour déterminer dans quelle mesure les fibroblastes des patients soutiennent toujours l'assemblage du complexe NER, nous avons irradié localement les fibroblastes avec des UV-C et surveillé le recrutement de plusieurs protéines NER centrales par marquage immunofluorescent (Fig. 3 A, quantification et Fig. S3 D). Un recrutement clair de TFIIH, XPA et ERCC1 sur les sites de dommages locaux à l'ADN induits par les UV a été détecté dans les cellules 48BR, tandis que les cellules XP1PD déficientes en XPA n'ont pas réussi à recruter ERCC1 comme décrit précédemment (Fig. 3 A et Fig. S3 D ; Volker et al., 2001). Les cellules PV46LD et PV50LD ont montré un recrutement normal de TFIIH et de XPA, tandis que le recrutement d'ERCC1 sur les sites de dommages locaux à l'ADN induits par les UV était indétectable (Fig. 3 A et Fig. S3 D).

La perte de localisation d'ERCC1 pourrait être due à un échec du recrutement d'ERCC1, à une réduction générale des niveaux de protéine ERCC1 ou à une combinaison des deux. L'analyse par Western blot a en effet révélé que les niveaux à l'état d'équilibre d'ERCC1 et de XPF étaient considérablement réduits dans les cellules PV46LD et PV50LD (Fig. 3 B). L'expression résiduelle d'ERCC1 était cependant toujours détectée par rapport aux cellules ERCC 1- KO complètes (Fig. 3 B). La réduction des niveaux de protéines ERCC1 et XPF dans les cellules PV46LD était très similaire aux niveaux réduits détectés dans les cellules CS20LO ou 165TOR (Fig. 3 C et Fig. S3, E et F), suggérant que le phénotype le plus sévère chez l'individu de dont ces cellules ont été dérivées n'est pas due à un impact plus fort sur la stabilité des protéines. Conformément à nos résultats UDS, nous avons détecté une expression normale de ERCC1 et XPF dans les cellules des parents, indiquant une compensation par l'allèle WT (Fig. 3 D). Le marquage immunofluorescent a confirmé que les niveaux de protéines ERCC1 et XPF étaient sévèrement réduits, tandis que les cellules des parents étaient indiscernables des cellules WT (Fig. 3 E). La quantification des données de transfert Western montre que les niveaux de protéine ERCC1 ont été réduits à environ 20 % de fibroblastes de patients hospitalisés, ce qui a également entraîné une réduction similaire des niveaux de XPF (environ 20 % ; Fig. 3 F).

L'activation de la variante faux-sens R156W entraîne une instabilité de la protéine ERCC1-XPF et un grave défaut NER

Il est tentant de supposer que les faibles niveaux de protéines à l'état d'équilibre d'ERCC1-XPF et le fort défaut de NER dans les fibroblastes de patients sont causés par la substitution d'acides aminés R156W dans ERCC1. Cependant, étant donné que les individus affectés sont frères et sœurs, nous ne pouvons pas exclure que d'autres caractéristiques génétiques partagées entre eux puissent également contribuer à ce phénotype.

To directly assess this, we decided to generate knock-in lines (KIs) carrying the R156W amino acid substitution in RPE1- hTERT cells using CRISPR-Cas9 technology. We obtained homozygous KI clones carrying the patient mutation in ERCC1 (p.R156W; c.466C>T), qui a été confirmé par séquençage de Sanger dans deux clones individuels (Fig. 4 A). La mutation faux-sens a entraîné une forte réduction des niveaux de protéines ERCC1 et XPF dans les deux clones KI (clones 2–17 et 2–51; Fig. 4 B et Fig. S4, A et B). La quantification des données de Western blot a montré que les niveaux de protéines ERCC1 et XPF étaient presque aussi bas que dans les cellules ERCC 1- KO (Fig. 4 C). Ces résultats établissent que la substitution d'acides aminés R156W a un fort impact sur la stabilité de ERCC1.

Pour établir plus avant que le défaut NER dans les fibroblastes de patients est causé par la substitution d'acides aminés R156W dans ERCC1, nous avons mesuré l'activité du TCR en surveillant le redémarrage de la transcription après une irradiation UV. Alors que les cellules parentales RPE1-hTERT ont montré un redémarrage normal 18 h après les UV, les deux clones R156W-KI ont montré un fort défaut de TCR comparable aux cellules ERCC1-KO complètes (Fig. 4, D et E). De même, les expériences UDS ont révélé une activité GGR normale dans les cellules parentales RPE1-hTERT, qui a été sévèrement réduite en dessous de 10 % dans les clones R156W-KI et les cellules ERCC1-KO (Fig. 4, F et G) . Enfin, nous avons mesuré la sensibilité aux UV d'un clone R156W-KI (2–51) par rapport au fibroblaste patient immortalisé par hTERT PV50LD. Les cellules R156W-KI ont montré un phénotype fortement sensible aux UV, mais pas aussi sensible que les cellules ERCC 1- KO complètes (Fig. 4 H). Fait intéressant, le phénotype sensible aux UV du R156W-KI était très similaire à celui des fibroblastes de patients PV50LD-hTERT. Ces résultats établissent que les faibles niveaux de protéines ERCC1-XPF et le fort défaut NER sont une conséquence directe de la substitution d'acides aminés R156W dans ERCC1.

La substitution ERCC1R156W provoque une localisation cytoplasmique partielle

Les fibroblastes du patient et les cellules KI affichent des niveaux de protéines considérablement réduits et une activité NER fortement réduite. Nous avons ensuite souhaité déterminer si le défaut NER est uniquement causé par des niveaux réduits de protéine ERCC1-XPF, ou si la protéine mutante ERCC1R156W a une activité réduite en tant qu'endonucléase ou dans NER.

Pour résoudre ce problème, nous avons généré des cellules ERCC1-KO par CRISPR Cas9 dans des cellules U2OS équipées du système Flp-In/T-Rex. À l'aide de la recombinaison dirigée par site basée sur Flp, nous avons ciblé les ADNc codant pour ERCC1WT ou ERCC1R156W étiquetés GFP sur le site cible de reconnaissance Flp (FRT) génomique pour permettre l'expression inductible à partir d'un promoteur viral puissant. L'analyse par Western blot a montré que ERCC1WT et ERCC1R156W étaient exprimés à des niveaux similaires et que l'expression de l'une ou l'autre des protéines a sauvé les niveaux réduits de protéines de XPF observés dans les cellules ERCC 1- KO (Fig. 5 A). Ces cellules constituent donc un excellent système modèle pour démêler l'impact spécifique de la substitution ERCC1R156W lorsqu'elle est exprimée aux niveaux WT de l'impact d'une expression plus faible d'ERCC1 dans les fibroblastes de patients et les cellules épithéliales KI.

Des études antérieures ont montré que les mutations faux-sens dans XPF peuvent entraîner une mauvaise localisation de ERCC1-XPF dans le cytoplasme (Ahmad et al., 2010). Dans cette optique, nous avons également détecté qu'environ 40% du pool de protéines ERCC1R156W était mal localisé dans le cytoplasme, ce qui n'était que d'environ 15% dans les cellules exprimant ERCC1WT (Fig. 5, B et C). Cette mauvaise localisation d'ERCC1 a également augmenté la fraction de XPF cytoplasmique (Fig. 5, B et C), indiquant que ERCC1R156W peut être partiellement mal replié.

Pour tester cette possibilité, nous avons effectué des expériences d'immunoprécipitation sur ERCC1WT-GFP et ERCC1R156W-GFP suivies d'une spectrométrie de masse quantitative sans étiquette (MS) pour cartographier les interacteurs différentiels des deux protéines ERCC1. Il est important de noter que la SM quantitative a confirmé que des quantités égales de protéines ERCC1WT-GFP et ERCC1R156W-GFP étaient extraites (Fig. 5 D). De manière frappante, l'interactome d'ERCC1R156W était enrichi en protéines de choc thermique (HSP), en particulier de la famille HSPA, tandis que l'interaction avec XPF était quantitativement réduite par rapport à ERCC1WT (Fig. 5 D). Les protéines HSPA sont des chaperons de repliement des protéines qui empêchent l'agrégation des protéines mal repliées (Stetler et al., 2010). Les expériences de co-immunoprécipitation (Co-IP) ont en effet confirmé que ERCC1R156W-GFP interagissait fortement avec HSPA4 par rapport à ERCC1WT (Fig. 5 E), suggérant un mauvais repliement partiel de ERCC1R156W.

Pour déterminer dans quelle mesure ERCC1R156W-XPF est toujours actif en tant qu'endonucléase, nous avons purifié le complexe recombinant à partir de cellules d'insectes Sf9 (Fig. S4 C). Notre procédure précédemment établie implique une étape de filtration sur gel qui nous permet d'évaluer si ERCC1- XPF est dans un état dimérique ou agrégé (Fig. 5 F, fractions 2 et 1, respectivement). Le rendement du complexe ERCC1R156W XPF recombinant était plus faible et présentait un niveau plus élevé de protéines agrégées. De plus, nous avons également remarqué une réduction de la fraction de protéine hétérodimérique par rapport à ERCC1WT-XPF (Fig. 5 F). Néanmoins, le recombinant hétérodimérique ERCC1R156W-XPF dans la fraction 2 était pleinement actif lorsqu'il était incubé avec un substrat d'ADN modèle tige-boucle, tandis que l'ERCC1-XPFD687A catalytiquement inactif, inclus comme contrôle négatif, était dépourvu d'activité d'incision (Fig. .5G). Ces résultats suggèrent que ERCC1R156W-XPF est partiellement mal replié et mal localisé, mais la fraction protéique qui se replie correctement est toujours active en tant qu'endonucléase.

La protéine mutante ERCC1R156W ne parvient pas à interagir efficacement avec les principaux facteurs NER

Nous avons ensuite expliqué comment la substitution ERCC1R156W affectait le NER en utilisant les cellules ERCC1-KO reconstituées. Étant donné que la substitution R156W est située juste en dessous de la poche de liaison XPA dans ERCC1 (Fig. 1 F), nous avons demandé si ERCC1R156W pouvait encore interagir avec les protéines NER en réponse à une irradiation UV. Pour tester cela, nous avons immunoprécipité ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP ou GFP fusionné à un signal de localisation nucléaire (GFP-NLS) comme contrôle à partir de cellules irradiées aux UV et ensuite effectué une SEP sans étiquette. En comparant ERCC1-GFP avec GPF-NLS, nous avons identifié des interacteurs constitutifs et induits par les UV de ERCC1. Notre analyse a révélé que ERCC1WT et ERCC1R156W interagissaient avec XPF et les protéines d'échafaudage spécifiques à la réparation ICL SLX4 et SLX4IP, bien que quantitativement réduites dans les cellules exprimant ERCC1R156W (Fig. 6, A et B). De manière frappante, l'interaction induite par les UV avec la sous-unité TFIIH XPB dans les cellules ERCC1WT a été complètement perdue dans les cellules ERCC1R156W (Fig. 6, A et B). Des expériences de co-IP ont confirmé que ERCC1R156W ne s'associait ni à TFIIH ni à XPA en réponse à une irradiation UV, tandis que des interactions robustes ont été détectées après la réduction de ERCC1WT (Fig. 6 C et Fig. S4, D et E).

Le recrutement de ERCC1-XPF aux complexes NER dépend entièrement de XPA (Volker et al., 2001), ce qui soulève la question de savoir si ERCC1R156W est toujours recruté sur les sites de dommages à l'ADN induits par les UV. Pour résoudre ce problème, nous avons surveillé le recrutement d'ERCC1-GFP dans les lésions d'ADN induites par les UV à l'aide de l'imagerie de cellules vivantes. À cette fin, les cellules ont été irradiées avec un laser UV-C (266-nm), qui a déclenché le recrutement rapide de ERCC1WT-GFP dans les 60 premières secondes suivant l'irradiation, atteignant un plateau vers 120 s (Fig. 6, D et E). En revanche, seul un très faible recrutement de ERCC1R156W-GFP a pu être détecté lors d'une irradiation UV-C dans des conditions identiques (Fig. 6, D et E). Ces résultats suggèrent que l'incapacité d'ERCC1R156W à interagir avec XPA limite considérablement son association avec le complexe NER.

Nos découvertes dans les cellules reconstituées ERCC1-KO suggèrent que ERCC1R156W supporte toujours l'activité de réparation résiduelle (∼40 %) lorsqu'elle est exprimée à des niveaux similaires à ERCC1WT. Pour tenter de mesurer la réparation résiduelle dans les fibroblastes primaires PV46LD et PV50LD, qui ont montré une expression fortement réduite de la protéine mutante ERCC1R156W, nous avons effectué des expériences UDS dans lesquelles nous avons permis aux cellules d'incorporer EdU pendant de longues périodes (4 h) pour capturer la réparation résiduelle . Alors que l'UDS était toujours inférieure à environ 10 % dans les cellules XP1PD déficientes en XPA, dans les cellules PV46LD et PV50LD, l'UDS est passée d'environ 10 % à environ 20 % UDS dans ces conditions (Fig. 6 J et Fig. S5 A). Ces résultats montrent que la protéine mutante ERCC1R156W, exprimée à de faibles niveaux dans les cellules des patients, supporte l'activité NER résiduelle, expliquant probablement les caractéristiques cliniques légères de type XP observées chez les deux frères et sœurs. Dans ces conditions, nous avons également détecté l'UDS résiduel dans les cellules 165TOR déficientes en ERCC 1- précédemment décrites (Jaspers et al., 2007) et CS20LO (Kashiyama et al., 2013) à des niveaux encore plus élevés que ceux détectés dans les cellules PV46LD et PV50LD. (Fig. 6 J et Fig. S5 A).

L'impact de ERCC1R156W dans la réparation ICL

Au cours de la réparation de l'ICL, la protéine d'échafaudage SLX4 recrute ERCC1-XPF pour effectuer les incisions de décrochage qui permettent une réparation ultérieure. Notre analyse MS a révélé que ERCC1R156W interagissait toujours avec SLX4, bien qu'à des niveaux réduits par rapport à ERCC1WT (Fig. 6, A et B). Les expériences de Co-IP ont en effet confirmé une forte interaction de ERCC1WT avec SLX4, qui n'était pas affectée par l'irradiation UV, tandis que l'interaction avec ERCC1R156W était fortement réduite (Fig. 7 A). Pour déterminer si cette interaction réduite affectait le recrutement d'ERCC1 dans les ICL, nous avons localement irradié des cellules avec un laser UV-A (365 nm) en présence de trioxsalen, qui est un dérivé du psoralène qui forme des ICL lors d'une irradiation UV (Velimezi et al. , 2018). L'irradiation locale avec le laser UV-A a déclenché le recrutement de FANCD2 endogène uniquement dans les cellules sensibilisées au trioxsalen, démontrant que les ICL étaient induites dans nos conditions (Fig. S5 B). Nous avons pu détecter un fort recrutement de GFP-ERCC1WT-GFP dans les ICL locales, tandis que le recrutement de ERCC1R156W était beaucoup plus faible (Fig. 7, B et C), ce qui suggère que la diminution de l'interaction avec SLX4 réduit également l'efficacité avec laquelle ERCC1R156W est recruté pour ICL. Cependant, des tests de survie clonogénique après exposition à l'agent inducteur d'ICL, la mitomycine C (MMC), ont montré que ERCC1R156W a sauvé l'hypersensibilité des cellules ERCC 1- KO à MMC, bien que légèrement moins que ERCC1WT (Fig. 7 D). Ces expériences montrent que la protéine mutante ERCC1R156W prend en charge la réparation ICL proche des niveaux WT lorsque la protéine mutante est exprimée à des niveaux proches de la normale.

Pour déterminer si les fibroblastes de patients PV46LD et PV50LD, qui montraient une expression considérablement réduite de ERCC1R156W, soutenaient toujours une réparation efficace de l'ICL, nous avons effectué un test de rupture de chromosome induit par MMC. Cette méthode mesure les ruptures chromosomiques induites par le MMC dans les cellules en métaphase causées par une déficience de la réparation de l'ICL. Alors que les cellules 48BR (WT) accumulaient très peu de ruptures après MMC, nous avons mesuré une rupture chromosomique significative induite par MMC dans les cellules WK8103 dérivées de patients Fanconi (Poll et al., 1984; Fig. 7 E). PV46LD et PV50LD ont tous deux montré un phénotype intermédiaire avec une augmentation de la formation de cassures en réponse à MMC, mais pas dans la même mesure que les cellules de Fanconi (figure 7E). Dans cette optique, les cellules PV50LD-hTERT et les cellules RPE1-hTERT R156W-KI étaient sensibles à la MMC dans les tests de survie clonogéniques, tandis que les cellules VU121F-hTERT déficientes en FANCF (Joenje et al., 1997) et en particulier l'ERCC{ {24}}Les cellules KO étaient hypersensibles à la MMC (Fig. 7 F). En conclusion, la faible expression de ERCC1R156W et la diminution de l'interaction avec SLX4 ont un impact considérable sur la réparation de l'ICL, bien que les cellules des patients ne soient pas aussi sensibles que les cellules Fanconi ou ERCC1-complètes. Cela explique probablement pourquoi aucune caractéristique de type FA n'est apparente chez les deux frères et sœurs.

L'impact de ERCC1R156W dans la réparation DSB

Étant donné le rôle d'ERCC1-XPF dans la réparation DSB, nous avons également déterminé dans quelle mesure ERCC1R156W prend toujours en charge ce processus de réparation. À cette fin, nous avons réalisé une imagerie de cellules vivantes après irradiation laser UV-A dans des cellules sensibilisées au BrdU pour générer des DSB locales (Lukas et al., 2003). Le recrutement de XRCC4 endogène n'a pu être détecté sur les sites d'irradiation locale au laser UV-A qu'après sensibilisation au BrdU (Fig. S5 C), montrant que les DSB étaient induits dans nos conditions. Le recrutement d'ERCC1WT-GFP sur les sites des DSB a été clairement détecté, alors qu'il était beaucoup plus faible pour ERCC1R156W (Fig. 8, A et B). Cependant, les tests de survie clonogénique après rayonnement ionisant (IR) n'ont montré aucune différence entre les cellules KO ERCC1- reconstituées avec ERCC1WT ou ERCC1R156W (Fig. 8 C), ce qui suggère que la protéine mutante ERCC1 prend en charge la réparation DSB.

Pour résoudre également ce problème dans les cellules des patients, nous avons effectué des tests de survie clonogéniques dans des fibroblastes immortalisés par hTERT après exposition à des doses croissantes d'IR. Les fibroblastes déficients en XRCC4 (CS16NG-hTERT; Guo et al., 2015) étaient clairement sensibles à l'IR déjà à la dose la plus faible (2 Gy). Cependant, les cellules PV50LD-hTERT n'étaient pas très sensibles à 2 Gy et n'ont montré une sensibilité accrue qu'à des doses plus élevées (Fig. 8 D). En fait, les cellules ERCC 1- KO complètes et les cellules R156W-KI n'affichaient qu'une sensibilité marginale à l'IR (Fig. S5 D), ce qui suggère une contribution mineure de l'ERCC 1- XPF pour protéger les cellules contre l'IR. Une autre méthode pour évaluer la capacité de réparation de DSB consiste à surveiller la résolution des foyers H2AX induits par IR dans le temps. Les fibroblastes 48BR et patients ont montré une clairance normale des foyers H2AX dans les 24 h après irradiation avec une dose physiologique de 2 Gy (Fig. 8, E et F ; et Fig. S5 E). Cependant, le traitement des cellules 48BR avec un inhibiteur de la protéine kinase ADN-dépendante (DNA-PK) a complètement supprimé la résolution des foyers H2AX à tous les moments analysés (Fig. 8, E et F). Ces résultats suggèrent que les cellules PV46LD et PV50LD sont parfaitement compétentes dans la réparation des DSB sous une faible charge de dommages.