Partie 1 : Effets rénovasculaires du nitrate inorganique suite à une ischémie-reperfusion du rein

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ABSTRAIT

Arrière plan: Lésion d'ischémie-reperfusion (IR) rénaleest une cause fréquente delésion rénale aiguë(AKI), qui est associée à un stress oxydatif et à une bioactivité réduite de l'oxyde nitrique (NO), et à un risque accru de développermaladie rénale chronique(CKD) et les maladies cardiovasculaires (CVD). De nouvelles stratégies qui rétablissent l'équilibre redox peuvent avoir des implications thérapeutiques au cours de l'IRA et des complications associées.

Objectif: Étudier la valeur thérapeutique de la stimulation de la voie nitrate-nitrite-NO lors du développement d'un dysfonctionnement rénal et cardiovasculaire induit par l'IR.

Méthodes: Des souris mâles C57BL/6 J ont reçu du nitrate de sodium (10 mg/kg, ip) ou un véhicule 2 h avant l'ischémie chaude du rein gauche (45 min) suivi d'une supplémentation en nitrate de sodium dans l'eau de boisson (1 mmol/kg/ jour) pendant les 2 semaines suivantes. La pression artérielle et le taux de filtration glomérulaire ont été mesurés et le sang et les reins ont été prélevés et utilisés pour des analyses biochimiques et histologiques ainsi que des études de réactivité des vaisseaux rénaux. Des cellules endothéliales glomérulaires exposées à l'hypoxie-réoxygénation, avec ou sans Ⅱ d'angiotensine, ont été utilisées pour des études mécanistes.

Résultats: L'IR était associée à une fonction rénale réduite et à une pression artérielle légèrement élevée, en combinaison avec des lésions rénales, une inflammation, un dysfonctionnement endothélial, une augmentation des niveaux d'Ang Ⅱ et une vasoréactivité médiée par l'Ang II, qui étaient toutes améliorées par le nitrate. De plus, le traitement au nitrate (in vivo) et au nitrite (in vitro) a restauré la bioactivité du NO et réduit le stress oxydatif mitochondrial et les lésions.

conclusion: Le traitement aigu avec du nitrate inorganique avant l'ischémie rénale peut servir de nouvelle approche thérapeutique pour prévenir l'IRA et l'IRC et le risque associé de développerdysfonctionnement cardiovasculaire.

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1. Introduction

Les lésions d'ischémie-reperfusion (IR) du rein, associées à la transplantation, à la chirurgie de pontage cardiaque et au choc, constituent un risque majeur de développer une insuffisance rénale aiguë (IRA) et une insuffisance rénale chronique (IRC) [1]. Les mécanismes sous-jacents sont complexes et impliquent un stress oxydatif associé à la reperfusion, une carence en oxyde nitrique et une activation des cellules immunitaires, qui, ensemble, conduisent à un dysfonctionnement endothélial [2, 3]. Les recherches en cours se sont concentrées sur la recherche de thérapies nouvelles et efficaces pour prévenir et traiter l'IRA et sa progression vers l'IRC, telles que le préconditionnement ischémique à distance, l'hypothermie locale temporaire ainsi que de nouvelles interventions pharmacologiques [3,4].

La molécule de signalisation gazeuse oxyde nitrique (NO) contribue de manière importante à la régulation de l'homéostasie cardiovasculaire et rénale et il a été démontré qu'elle joue un rôle protecteur lors des lésions IR [5,6]. Cependant, lors de l'événement ischémique, le manque d'oxygène compromet la fonction de la NO synthase endothéliale (eNOS), qui peut contribuer au "phénomène de non-refusion" dans le tissu ischémique pendant la phase de reperfusion. Cela propage à son tour les lésions des cellules épithéliales endothéliales et tubulaires [7], qui contribuent au développement d'une fonction rénale réduite. En plus de l'hypoxie pendant la période ischémique, une production excessive d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) générées en excès par la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH)oxydase et les mitochondries pendant la phase de reperfusion piège le NO [8]. De nouvelles approches qui réduisent le stress oxydatif et maintiennent la bioactivité du NO pourraient avoir une valeur thérapeutique dans la lutte contre l'insuffisance rénale induite par l'IR.

Le nitrate inorganique (NO3) et le nitrite (NOZ) étaient auparavant considérés comme des produits relativement inertes dérivés du métabolisme du NO. Cependant, des recherches menées depuis plus de deux décennies ont montré que ces anions peuvent subir une bioconversion, via des réductions en série, et former à nouveau du NO et d'autres espèces bioactives d'oxyde d'azote [9]. L'activité de cette voie alternative nitrate-nitrite-NO est renforcée dans des conditions d'hypoxie et de pH bas lorsque le système NOS classique peut devenir dysfonctionnel [10].

Le régime alimentaire, en plus du système NOS, est une source importante de nitrates et de nitrites circulants, en raison des niveaux élevés de nitrates, par exemple dans les légumes à feuilles vertes. La supplémentation en nitrate inorganique et en nitrite a été associée à des effets cardiovasculaires favorables, y compris une réduction de la pression artérielle, dans des études expérimentales et cliniques [11]. Des effets protecteurs sur les organes ont également été démontrés dans des modèles expérimentaux de lésions IR du foie [12], du cerveau [13], des poumons [14] et du cœur [12,15]. Cependant, la valeur thérapeutique potentielle des nitrates et nitrites inorganiques dans les lésions rénales IR reste controversée. Comme récemment examiné [5], les résultats variables dans les modèles IR, utilisant la thérapie au nitrite, peuvent être dus à des différences dans la posologie utilisée, la voie d'administration, la durée du traitement, ainsi que le modèle expérimental lui-même [16,17]. Plusieurs études expérimentales ont démontré les effets protecteurs de la supplémentation alimentaire en nitrate dans des modèles de maladies cardiorénales, via des mécanismes qui impliquent l'atténuation du stress oxydatif et l'amélioration de la bioactivité du NO ainsi que la modulation deréponses inflammatoires[5]. À ce jour, les connaissances sur les effets de la thérapie aux nitrates inorganiques sur les lésions rénales par IR sont limitées. Nous avons précédemment démontré qu'un prétraitement alimentaire chronique avec du nitrate atténuait les lésions rénales ultérieures induites par l'IR [18]. Cependant, il existe moins de connaissances concernant la valeur potentielle de la stimulation de la voie nitrate-nitrite-NO au début de l'IR pour réduire le risque de développer une AKI et une IRC. S'il est protecteur, cela pourrait avoir de larges applications cliniques chez les patients à risque de développer une IRA, par exemple ceux qui subissent une intervention chirurgicale majeure.

Dans cette étude, nous avons utilisé un modèle de souris de lésion rénale IR pour étudier les avantages potentiels d'un traitement aigu au nitrate immédiatement avant l'événement ischémique. Cela a été combiné avec des études mécanistes de vaisseaux ex vivo et des expériences de culture cellulaire in vitro avec traitement au nitrite. Nous avons émis l'hypothèse que la stimulation de la voie nitrate-nitrite-NO favoriserait la protection des reins contre les lésions IR via la modulation du stress oxydatif et de la bioactivité du NO ainsi que la fonction mitochondriale.

2. Méthodes

2.1.Réactifs

Sauf indication contraire, tous les réactifs ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich, Suède.

2.2. Animaux et modèle d'ischémie-reperfusion rénale

Des souris C57BL/6 J (mâles, 10 semaines) ont été obtenues auprès des Laboratoires Janvier (France) et hébergées dans nos animaleries de l'Institut Karolinska dans des conditions climatisées avec un cycle lumière/obscurité 12-h et fournies avec de la nourriture standard pour rongeurs et de l'eau du robinet. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité régional d'éthique pour les expérimentations animales (ID de protocole : N139/15) et ont été effectuées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) et à la directive européenne 2010/63/UE pour la conduite des expériences sur les animaux.

Après 1 semaine d'acclimatation, les souris ont reçu un placebo (NaCl) ou du nitrate de sodium (NaNO3) par voie intrapéritonéale (1 0 mg/kg) 2 h avant l'ischémie unilatérale du rein gauche. Le rein droit a été inspecté mais autrement laissé intact. Les chirurgies factices ont été réalisées de la même manière, mais sans clampage du rein gauche. Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et la température corporelle a été maintenue à 37 ± 0,5 degré à l'aide d'une lampe chauffante et d'un coussin chauffant auto-surveillé tout au long de la chirurgie. Après la chirurgie, les souris ont été traitées avec du nitrate de sodium (1 mmol/kg/jour) ou un placebo pendant 2 semaines jusqu'à la fin.

2.3. Mesure de la pression artérielle

La pression artérielle a été mesurée chez les souris à l'aide d'une méthode non invasive de brassard de queue avant l'arrêt. Les souris ont été conditionnées sur une plaque chaude à 35 ° C pendant 10 min, puis placées dans des dispositifs de retenue en plastique. Un brassard avec un capteur de pouls pneumatique a été attaché à la queue et les valeurs de pression artérielle ont été enregistrées avec le système CODA (Kent Scientific, Torrington, CT, USA). Les animaux ont été entraînés avec les appareils de contention sur la plaque chauffante au moins trois jours avant les enregistrements de la pression artérielle. La pression artérielle systolique, diastolique et moyenne a été recueillie sur 3 jours consécutifs et la médiane individuelle de toutes les valeurs acceptées a été compilée pour évaluation.

2.4.Récolte de tissus

Avant la résiliation, les souris ont été placées dans des cages métaboliques pour recueillir l'urine pour le calcul du taux de filtration glomérulaire (GFR). Les animaux ont ensuite été anesthésiés avec de l'isoflurane et des échantillons de sang ont été prélevés par la veine cave inférieure. Tous les échantillons ont été centrifugés immédiatement à 6000 x g, 4 degrés C pendant 5 minutes en présence d'EDTA (Sigma-Aldrich, Stockholm, Suède), la concentration finale de 2 mM. Les échantillons de plasma ont été transférés dans de nouveaux tubes et immédiatement congelés dans de la neige carbonique et finalement stockés à -80 degré. Les reins ont été extraits et coupés en plusieurs parties pour des expériences de fonction vasculaire ex vivo (artères interlobaires et artérioles afférentes), histologie ( coloration HE et PAS) et quantification de l'apoptose et de l'inflammation (composé de température de coupe optimale Tissue-Tek (OCT) incorporé et congelé pour coloration TUNEL et F4/80).

2.5. Mesures de nitrate, nitrite, cGMP, créatinine, azote uréique sanguin (BUN) et angiotensine II

Le nitrite et le nitrate ont été analysés par HPLC(ENO-20) comme décrit précédemment 【19】. Des échantillons de plasma (10 ul ont été injectés dans le système HPLC avec une seringue Hamilton. Ensuite, le nitrite et le nitrate ont été séparés par chromatographie en phase inverse/échange d'ions suivie d'une réduction du nitrate en nitrite par le cadmium et le cuivre réduit. Le nitrite a été dérivé en utilisant le réactif de Griess pour former des composés diazoïques et détecté à 540 nm. Pour éviter la dégradation du cGMP, le plasma a été transféré dans des tubes contenant un inhibiteur de PDE, le BMX (3-isobutyl-1méthylxanthine ; Sigma-Aldrich #I5879) pour donner une concentration finale (10 μM). Les échantillons ont été ensuite congelé et stocké à -80 degré avant d'analyser cGMP avec un kit ELISA (GE Healthcare #RPN226), selon les instructions du fabricant.

Les niveaux de créatinine plasmatique et urinaire ont été détectés en utilisant des kits de dosage colorimétrique de la créatinine (Cayman Chemical, #700460 et #500701). La formule de clairance de la créatinine (CLcr =Urinecrx Urine flow/Plasmacr) a été utilisée pour estimer le DFG. Les taux plasmatiques de BUN ont été détectés à l'aide du kit de détection colorimétrique BUN (Invitrogen, #EIA-BUN). Les niveaux d'Ang dans le plasma et les tissus rénaux ont été mesurés à l'aide d'un kit ELISA Ang ⅡI (Cloud-Clone Corp., # CEA005Mu) conformément aux instructions du fabricant. Cependant, la préparation de l'extrait de tissu différait légèrement de la recommandation. 10 volumes de HCl 50 mM dans 50 % d'EtOH ont été ajoutés au tissu et chauffés pendant 10 min à 100 degrés, centrifugés 10 000 × g 10 min. Par la suite, les échantillons ont été congelés et stockés à -80 degré avant d'être analysés. Toutes les lectures d'absorbance ont été effectuées dans SpextraMax iD3 de Molecular Devices.

2.6. Isolement et perfusion des artères interlobaires

Les reins ont été récoltés après sacrifice et conservés dans une solution saline physiologique (PSS) glacée jusqu'à l'isolement des artères interlobaires. Les artères interlobaires rénales ont été disséquées (2 mm de longueur) et montées dans un

chambre myographe (modèle 620 M, Danish Myo Technology, Danemark) avec PS comme décrit précédemment [20]. La tension isométrique a été enregistrée avec un système Powerlab (Powerlab 4/30, AD Instruments, Australie). Après avoir été montés, les vaisseaux ont été équilibrés pendant 20 min dans des PS bouillonnant de carbogène (95 % d'O2 ; 5 % de CO2) à 37 degrés, pH 7,4. Ensuite, la tension au repos des artères a été réglée comme décrit précédemment [21], qui est conformément à la procédure de normalisation de Mulvany [22]. Après un deuxième équilibrage, 0,1 mol/L de KCl a été appliqué pour évaluer la viabilité de l'anneau artériel.

2.7. Isolement et micro-perfusion des artérioles afférentes

Des souris C57BL/6 J ont été anesthésiées avec de l'isoflurane inhalé et les reins ont été prélevés et tranchés rapidement comme décrit précédemment [23-25]. Les tranches de rein ont été placées dans du milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) glacé. Une seule artériole afférente avec un glomérule attaché a été micro-disséquée sous un stéréomicroscope et transférée dans un

chambre à température régulée sur la platine d'un microscope inversé. Le glomérule a été fixé avec une micropipette de maintien et l'artériole afférente a été canulée et perfusée avec un jeu de micropipettes. La pression intraluminale de l'artériole afférente perfusée a été maintenue à 60 mmHg au cours des expériences. Le temps de dissection et la micro-perfusion suivante ont été limités à 120 min après le sacrifice de la souris comme décrit précédemment [26]. Après une période d'équilibrage de 30 min à 37 degrés, des courbes dose-réponse cumulées à l'Ang II (10-12 à 10-8 mol/L) ont été obtenues. Chaque concentration d'Ang II a été perfusée pendant 2 min, la réponse constrictive a été enregistrée puis le diamètre de l'artériole afférente a été mesuré.

2.8. Examen histologique

Les échantillons de rein ont été récoltés et fixés dans une solution de paraformaldéhyde à 4 %. Les tissus rénaux fixés ont été inclus dans de la paraffine, puis tranchés et colorés avec de l'hématoxyline-éosine (H&E) ou de l'acide périodique Schiff (PAS) pour une évaluation histologique. Quatre animaux choisis au hasard dans chaque groupe expérimental ont été utilisés pour l'analyse. Dix champs choisis au hasard dans chaque section ont été capturés sous un grossissement de 400×. Toutes les analyses morphométriques ont été réalisées en aveugle.

2.9. Coloration TUNEL

Des échantillons de rein inclus dans l'OCT ont été utilisés pour la coloration TUNEL. 6-Des coupes d'épaisseur μm ont été incubées avec 20 ug/mL de protéinase K pendant 15 min à température ambiante, et les réactions TUNEL ont été réalisées à l'aide du test Click-iTTM Plus TUNEL (Invitrogen C10618, États-Unis) en suivant les instructions du fabricant. A la fin du protocole, la coloration DAPI a été réalisée. Pour la quantification, trois animaux et trois zones de champ de l'image (200 ×) ont été sélectionnés au hasard et photographiés à l'aide du microscope confocal Zeiss LSM800-Airy, les signaux positifs ont été quantifiés à l'aide du logiciel ImageJ/Fiji et ont été calculés comme le rapport des signaux positifs au DAPI.

2.10. Coloration par immunofluorescence tissulaire et microscopie confocale (F4/80)

Les reins ont été congelés en OCT (Tissue-Tek, Torrence, CA, USA) et des coupes (6 μm) ont été préparées et traitées ultérieurement. Les sections congelées ont été lavées avec du PBS 1 × et bloquées avec 2 % de BSA dans du PBS pendant 30 min, puis incubées avec de l'anti-F4/80 (1:50, BIO-RAD Cl : A3-1) pendant la nuit dans une chambre à 4 degrés chambre froide, puis avec un anticorps secondaire (1:200 Cell signaling Tech #4417) à température ambiante pendant 1 h, suivi d'une contre-coloration avec 300 nmol/L DAPI(4'6-diamidino-2-phényl -indole, dichlorhydrate, Invitrogen) pendant 3 min. Les signaux d'immunofluorescence ont été visualisés au microscope confocal Zeiss LSM800-Airy. trois animaux et trois zones de champ de l'image (200 ×) ont été sélectionnés au hasard. Les signaux positifs F4/80 ont été quantifiés à l'aide du logiciel ImageJ/Fiji et ont été calculés comme le rapport des signaux positifs au DAPI.

2.11. Culture de cellules

Des cellules endothéliales glomérulaires de rat (GEC) (DSMZ ACC262, Allemagne) ont été cultivées dans un milieu RPMI1640 (Gibco 21870-076) avec 10 % de sérum bovin fœtal et 2 m ML-Glutamine (Gibco 25030-082), pénicilline et streptomycine (50 mg/L, Gibco 15140-122). Les cellules ont été maintenues à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2. Dans les expériences d'hypoxie, les cellules ont été incubées dans HBSS (Gibco 14025-092) au lieu du milieu sans sérum dans une chambre avec 1 % d'oxygène à 37 °C pendant 2 h. Les cellules ont été pré-incubées avec du nitrite （10 μM, avec/sans l'inhibiteur de la xanthine oxydoréductase (XOR) febuxostat (100 nM), pendant 30 min avant l'hypoxie. La viabilité cellulaire a été évaluée par le test PrestoBlue⑧ (Invitrogen, A13261 et A13262) et la mortalité cellulaire a été évaluée par le test d'exclusion du bleu Trypan (Sigma, T8154-20 ML).

2.12. Détection des ROS mitochondriaux

Les niveaux de superoxyde mitochondrial ont été détectés avec un colorant fluorogène (MitoSOXTM, Invitrogen M36008). Après traitement, les cellules endothéliales ont été incubées avec 2 μmol/L de MitoSox dans un milieu de culture à 37 degrés pendant 10 min. Ensuite, les cellules ont été lavées deux fois avec 1 × HBSS et le signal fluorescent a été mesuré (lecteur SpectraMax iD3, Molecular Devices, USA) et normalisé à la viabilité cellulaire.

2.13. Analyse par immunotransfert

Des échantillons de rein congelés ou des cellules endothéliales ont été lysés dans un tampon contenant 10 mmol/L de Tris-HCl pH 8, 150 mmol/L de NaCl, 5 mmol/L d'EDTA, 60 mmol/L de N-octyl-glucoside, 1 % de Triton X{{9 }}, un cocktail d'inhibiteurs de protéase et des inhibiteurs de la protéine phosphatase. Les lysats cellulaires ou tissulaires ont été centrifugés pendant 5 min à 10,000×g à 4 degrés. Les surnageants/protéines ont été transférés dans de nouveaux tubes et quantifiés à l'aide du Bio-Rad

dosage des protéines. Des extraits de protéines contenant une quantité équivalente de protéines ont été analysés en utilisant {{0}} % d'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE). Les protéines ont été transférées sur une membrane immobilon de difluorure de polyvinylidène pendant 1 h à 300 mA. Les membranes ont été bloquées dans du Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), du NaCl 150 mM et du Tween 20 à 0,1 % (TBS-T) contenant 5 % de matières grasses. lait en poudre pendant 1 h et immunodétecté avec des anticorps anti-TFAM(1:2000, ab131607), anti-OXPHOS(1:1000, ab110413), anti-vinculine(1:5000, ab129002)(Abcam Cambridge, UK) et anti -Caspase clivée-3 (1:1000,#9664)(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Tous les anticorps secondaires pour l'analyse par immunoblot provenaient de Cell Signaling Technology. Pour les Western blots, des images pleine longueur non recadrées, annotées avec des marqueurs MW sont présentées dans le fichier supplémentaire.

2.14. analyses statistiques

Les comparaisons multiples entre les groupes ont été analysées par une ANOVA à un ou deux facteurs suivie d'un test post-hoc recommandé. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Tous les calculs statistiques ont été effectués à l'aide de Graphpad Prism 8.0. La signification statistique a été définie comme p<>