Partie 2 : La molécule de lésion rénale-1 est un récepteur potentiel du SARS-CoV-2

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Manifestations cliniques du coronavirus

1. La période d'incubation est longue et les principaux symptômes sont la fièvre, la fatigue, le mal de gorge et la toux. La fièvre peut être une forte fièvre, une fièvre modérée ou une faible fièvre ;

2. Les nourrissons et les personnes âgées ne sont pas typiques et sont souvent accompagnés de respiration sifflante et de dyspnée. Dans les cas graves, des dommages multi-systèmes peuvent survenir ;

3. La toux sèche au stade précoce est principalement paroxystique et sévère, semblable à la coqueluche, qui affecte le sommeil et les activités ; au stade ultérieur, la toux est un crachat, le crachat est vicieux, contient parfois une petite quantité de sang et certains sont accompagnés d'une respiration sifflante;

4. Certains patients présentent des symptômes légers et peuvent ne pas avoir de fièvre. La plupart des patients ont un bon pronostic et un petit nombre de patients sont gravement malades ou même décèdent ;

5. Syndrome de détresse respiratoire aiguë, choc septique, acidose métabolique réfractaire et dysfonctionnement de la coagulation.

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Discussion

Pour lutter contre laPandémie de COVID-19, une profonde compréhension de la façon dontSRAS-CoV-2envahit les cellules humaines est justifiée. Des études ont indiqué une infection directe par le SARS-CoV-2 dans leun reinen plus du poumon (Braun et al., 2020 ; Farkash et al., 2020). Cependant, ACE2 reste le seul récepteur bien reconnu qui peut médier cette invasion. De plus, le tropisme rénal du SRAS-CoV-2 et deslésion rénalesemblent inexplicables par le niveau relativement diminué d'ACE2 lors de l'invasion virale (Kuba et al., 2005). Ici, notre étude suggère que KIM1, un biomarqueur considérablement régulé à la hausse pour les lésions rénales (Yang et al., 2015), médie l'invasion rénale du SRAS-CoV-2 en tant que récepteur.

Nous avons également constaté que le SARS-CoV-2-RBD se lie à KIM1 avec une affinité plus élevée que celle du SARS-CoV-RBD et du MERS-COV-RBD, ce qui sous-tend probablement la plus forte contagion du SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020); par conséquent, l'infection rénale et les rôles de KIM1 dans ces maladies respiratoires graves méritent d'être revisités. Notamment, nos résultats suggèrent des sites de liaison distincts de KIM1 et d'ACE2 sur le RBD viral, il convient donc d'étudier si et comment KIM1 et ACE2 interviennent dans l'invasion du SRAS-CoV-2 dans ces organes. De plus, étant donné que KIM1 est endocytosé via des voies dépendantes de la clathrine (Zhao et al., 2016), il serait également intéressant d'explorer davantage le processus dépendant de KIM1-après l'attachement viral à la membrane cellulaire.

L'ACE2 est le récepteur le plus étudié pour le SRAS-CoV-2, mais ce n'est pas une cible thérapeutique idéale pour le COVID-19, car il est largement exprimé dans plusieurs organes et joue un rôle crucial dans la régulation de la pression artérielle et prévenir les lésions cardiaques / rénales (Imai et al., 2005 ; Li et al., 2020d). En revanche, KIM1 a une association plus forte avec la fonction rénale et n'est fortement exprimé qu'aprèslésion rénale(Kondratowicz et al, 2011 ; Yuan et al, 2015 ; Costafreda et Kaplan, 2018), ce qui en fait une cible thérapeutique plus spécifique et peut-être aussi plus sûre pour les patients COVID-19 atteints de maladies rénales.

En résumé, nos données suggèrent un rôle crucial de KIM1 dans le tropisme rénal du SRAS-CoV-2 en tant que récepteur potentiel du SRAS-CoV-2. Ici, nous proposons un modèle de « cercle vicieux » médié par KIM1 et ACE2 (Figure 5G), qui peut expliquer le tropisme rénal du SARS-CoV-2 chez les patients COVID-19. Au cours de la phase initiale de l'invasion du SRAS-CoV -2, le niveau physiologique plus élevé (Figure supplémentaire S1) et l'affinité de liaison (Tableau supplémentaire S1) font de l'ACE2 la cible principale, qui n'est pas spécifique au rein. Cependant, après l'apparition de l'AKl induite par le virus, le KIM1 fortement régulé à la hausse qui en résulte favorise rapidement une infection virale secondaire médiée par KIM1 et ACE2, qui est plus spécifique au rein, et par conséquent exacerbe les lésions rénales dans un cercle vicieux (Figure 5G). Les approches qui peuvent briser l'interaction entre le SRAS-CoV-2 et le KIM1, y compris les anticorps anti-KIM1, les inhibiteurs à petites molécules et les peptides antagonistes dérivés du KIM1-, peuvent faire la lumière sur le COVID-19 traitement.

matériaux et méthodes

Matériaux

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 pour cent) ont été synthétisés chimiquement par Genscript. L'anticorps anti-lgG de souris (p/n 18-8816-33) et l'anticorps anti-lgG de lapin (p/n 18-8817-33) ont été obtenus auprès de Rockland. IgG avec billes magnétiques de protéine G SureBeads (J2112LB-02) ont été achetées chez Bio-Rad. Le DAPI (D9542) provenait de Sigma. La phalloïdine marquée Alex Flour 594 (C2205S) provenait de Beyotimes. Anticorps contre KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) et ACE2 (2115-1-AP, Proteintech) ont été utilisés.

Acquisition et analyse des profils d'expression de KIM1 et ACE2

Pour obtenir les profils complets de transcriptome et de protéines de KIM1 et ACE2 pour les tissus humains, nous avons collecté et analysé les données de transcriptome et les profils de protéines basés sur l'immunohistochimie de Human Protein Atlas (HPA, https://www.proteinatlas.org), qui a montré le l'expression et la localisation des protéines humaines à travers les tissus et les organes, sur la base du séquençage en profondeur de l'ARN (ARN-seq) de 37 tissus normaux et de l'immunohistochimie sur des puces tissulaires contenant 44 types de tissus (Uhlen et al., 2015). Le tissu HPA RNA-seq du gène codant pour la protéine a été enregistré en tant que transcrits moyens codant pour la protéine par million (pTPM), correspondant aux valeurs moyennes des échantillons de chaque tissu. Les niveaux d'expression des protéines basés sur l'histologie ont été analysés manuellement en quatre niveaux (non détecté, faible, moyen et élevé). Dans la figure supplémentaire S1, les 10 principaux niveaux de transcription tissulaire et les niveaux d'expression protéique basés sur l'histologie de KIM1 et ACE2 sont répertoriés, respectivement, et le profil d'expression superposé de KIM1 et ACE2 est résumé.

Amarrage moléculaire et simulations dynamiques

Les amarrages ont été effectués via Z-Dock (http://zdock.umassmed.edu/). Structures cristallines de SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) et KIM1 Ig Le domaine V (PDB ID 5DZO) a été utilisé pour rechercher des modèles de liaison potentiels. Les complexes protéiques les mieux notés ont été sélectionnés pour les simulations de dynamique moléculaire suivantes, qui ont été menées par le serveur Desmond et analysées par Pymol2.3 et Maestro11.8.012. Le diagramme de simulations dynamiques à 50 ns a été appliqué pour étudier les paramètres dynamiques des complexes protéiques. . L'énergie libre de liaison MM-GBSA a été calculée par HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Écart quadratique moyen (RMSD) et fluctuation quadratique moyenne (RMSF)

La RMSD a été utilisée pour estimer le changement moyen de déplacement d'une sélection d'atomes pour un cadre particulier tel que décrit (Li et al., 2011). La RMSF a été menée pour étudier les changements de déplacement dans la chaîne protéique (Li et al., 2011) .

Modèles de souris AKI et qPCR

Une blessure I/R a été réalisée sur des souris C57BL/6 comme nous l'avons décrit précédemment (Chen et al, 2015, 2017). Pour l'IRA induite par le cisplatine, 30 mg/kg de cisplatine de poids corporel ont été injectés par voie intrapéritonéale à des souris mâles âgées de 8- semaines, et les souris ont été sacrifiées 3 jours plus tard. Des échantillons de sang et de rein ont été prélevés pour une analyse plus approfondie, avec n=4 pour chaque groupe d'animaux expérimentaux. L'ARN total a été isolé des reins par RNAiso Plus (TaKaRa) et rétrotranscrit en ADNc à l'aide du système de synthèse du premier brin M-MLV (Invitrogen). L'abondance de transcrits de gènes spécifiques a été évaluée par qPCR. Les amorces utilisées dans l'étude sont fournies (tableau supplémentaire S4).

Constructions

Plasmides d'expression de mammifères pour KIM1 humain, KIM1 Ig V (résidus KIM1 aa 20-127), KIM1 △lg V (KIM1 tronqué sans résidus aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S résidus aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP et TIM4-YFP ont été construits. Les produits d'amplification par PCR des fragments d'ADNc correspondants ont été clonés dans un vecteur à base de promoteur pRK contenant une étiquette HA ou FLAG. Les plasmides liés au SARS-CoV-2-étaient des cadeaux aimables du Dr PHWang de l'Université du Shandong.

Culture cellulaire et transfection

La lignée de cellules tubulaires rénales humaines HK-2 (obtenue auprès du China Center for Type Culture Collection) a été cultivée dans un milieu DMEM/F12 (Hyclone) contenant 17,5 mM de glucose et 10 % de sérum bovin fœtal. Pour évaluer l'impact du SARS-CoV-2 sur les cellules, des cellules HK-2 ont été transfectées avec des plasmides SARS-CoV-2-S et SARS-CoV-2-RBD, puis collectées pour une détection plus poussée.

Co-IP

Les cellules HK-2/HEK293T indiquées (1 x 10) ont été lysées dans 1 ml de tampon de prélyse (Tris-HCl 25 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NP -40 1 %, EDTA 1 mM, 5 pourcentage de glycérol), qui est formulé pour les dosages pulldown et IP et comme tampon de lavage pour les billes. Pour l'IP, le lysat cellulaire a été immunoprécipité avec l'anticorps indiqué ou le gG respectif avec les billes magnétiques SureBeadsTM Protein G pendant une nuit à 4 °C. Après lavage avec un tampon de pré-lyse contenant 500 mM de NaCl, les billes ont été bouillies dans un tampon de charge et soumises à un immunotransfert (Wan et al., 2017).

Essai FRET

L'interaction intracellulaire entre KIM1 et SARS-CoV-2-RBD a été détectée par un test standard basé sur FRET (Karpova et McNally, 2006) utilisant KIM1-CFP et SARS-CoV-2-RBD-YFP . En bref, des plasmides d'expression de mammifères exprimant KIM1-CFP ou KIM1 Alg V-CFP ont été cotransfectés avec le SRAS-CoV-2-RBD-YFP dans des cellules -293T. Pour la détection basée sur le spectrophotomètre à fluorescence, les cellules ont été collectées et lysées 24h après la transfection, et le lysat a été détecté par un spectrophotomètre à fluorescence F-2700 (Hitachi) via un balayage de longueur d'onde (500-600nm) et un balayage temporel (435 /527 nm, excitation/émission). Pour la détection confocale, les cellules ont été imagées avec un microscope confocal Leica TCS SP8 sous objectif haute puissance (40×) (canal CFP : 435/485 nm, excitation/émission ; canal YFP :485/527nm, excitation/émission ; canal FRET :435/527 nm, excitation/émission) (Li et al, 2020b). La cotransfection de CFP et de YFP non conjugués a été incluse comme contrôle négatif, comme décrit (Karpova et McNally, 2006). L'interaction entre KIM1 et son ligand TIM4 a été détectée par le test FRET comme contrôle positif (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-KO de KIM1

Les protocoles basés sur CRISPR-Cas9-pour l'ingénierie du génome ont été utilisés comme décrit (Zhang et al., 2017). Des séquences cibles d'ARN guide pour KIM1 sont fournies (tableau supplémentaire S4).

Marquage FITC et microscopie confocale

L'étiquette FITC a été réalisée comme nous l'avons décrit précédemment (Li et al, 2020b; Zhang et al., 2020). En bref, le SARS-CoV-2-RBD a été incubé avec du FITC (rapport molaire 1:5) pendant la nuit, puis du NHCl 5 mM a été ajouté pour arrêter la réaction et éteindre le FITC n'ayant pas réagi. La solution a été dialysée deux fois et lyophilisée pour une utilisation ultérieure.

Des cellules HEK293T (5×109) ou des cellules HK-2 (1×107) ont été incubées avec du FITC libre ou du FITC-SARS-CoV-2-RBD （100ug/ml pour 2. Pour les tests d'internalisation à base de peptides, AP1 ou AP2（50μM）a été co-ajouté avec FITC-SARS-CoV-2-RBD （100 ug/m）. Après fixation avec 4 % (p/v) de formaldéhyde, les membranes cellulaires ont été colorées avec de la phalloïdine marquée Alex Flour 594 (2 ug/ml), et les noyaux ont été colorés par DAPI (1 ug/m), puis imagés avec un Leica TCS. Microscope confocal SP8. Pour chaque groupe, au moins 100 cellules de cinq champs sous un objectif à haute puissance (64×) ont été incluses dans l'évaluation. Des images représentatives ont été présentées. La quantification des images a été réalisée par ImageJ1.8.0.

Essais de viabilité cellulaire

Les cellules ont été plaquées à 3000-4000 cellules par puits dans 96-plaques à puits. À 80 % de confluence, les cellules incubées avec le SARS-CoV-2-RBD (100 ug/ml) ont été traitées avec ou sans AP1 ou AP2 (10,50,100 μM). Après cela, 10ul de MTT (5 mg/ml ont été ajoutés à chaque

puits pendant 4h, le milieu a été retiré et du DMSO a été ajouté. L'absorbance mesurée à 490 nm a été normalisée pour le groupe témoin respectif.

analyses statistiques

Les données ont été exprimées en moyenne ± SD. Les différences significatives ont été évaluées par un test de Student bilatéral. Une valeur P bilatérale<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">