Des nanoassemblages photosensibles pro-médicaments abritant une fonction de dormance chimiothérapeutique potentialisent l'immunothérapie contre le cancer

Abstrait

L'immunothérapie combinée à des traitements efficaces tels que la chimiothérapie et la thérapie photodynamique constitue une stratégie efficace pour activer les réponses immunitaires antitumorales afin d'améliorer le traitement anticancéreux. Cependant, le développement de nano-immunostimulants transformés multifonctionnels, biodégradables, biocompatibles, peu toxiques mais très efficaces et disponibles en clinique reste un défi et est très demandé. Ici, nous rapportons et concevons un nouveau nano-promédicament photochimiothérapeutique sans support COS-BA/Ce6 NP en combinant trois composants multifonctionnels, une petite molécule naturelle auto-assemblée, l'acide bétulinique (BA), un oligosaccharide de chitosane (COS) soluble dans l'eau, et un photosensibilisant faiblement toxique, le chlore e6 (Ce6) pour augmenter l'efficacité antitumorale de l'immunothérapie anticancéreuse médiée par l'adjuvant immunitaire anti-PD-L 1-. Nous montrons que les nanomédicaments conçus présentaient une caractéristique de « dormance » intelligente et distinctive dans l'effet chimiothérapeutique avec une cytotoxicité inférieure souhaitée, et de multiples caractéristiques thérapeutiques favorables, notamment une génération améliorée de 1 O2 induite par l'écart énergétique réduit de Ce6, une réactivité au pH, une bonne biodégradabilité et biocompatibilité, garantissant une photochimiothérapie synergique très efficace. De plus, lorsqu’elles sont combinées à une thérapie anti-PD-L1, la chimiothérapie basée sur les nano-coassemblages et la chimiothérapie/thérapie photodynamique (PDT) pourraient activer efficacement l’immunité antitumorale lors du traitement de tumeurs primaires ou distantes, ouvrant ainsi des possibilités potentiellement intéressantes pour l’immunothérapie clinique.

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MOTS CLÉS

Immunothérapie anticancéreuse ; Nano-immunostimulants ; Dormance chimiothérapeutique ; Pro-drogue ; Auto-assemblage ; Petite molécule naturelle ; Acide bétulinique ; La thérapie photodynamique

1. Introduction

L'immunothérapie anticancéreuse, telle que la stratégie de blocage des points de contrôle immunitaires utilisant PD-L1 ou CTLA-4 pour combattre le cancer en activant le système immunitaire de l'hôte, a sans aucun doute révolutionné le traitement du cancer1,2. Malheureusement, la faible réponse immunitaire et les effets thérapeutiques inefficaces ont grandement limité ses perspectives cliniques3,4. Récemment, des études actuelles ont révélé qu'une combinaison d'immunothérapie avec d'autres modalités telles que la chimiothérapie5, la thérapie photodynamique (PDT)6, la thérapie photothermique (PTT)7 et la radiothérapie8, peut déclencher efficacement l'immunogénicité antitumorale en induisant la mort cellulaire immunogène des cellules cancéreuses ( ICD)9, qui suggère le potentiel de la modulation immunitaire pour activer les réponses immunitaires antitumorales. De nombreuses conceptions innovantes de nanomatériaux basées sur ces combinaisons synergiques de stratégies d’immunothérapie ont permis d’obtenir une activité anticancéreuse considérablement améliorée, notamment des nanoparticules inorganiques10, polymères11 et biomimétiques12 (NP). Cependant, le développement de nano-immunostimulants transformés multifonctionnels, biodégradables, biocompatibles, peu toxiques mais hautement efficaces et disponibles en clinique reste un défi de taille et une demande énorme. Les matériaux biologiques naturels comme les acides nucléiques13, les protéines12, les peptides14,15 et les produits naturels à petites molécules16,17, en raison de leurs avantages inhérents (par exemple, biocompatibilité, non-toxicité), ont suscité un intérêt important en recherche pour des applications médicales. Surtout ces dernières années, des petites molécules naturelles (NSM) terpénoïdes bioactives anticancéreuses possédant une fonction d’auto-assemblage ont été découvertes successivement18,19. Par exemple, l’acide bétulinique (BA), l’ergostérol (ET) et l’acide abiétique (AA) peuvent s’auto-assembler en particules microniques ou nanostructurées. Ces NSM sont des éléments de base intéressants à utiliser pour développer des agents antitumoraux pour la chimiothérapie synergique et la PDT. Il a été prouvé qu'ils présentent les avantages significatifs d'une nano-fabrication facile, d'une meilleure biocompatibilité et biodégradabilité, d'une toxicité plus faible avec une réduction des lésions hépatiques et d'une synergie élevée dans la thérapie antitumorale20e23. Cela fournit des alternatives prometteuses pour développer des nano-immunostimulants traduisibles cliniquement disponibles pour l’immunothérapie synergique. Cependant, la lipophilie généralement plus forte de ces NSM a conduit à une endocytose cellulaire inefficace, ce qui a affaibli leur activité anticancéreuse et limité leur valeur clinique pour le traitement du cancer24. Semblables aux nanocomposites couramment signalés, les nanoformulations de NSM correspondantes favorisaient l'absorption cellulaire pour améliorer les effets chimiothérapeutiques, mais augmentaient également par inadvertance le risque de cytotoxicité non spécifique pour les cellules normales22. Par conséquent, la manière de maximiser l’efficacité anticancéreuse des nano-agents terpénoïdes NSM tout en minimisant leur toxicité pour les tissus normaux mérite une réflexion approfondie en tant que question cruciale dans le processus d’immunothérapie synergique.

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Des stratégies pro-médicaments ont été largement appliquées pour améliorer l’absorption cellulaire de petites molécules lipophiles en augmentant le caractère hydrophile25. Généralement, les médicaments amphiphiles possèdent une efficacité d’absorption cellulaire plus élevée que les médicaments hydrophiles ou lipophiles26. Plus la phagocytose cellulaire est élevée, meilleure est l’efficacité thérapeutique24. Ainsi, le développement de molécules pro-médicaments de NSM terpénoïdes amphiphiles peut être une méthode potentielle pour maximiser leurs effets thérapeutiques. De plus, les nanomédicaments sensibles aux stimuli du microenvironnement spécifique de la tumeur (par exemple, réactivité acide, rédox) sont très prometteurs pour contrôler la libération de médicaments, ce qui est avantageux pour supprimer la cytotoxicité des médicaments chimiothérapeutiques27,28. Pendant ce temps, le coassemblage supramoléculaire (par exemple, une approche de reprécipitation) était une stratégie efficace pour préparer des nanomédicaments sans support hautement solubles dans l'eau22,29, dont on pourrait s'attendre à ce qu'ils diminuent légèrement l'efficacité de la phagocytose des NSM amphiphiles dans une certaine mesure, atténuant ainsi leur pré- cytotoxicité conçue. Nous émettons l'hypothèse que des nanomédicaments entièrement hydrophiles et sensibles aux stimuli ont été créés sur la base du pro-médicament des NSM amphiphiles et peuvent supprimer efficacement sa cytotoxicité non spécifique pour les cellules normales tout en stimulant la libération de NSM amphiphiles hautement toxiques dans les cellules tumorales, facilitant leur dormance dans les tissus normaux et activation dans le site tumoral. Il est important de sélectionner le précurseur approprié, soluble dans l’eau et sensible aux stimuli, pour modifier les NSM terpénoïdes afin de préparer des molécules pro-médicaments amphiphiles. Pendant des années, les oligosaccharides de chitosane (COS), en tant que produits dégradés du chitosane, ont non seulement une bonne solubilité dans l'eau et des groupes eOH oreNH2 abondants qui conduisent à une bonne réponse du pH, mais ont également des activités antitumorales bénéfiques en renforçant la fonction immunitaire de l'hôte en régulant l'activité. de cellules immunitaires telles que les macrophages monocytes et les lymphocytes30,31. Ceux-ci garantissent l’énorme possibilité de construire des nanoimmunostimulants cibles sensibles aux stimuli pour l’immunothérapie synergique.

Ici, sur la base des considérations ci-dessus, dans notre conception expérimentale, un triterpène pentacyclique NSM de l'acide bétulinique (BA) est utilisé comme agent anticancéreux puissant32, le COS a été introduit pour synthétiser une molécule amphiphile COS-BA afin d'améliorer l'effet chimiothérapeutique. Le chlore e6 (Ce6), un photosensibilisateur largement utilisé avec une toxicité très faible ou nulle dans l'obscurité, a été utilisé pour construire un promédicament photosensible COS-BA/Ce6 NP complètement soluble dans l'eau et sans support, en utilisant une stratégie de co-assemblage direct. Les NP COS-BA/Ce6 combinent deux modalités thérapeutiques, la chimiothérapie et la thérapie photodynamique (PDT), qui peuvent augmenter efficacement la présentation d'antigènes dérivés de la tumeur aux lymphocytes T, générant ainsi des réponses immunologiques robustes avec l'aide d'un adjuvant immunitaire anti-PD-L1. pour provoquer une chimiothérapie antitumorale/PDT/immunothérapie hautement efficace et synergique (schéma 1). Les NP COS-BA/Ce6 modifiées ont montré une fonction de dormance intelligente avec des effets de chimiothérapie insidieux, c'est-à-dire que les NP co-assemblées non irradiées ont montré une cytotoxicité in vitro remarquablement inhibée par rapport au COS-BA amphiphile, que ce soit contre le cancer ou contre les cellules normales. En raison de son comportement distinctif sensible au pH, il présente une faible toxicité et une faible biosécurité pour les tissus normaux in vivo, mais est hautement toxique pour les tissus tumoraux en raison de la libération stimulante de COS-BA hyperactif dans le microenvironnement tumoral faiblement acide . À notre connaissance, les nanomédicaments conçus pour héberger cette fonction de dormance chimiothérapeutique sont encore rarement rapportés. Parallèlement, le nanomédicament présente de multiples caractéristiques thérapeutiques favorables, telles qu'une génération améliorée de 1 O2 en réduisant le déficit énergétique (DEST) du Ce6, un métabolisme biologique rapide et une accumulation accrue de tumeurs, ce qui a conduit à une combinaison antitumorale efficace et sûre de chimiothérapie et de traitement PDT. Plus important encore, les systèmes de chimiothérapie à base de NP et de chimiothérapie/PDT pourraient activer efficacement l'immunité antitumorale en facilitant la prolifération des cellules T CD8þ productrices de TNF-a et d'IFN-g dans les tumeurs primaires ou distantes. Notre nanomédicament photochimiothérapeutique biodégradable, biocompatible, particulièrement dormant, biosûr et hautement efficace permet d'obtenir des réponses immunothérapeutiques systémiques significatives, ouvrant des possibilités attrayantes d'application clinique dans le traitement du cancer à distance ou métastatique.

Le schéma 1 PDT et la chimiothérapie de NP COS-BA/Ce6 co-assemblés ont potentialisé l'anti-PD-L1 pour induire une immunothérapie antitumorale systémique. L'introduction de COS soluble dans l'eau peut améliorer efficacement l'activité chimiothérapeutique du BA (représenté comme une demi-épée), ce qui donne lieu à un promédicament amphiphile hyperactif COS-BA (épée longue). Lorsqu'ils sont co-assemblés avec le photosensibilisateur Ce6 (fourreau), les nano-assemblages structurés en coque et sensibles au pH avaient une fonction de « dormance » intelligente et distinctive avec une toxicité chimiothérapeutique inhibée pour les tissus normaux. Mais, une fois arrivé et stimulé par le microenvironnement tumoral acide (Hþ), le promédicament amphiphile hautement actif COS-BA sera libéré, entraînant une chimiothérapie significative. De plus, les co-assemblages construits présentaient une excellente activité PDT avec une génération améliorée d'oxygène singulet (1 O2) induite par l'écart énergétique réduit entre les états excités singulet et triplet (DEST) de Ce6. Combinée à un blocage de point de contrôle anti-PD-L1, la libération d'antigènes associés à la tumeur après un traitement de chimiothérapie/PDT peut activer efficacement une réponse immunitaire antitumorale systémique pour l'immunothérapie anticancéreuse à distance.

2. Matériels et méthodes

2.1. Synthèse du COS-BA

Acide bétulinique (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) et NHS (17 mg, 0,15 mmol ) ont été dissous dans 3 ml de N, N-diméthylformamide (DMF). Après agitation à température ambiante pendant 30 min, 96 mg de solution aqueuse de COS (1 ml) ont été doucement ajoutés goutte à goutte au mélange et agités pendant 24 h. Ensuite, le mélange réactionnel a été dilué avec CH2Cl2 et extrait à plusieurs reprises. La couche CH2Cl2 a été évaporée et purifiée sur une colonne de gel de silice. Le BA n'ayant pas réagi a été éliminé initialement en utilisant de l'éther de pétrole : acétone (5 : 1, v/v) comme éluant, puis remplacé par un rapport de 3 : 1 pour donner du COS-BA blanc (rendement : 42 %), où le COS a été identifié comme un dimère ( nZ2). RMN 1H (40{{70}} MHz, CDCl3) d : 8,98 (1H, s, BA-28 O] CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H-25), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H-30). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) d : 179,18 (CO, COS), 156,43 (C- 28), 150,97 (C-20), 109,03 (C-29), 78,74, 77,04 , 69.32, 69.22, 65.25, 58.14, 55.62, 55.21, 53.65, 53.22, 50.52, 45.96, 44.32, 44.11, 41.85, 40.59, 38.68, 38.55, 37.32, 37. 04, 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29h09, 27h80, 27h22, 25h74, 25h53, 20h91, 19h48, 18h12, 16h02, 15h87, 15h17, 14h65, 14h62. ESIeMS m/z : 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. Préparation des NP COS-BA/Ce6

Les NP COS-BA/Ce6 co-assemblées ont été préparées par la méthode de reprécipitation en une étape. Généralement, 5 ml de solutions Ce6 (33 mmol/L) et 40 ml de solutions DMSO COS-BA (33 mmol/L) ont été d’abord mélangés. Par la suite, le mélange a été injecté rapidement dans 1 ml d'eau contenant 10 ml de NaOH (50 mmol/L) sous ultrasons (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Chine). Après sonication pendant 10 min, les NP COS-BA/Ce6 ont été obtenues par centrifugation à 13 000 tr/min (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, Chine) pendant 25 min. D'autres formulations avec différents rapports COS-BA sur Ce6 ont été préparées par le même processus avec un rapport molaire NaOH sur Ce6 constant de 3:1.

2.3. Lignées cellulaires

Les lignées cellulaires humaines MCF-7, HepG2, LO2 et de souris 4T1, L929 sont fournies par l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire, SIBS, CAS (Chine). MCF-7, HepG2 et LO2 ont été cultivés dans un milieu DMEM avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS, Gibco) et 1 % d'antibiotique pénicilline-streptomycine (Life Technology, USA) à 37 C. 4T1 et L929 ont été cultivés dans RMPI-1640 moyen avec le même rapport que ci-dessus.

2.4. Etudes de l'absorption cellulaire et des voies endocytaires

Pour étudier l'absorption cellulaire, les cellules 4T1 ou LO2 ont été incubées avec des NP Ce6 ou COS-BA/Ce6 libres (concentration équivalente de Ce6 : 1,7 mg/mL, COS-BA : 19,5 mg/mL, BA : 10 0,8 mg/mL) à différents moments. Après lavage, fixation et coloration DIPA (# D9542, Sigma), les cellules ont été photographiées sous un microscope inversé à fluorescence (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Changchun, Chine). L'intensité de la fluorescence a été déterminée par cytométrie en flux à l'aide du mini système Guava EasyCyte (Merck Millipore, Allemagne). Pour quantifier l'efficacité de l'absorption, l'accumulation cellulaire de BA et COS-BA a été mesurée par HPLC (Agilent 1200, USA). Généralement, les cellules 4T1 ont été traitées avec du COS-BA ou du BA libre (BA équivalent : 25 mg/mL) pendant 0,5 et 3 h. Après lavage avec du PBS, les culots cellulaires ont été récoltés et ont subi une homogénéisation par ultrasons (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Chine) pour la lyse cellulaire. Ensuite, COS-BA ou BA a été extrait par chloroforme pour analyse HPLC après lyophilisation des échantillons. La phase mobile était de l'eau (acide phosphorique à 0,2 %) et de l'acétonitrile à un débit de 1,0 ml/min, et les rapports de volume correspondants étaient de 60 :40 et 15 :85 (v/v) pour l'analyse du COS-BA et du BA, respectivement. . La longueur d'onde de détection était de 213 nm. Pour étudier les voies endocytaires des NP COS-BA/Ce6, les cellules 4T1 ont été ensemencées dans des plaques à puits 6- et incubées pendant 24 h avant d'être prétraitées avec divers inhibiteurs d'endocytose pendant 30 min, y compris un inhibiteur de micropinocytose [50 mmol/L , éthylisopropylamiloride (EIPA) (#N132356, Aladdin)], un inhibiteur de l'endocytose médié par la clathrine [20 mmol/L, chlorpromazine (#C7010, Solarbio)], un inhibiteur de l'endocytose médié par les cavéoles [25 mmol/L, nystatine ( #IN0260, Solarbio)], et un inhibiteur de l'acidification des lysosomes [50 mmol/L, phosphate de chloroquine (#C9720, Solarbio)]35. Ensuite, les cellules ont été cultivées avec 2 ml de NP COS-BA/Ce6 (Ce6 : 1,7 mg/mL, COS-BA : 19,5 mg/mL) pendant 2 h et imagées sous FIM (UP Optotech). Les cellules incubées sans inhibiteur endocytaire à 37 °C ont été réglées comme contrôle et à basse température (4 °C) pour l'évaluation de l'endocytose dépendante de l'énergie. Parallèlement, l’intensité moyenne de fluorescence des cellules a également été déterminée par cytométrie en flux.

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2.5. Test de cytotoxicité

Les cellules 4T1 ont été ensemencées dans une plaque à 96-puits. Ensuite, les cellules ont été traitées avec différentes concentrations de NP COS-BA pendant 24 h. Ensuite, 10 mL de colorant MTT (#M158055, Aladdin) (5 mg/mL) a été ajouté au puits et incubé pendant 4 h supplémentaires, puis 150 mL de DMSO ont été ajoutés pour dissoudre les cristaux de formazan. . L'absorbance de chaque puits à 492 nm a été enregistrée par un lecteur de microplaques. Pour le groupe d'irradiation, les cellules ont été traitées avec des médicaments pendant 4 h, puis irradiées pendant 10 min par une lumière de 675  10 nm et incubées pendant 20 h supplémentaires. La cytotoxicité des NP COS-BA/Ce6 (1 mg/mL de Ce6 correspond à 11,5 mg/mL de COS-BA et 6,4 mg/mL de BA) contre d'autres cellules (MCF-7, HepG2, LO2 et L929) ont également été déterminés par le même test MTT uniquement avec un milieu différent. Pendant ce temps, l'indice de combinaison a été calculé par le logiciel CompuSyn 2.0 en utilisant le calcul du théorème de Chou Talalay36.

2.6. Modèles animaux

Toutes les procédures expérimentales ont été exécutées conformément aux protocoles approuvés par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'université médicale de Harbin. Les cellules 4T1 ont été suspendues dans du milieu RMPI-1640 et injectées par voie sous-cutanée dans le dos droit de chaque souris BALB/c femelle (18e22 g, âgée de 6e7 semaines).

2.7. Imagerie de fluorescence in/ex vivo

Une solution de glucose à 5 % de 200 mL de COS-BA/Ce6 NPs (équivalent Ce6 : 0,35 mg/mL, COS-BA : 4,02 mg/mL) a été injectée par la veine de la queue chez des souris porteuses de tumeurs. Après cela, une imagerie par fluorescence des sites tumoraux à un moment prédéterminé a été réalisée à l'aide d'un système d'imagerie animale in vivo multimodèle AniView 100/600 (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Chine) avec une excitation à 630 nm. 24 heures après l'injection, les principaux organes (cœur, foie, rate, poumon et rein) et la tumeur ont été collectés pour une imagerie par fluorescence ex vivo. En outre, les images de fluorescence ex vivo de tumeurs et d’organes majeurs à différents moments après des injections iv de NP Ce6 ou COS-BA/Ce6 ont également été évaluées.

2.8. Chimiothérapie/PDT in vivo

Les souris porteuses de 4T1- (75e100 mm3 ) sont réparties au hasard en six groupes (n Z 5) : 1) solution de glucose à 5 % ; 2) Ce6 ; 3) Ce6 avec irradiation ; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, où BA : 22,3 mg/kg) ; 5) NP COS-BA/Ce6 ; 6) NP COS-BA/Ce6 avec irradiation. Pour chaque groupe, les souris reçoivent une injection de 200 ml de NP COS-BA/Ce6 (équivalent Ce6 : 3,5 mg/kg de corps) par la veine de la queue aux jours 0, 2 et 4. Pour les groupes d'irradiation, à 4 h après l'injection après chaque administration, toutes les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane et les sites tumoraux ont été irradiés par une lumière de 675  10 nm (150 mW/cm2) pendant 15 min. Les volumes tumoraux et le poids corporel des souris sont également enregistrés tous les deux jours. Les volumes tumoraux sont calculés par la formule : VZ largeur2 longueur/2. Après 14 jours de traitement, les tumeurs ont été excisées et pondérées pour calculer le taux d'inhibition tumorale (TIR) ​​par l'équation couramment utilisée : TIRZ (1 échantillon/contrôle) 100 %. L'échantillon et le contrôle correspondaient respectivement au poids moyen de la tumeur de chaque groupe traité et du groupe de solution aqueuse de glucose à 5 %.

2.9. Chimiothérapie/PDT/immunothérapie in vivo

Pour démontrer le potentiel des NP COS-BA/Ce6 associées à l’immunothérapie, le modèle de tumeur bilatérale a été conçu par injection sous-cutanée de cellules 4T1 dans les flancs gauche et droit. Lorsque les tumeurs approchaient de 75e100 mm3, les souris étaient divisées en cinq groupes. (1) Contrôle ; (2) NP COS-BA/Ce6 (COS-BA Z 40,2 mg/kg, où BA Z 22,3 mg/kg) ; (3) NP COS-BA/Ce6 þ léger ; (4) NP COS-BA/Ce6 þ anti-PDL1 ; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PD-L1 þ léger. Au jour 0, 200 ml de solution de glucose à 5 % (groupe 1) ou de NP COS-BA/Ce6 (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (groupes 2, 3, 4, 5) ont été injectés par voie intraveineuse à des souris. Quatre heures après l'injection, les tumeurs droites des groupes 3 et 4 ont été irradiées pendant 15 minutes. Les souris ont été anesthésiées à l’isoflurane et roulées sur un côté pour éviter d’exposer les tumeurs gauches. Ensuite, l'anticorps anti-PD-L1 (BioXcell, numéro de produit : BE0101, numéro de clone : 10F.9G2) a été injecté par voie intraveineuse à des souris des groupes 4 et 5 aux jours 2, 4 et 6 (15 mg par souris et par injection). La longueur et la largeur de chaque tumeur ont été surveillées tous les deux jours. Après 14 jours de traitement, le sérum sanguin de souris a été collecté pour évaluer l'interféron gamma (IFN-g) (#KMC4021) et le facteur de nécrose tumorale (TNF-a) (#BMS607-3) à l'aide du test ELISA (eBioscience ). Les tumeurs ont été collectées, dissociées, traitées avec un tampon de lyse des globules rouges et lavées avec du PBS par centrifugation. Ensuite, la suspension cellulaire a été colorée avec de l'anti-CD3-FITC (#MA1-10187, clone 145-2C11, eBioscience) et de l'anti-CD8a-PE (#12-0081-85, clone 53-6.7, eBioscience). Ensuite, l’infiltration de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) dans les tumeurs droite et gauche après différents traitements a été évaluée par cytométrie en flux.

3. Résultats et discussion

3.1. Synthèse, fabrication et caractérisation des NP COS-BA/Ce6

Dans cette étude, nous concevons une nouvelle petite molécule promédicament COS-BA basée sur un oligosaccharide de chitosane soluble dans l'eau (COS), qui peut augmenter l'activité chimiothérapeutique de l'acide triterpène bétulinique pentacyclique (BA) en améliorant l'absorption cellulaire grâce à une hydrophilie croissante. Le COS (degré de polymérisation, DP : 2e6) utilisé ici a été préparé par notre méthode décrite précédemment30. Ensuite, le COS-BA a été synthétisé via une réaction de condensation et de déshydratation. Combinée à l'analyse des composants principaux du COS, on pensait que la structure chimique du COS-BA était un BA modifié par un disaccharide (DP: 2) (informations à l'appui, Fig. S1), ce qui a été confirmé par RMN 1 H, RMN 13C et ESIeMS. (Informations complémentaires, figures S2eS4). L'analyse de la RMN 1 H représentative a montré le signal protonique distinct du COS autour de 2,64 à 3,93 ppm et les pics C]CH2 (4,60, 4,73 ppm) de BA, démontrant la synthèse réussie de COS-BA (Fig. 1A). Pour la préparation du réactif antitumoral synergique coassemblé COS-BA/Ce6 NP, une approche polyvalente de re-précipitation a été utilisée en coopérant avec un photosensibilisateur Ce6 très efficace. En modifiant les rapports molaires initiaux, les deux formulations de co-assemblage COS-BA / Ce6 pourraient former des nanostructures sphériques de tailles modulées (Fig. 1B et informations complémentaires, Fig. S5). Pour différents rapports d'entrée de COS-BA/Ce6, les diamètres hydrophiles des NP COS-BA/Ce6 étaient proches de 200e300 nm avec un potentiel z négatif. Étant donné que les NP préparées avec une formulation de 8: 1 présentaient un indice de polydispersité plus faible (PDI, 0, 143) avec une taille relativement plus petite (249 nm), une quantité suffisante d'agent chimiothérapeutique COS-BA était également nécessaire pour le traitement combinatoire. Par conséquent, nous avons choisi les formulations de COS-BA/Ce6 (8 : 1) pour l’étude suivante. Sous cette optimisation, les NP COS-BA/Ce6 présentaient des distributions de tailles étroites (Fig. 1C) et une bonne solubilité dans l'eau, indiquant sa nature colloïdale (Fig. 1D). Pour explorer les raisons de ce co-assemblage réussi, le comportement principal d'auto-assemblage du COS-BA libre a été étudié par microscopie électronique à balayage (MEB) (Fig. 1E), ce qui suggère que le COS-BA pourrait former un nano- sphère de w168 nm, ce qui implique que la modification chimique du COS ne modifie pas la capacité d'auto-assemblage du BA lui-même (informations complémentaires, figure S6). C’est cette propriété qui induit finalement la réussite de la construction des co-assemblages. Notamment, outre la nanostructure solide confirmée par microscopie électronique à transmission (TEM), les NP COS-BA/Ce6 présentaient une structure de coque distincte, sans COS-BA NP, et l'épaisseur moyenne de la coque était d'environ 2,35 nm. L'autre caractérisation physicochimique est résumée sur la figure 1F. En outre, les NP COS-BA/Ce6 ont montré un potentiel z négatif de 5,38 mV et une taille hydrodynamique de w249 nm, supérieure à celle obtenue par SEM (w182 nm). Simultanément, les efficacités de chargement et d’encapsulation de Ce6 étaient respectivement de 8,1 et 96 %, comme déterminé par chromatographie liquide haute performance (HPLC). De plus, les données FT-IR (Fig. 1G) ont confirmé ce co-assemblage car les NP COS-BA/Ce6 présentaient les pics caractéristiques C]N, CeN et C]CH de Ce6 apparaissant à 1633, 1078 et 633 cm 1 , respectivement.

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3.2. Mécanisme co-assemblé et formation de la structure de coque

Par la suite, afin de mieux comprendre le mécanisme de co-assemblage, nous avons d’abord étudié le processus de formation primaire des NP. Nous avons constaté que le co-assemblage de COS-BA avec Ce6 pourrait être spontané car ces deux espèces pourraient également former une nanostructure sphérique même sans sonication (informations complémentaires, Fig. S7), ce qui peut être dû au changement d'énergie libre négatif de Gibbs (DG ) en co-assemblées37. Cet assemblage spontané suggère également une interaction intermoléculaire plus forte entre COS-BA et Ce6. Généralement, les interactions intermoléculaires dans les auto (ou co-) assemblages supramoléculaires sont l'empilement p‒p non covalent, les liaisons hydrogène et les forces de Van der Waals 38,39. Pour cette analyse, nous avons ensuite étudié l'absorption UV des NP COS-BA/Ce6 (Fig. 1H et F), ce qui suggère un décalage vers le rouge des bandes Soret (410 nm) et Qy (667 nm) par rapport à Ce6 libre (405 et 665 nm, respectivement). Pendant ce temps, l’absorption caractéristique significativement décalée vers le rouge du COS-BA peut également être trouvée, indiquant un possible empilement intermoléculaire de pp entre COS-BA et Ce640. De plus, après incubation avec le tensioactif dodécylsulfate de sodium (SDS, 0,2 % p/v) (informations complémentaires, figure S8), les NP COS-BA/Ce6 ont montré une nouvelle bande Qy décalée vers le bleu à 641 nm et ont considérablement récupéré leur fluorescence, démontrant que les interactions hydrophobes ont également contribué au co-assemblage28. Depuis ces interactions associatives non covalentes, les co-assemblages ont montré une extinction remarquable de la fluorescence (98, 2%) dans l'eau (Fig. 1I). Collectivement, il est raisonnable de croire que l’empilement p‒p et les interactions hydrophobes pourraient être les principales forces motrices de la construction de co-assemblages. Ensuite, pour visualiser davantage le processus d'assemblage de manière plus intuitive et révéler les raisons sous-jacentes pour lesquelles des NP structurées en coque peuvent se former, nous avons réalisé un modèle de simulation simplifié de dynamique moléculaire (MD) contenant 16 molécules COS-BA optimisées et deux Ce6 supplémentaires dans une boîte à eau. . Initialement, nous avons évalué l'interaction/liaison possible des auto-assemblages COS-BA dans un délai de 5 ns de temps de simulation (Fig. 2A et informations complémentaires, Fig. S9). Nous avons constaté que, à l'exception de nombreuses liaisons hydrogène intramoléculaires dans la fraction COS, plusieurs paires de liaisons H intermoléculaires entre COS-BA pouvaient également être observées (Fig. 2B et informations complémentaires, Fig. S10), ce qui indique que la liaison hydrogène peut être une liaison hydrogène. des principaux moteurs de la formation des NP COS-BA. Particulièrement intéressant, dans les auto-assemblages COS-BA, toutes les molécules COS-BA forment une structure apparemment symétrique (Fig. 2C). Ce phénomène fascinant nous a motivé à explorer la relation possible entre cette propriété et la formation de NP COSBA structurés en coque. Ensuite, nous avons tenté d’élargir les unités de la boîte. Étonnamment, les boîtes connectées constituées de molécules COS-BA ont été disposées de manière régulière, ce qui a donné lieu à des structures de réseau creuses "orthogonales" (informations complémentaires, figure S11). Plus important encore, nous avons calculé de manière aléatoire l'épaisseur des molécules de la coque et avons constaté qu'elles correspondaient au TEM (w2,35 nm) (Fig. 2D). Cette tendance à former des structures de réseau creuses peut être responsable de la formation de NP structurés en coque. Pour tester cette idée, la structure MD des co-assemblages COS-BA/Ce6 a été simulée (Fig. 2E et informations complémentaires, Fig. S12). Semblable aux auto-assemblages COS-BA, un grand nombre de liaisons H intramoléculaires et intermoléculaires ont également été trouvées dans les co-assemblages (Fig. 2F et informations complémentaires, Fig. S13). De plus, l'empilement possible de pp entre C] C de COS-BA et le cycle aromatique de Ce6 a été observé dans les co-assemblages (Fig. 2G), ce qui est cohérent avec les données des enquêtes UV précédentes. Après avoir augmenté le nombre de boîtes, des structures de réseau creuses similaires peuvent toujours être trouvées, mais avec une régularité et une orthogonalité réduites (informations complémentaires, figure S14). Cela pourrait être la raison possible de la morphologie non uniforme des NP COS-BA/Ce6 par rapport aux NP COSBA. De plus, la distance coque-couche moléculaire est également proche de l'épaisseur de la coque (w 2, 35 nm) des NP, comme le montre l'utilisation du TEM (Fig. 2H). Collectivement, nous avons émis l’hypothèse que la formation de NP COS-BA/Ce6 ou de NP COS-BA structurés en coque pourrait être largement attribuée à cette tendance des molécules à s’assembler en structures de réseau à coque creuse.

Figure 1 Fabrication et caractérisation de nano-assemblages médiés par des promédicaments d'acide bétulinique modifié par des oligosaccharides de chitosane (COS-BA) NP COS-BA/Ce6. (A) Les positions clés amplifiées de 1 H RMN de COS-BA. (B) Préparation de NP COS-BA/Ce6 co-assemblés avec différents ratios COS-BA/Ce6. (C) Distribution de taille des NP COS-BA/Ce6 utilisant COS-BA et Ce6 (rapport molaire, 8:1) comme éléments de base. (D) La solubilité dans l’eau et l’effet Tyndall des co-assemblages indiquent une nature colloïdale. (E) Images SEM et TEM d’auto-assemblages COS-BA gratuits et de NP COS-BA/Ce6 co-assemblés. (F) Résumé des propriétés physicochimiques des NP COS-BA/Ce6. (G) spectres FT-IR, (H) spectres UV Vis et (I) spectres d’émission de fluorescence de Ce6 libre, COS-BA et co-assemblés COS-BA/Ce6 NP dans l’eau.

Figure 2 Structures des auto-assemblages (A) COS-BA et (E) des NP COS-BA/Ce6 co-assemblées après simulation de dynamique moléculaire (MD) pendant 5 ns avec un rapport molaire d'unité structurelle de 8 : 1 (COS-BA /Ce6, calculé sur la base de l'efficacité de chargement Ce6). Le modèle linéaire a été utilisé pour H2O et les modèles en bâton représentent les molécules COS-BA ou Ce6, où les atomes C de Ce6 sont marqués en violet. Les informations sur la liaison hydrogène entre les molécules COS-BA dans (B) ses auto-assemblages et (F) les co-assemblages COS-BA/Ce6 NP. (C) La structure apparemment symétrique de l’arrangement moléculaire COS-BA après simulation MD. (G) Les interactions moléculaires possibles entre COS-BA et Ce6 montrent un empilement potentiel de pp. L’épaisseur indiquée des molécules de coque dans une structure de réseau creuse « orthogonale » après extension des boîtes MD correspondantes de (D) auto-assemblages COSBA libres et (H) co-assemblages COS-BA/Ce6 NP.

3.3. Mécanisme énergétique de génération améliorée de 1 O2

Ensuite, nous avons examiné plus en détail la génération d'oxygène singulet (1 O2), l'une des espèces réactives de l'oxygène (ROS) critiques pour les performances de la PDT, en utilisant le DPBF (1, 3- diphénylisobenzofurane) comme sonde. Après une irradiation prolongée des solutions de mélange de NP COS-BA/Ce6 avec du DPBF, l'absorption UV du DPBF a diminué en intensité, indiquant une génération de 1 O2 (Fig. 3A). Après comparaison avec la référence du bleu de méthylène (MB), le F (1 O2) des NP COS-BA/Ce6 a été calculé comme étant 0,26, légèrement supérieur à celui du Ce6 libre (FZ0,19). (Fig. 3B). Généralement, l'énergie absorbée par les photosensibilisateurs subira trois voies de relaxation impliquant la fluorescence, l'effet de chauffage via la relaxation vibratoire et la génération de ROS via un croisement intersystème (ISC)41. Conformément à l'émission de fluorescence considérablement atténuée, les NP COS-BA/Ce6 n'ont également favorisé aucun effet de chauffage dans l'eau (informations complémentaires, figure S15), ce qui impliquait un processus ISC amélioré après le co-assemblage de Ce6 avec COS-BA, conduisant ainsi à la génération 1 O2 améliorée. Pour élucider davantage le mécanisme moléculaire d'un tel effet, nous avons tenté d'optimiser et de calculer le modèle possible à molécule unique de COS-BA/Ce6 constitué d'un empilement potentiel de pp obtenu à partir de la simulation MD par la théorie fonctionnelle de la densité (DFT) (Fig. 3C). . Étonnamment, COS-BA/Ce6 a montré une absorption UV décalée vers le rouge observable de 581,24 nm par rapport à celle du Ce6 libre (579,30 nm), indiquant l'apparition d'un empilement de pp (Fig. 3D). Bien que la géométrie minimisée en énergie de COS-BA/Ce6 ait montré de légères différences structurelles avec la configuration MD entrée, le pempilement distinctif entre les liaisons C]C ou C]O de COS-BA avec l'anneau porphine de Ce6 était toujours observable, validant en outre que le au-dessus de p‒p, l’empilement est possible. Parallèlement, il a été récemment démontré que l'efficacité accrue du don d'électrons par l'empilement p‒p pourrait faciliter le processus ISC42, tandis que le taux d'ISC (KISC) est proportionnel à (1/DEST) 2,43. Autrement dit, l’écart énergétique inférieur (DEST) du photosensibilisateur améliorera le processus ISC favorisant une génération efficace de ROS. Nous calculons ensuite l'état singulet excité le plus bas (S1) et l'état triplet (T1) de Ce6 et COS-BA/Ce6 (Fig. 3E), respectivement. Les résultats ont indiqué que COS-BA/Ce6 présentait une diminution de DEST de 1,1892 eV par rapport au Ce6 libre (1,2001 eV), confirmant le processus ISC amélioré. La réduction de DEST est utile pour la production de 1 O2, ce qui a également été vérifié dans d'autres nanophotosensibilisateurs44. Dans l’ensemble, l’empilement p semble réduire le DEST de Ce6 après co-assemblage avec COS-BA, conduisant ainsi à une génération améliorée de 1 O2.

Figure 3 Mécanisme énergétique de génération améliorée de 1 O2 induite par les NP COS-BA/Ce6. (A) Spectres UV Vis de photodécomposition du 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF) après irradiation prolongée des NP COS-BA/Ce6. (B) Dans les tracés de premier ordre des changements d’absorption UV (DOD) du DPBF, le rendement en 1 O2 a été évalué en utilisant du bleu de méthylène (MB) (FZ 0.52) dans du DMSO comme composé de référence. (C) Structures à énergie minimisée d’un éventuel modèle COS-BA/Ce6 à molécule unique vue de côté et de face, qui a été obtenue selon la configuration moléculaire initiale entre Ce6 avec COS-BA après simulation MD et après calculs DFT. (D) Transitions prévues des spectres d’absorption UV Vis (barres verticales) de Ce6 libre et un modèle COS-BA/Ce6 optimisé. (E) Niveaux d'énergie calculés de leur état singulet excité le plus bas (S1) et de leur état triplet le plus bas (T1), respectivement, [Gaussian 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Où DEST a été calculé comme ES1 ET1.

3.4. Caractéristiques de la dormance de la chimiothérapie

Par la suite, pour valider le concept de conception de la présente étude selon lequel le développement d'une molécule amphiphile COS-BA pourrait augmenter efficacement l'effet thérapeutique du BA en améliorant l'absorption cellulaire grâce à une hydrophilie croissante, et en construisant davantage de COS-BA/Ce6 sensibles aux stimuli et entièrement hydrophiles. Les NP ont facilité sa dormance dans les tissus normaux et son activation dans les sites tumoraux. Pour tester cette hypothèse, nous avons d'abord étudié le comportement de libération du médicament des NP COS-BA/Ce6 dans diverses solutions tampons (Fig. 4A). Les résultats ont indiqué que les NP COS-BA/Ce6 présentaient un comportement sensible au pH avec une libération cumulée de Ce6 de 88 % à pH 5,6 et de 57 % à pH 7,4 après 24 h, respectivement. Cette caractéristique résulte probablement de la destruction de nombreuses liaisons hydrogène qui existaient dans les NP COS-BA/Ce6 après l'introduction de Hþ45 acide, conduisant ainsi à une libération accrue de Ce6 (Fig. 4B). Cela a en outre été confirmé par le désassemblage des NP COS-BA / Ce6 après incubation directement dans des environnements acides (Fig. 4C). Cette caractéristique sensible au pH peut être bénéfique pour une thérapie antitumorale efficace en raison du microenvironnement tumoral faiblement acide34. Pendant ce temps, les NP COS-BA/Ce6 présentaient une meilleure stabilité car aucun changement significatif de taille ou de PDI n'a pu être observé après une incubation dans du PBS et du milieu de culture cellulaire 1640-RMPI pendant 10 jours (informations complémentaires, figure S16), ce qui serait important. pour leur utilisation potentielle pour d’autres applications biomédicales. Par la suite, des recherches plus approfondies ont été menées en évaluant la cytotoxicité du BA lipophile libre (angle de contact q : 133,3) et du COS-BA amphiphile (q : 52) (Fig. 4D) par un test standard au bromure de méthylthiazolyl-diphényltétrazolium (MTT). Comme prévu, que ce soit pour les cellules cancéreuses 4T1 ou les hépatocytes LO2 normaux, le COS individuel n'a pratiquement aucune activité anticancéreuse à des doses relativement faibles. Cela pourrait être dû au fait que les effets anti-prolifération du COS sont activés via l’induction de la voie de signalisation NF-kB uniquement à des concentrations élevées (environ au niveau du milligramme)30. Alors que le COS-BA présente une cytotoxicité remarquablement améliorée avec des valeurs IC50 extrêmement faibles (6,03 mg/mL pour 4T1 et 9,92 mg/mL pour LO2) par rapport à celles du BA (17,63 mg/mL pour 4T1 et 20,53 mg/mL pour LO2), même aux mêmes concentrations massiques (Fig. 4E et J). Les résultats obtenus impliquaient que la modification du COS hydrosoluble améliore considérablement l’efficacité de l’absorption cellulaire du BA lipophile, conduisant ainsi à la forte activité anticancéreuse du COS-BA. Pour quantifier l'efficacité de l'absorption, l'accumulation de BA ou de COS-BA dans les cellules 4T1 a été directement déterminée par HPLC (informations complémentaires, figure S17). Les résultats confirment clairement que le COS-BA amphiphile présente une absorption significativement plus élevée que le BA libre (environ 3,6- fois après 3 h d'incubation), démontrant l'activité chimiothérapeutique améliorée du COS-BA. La conclusion ci-dessus a été étayée par la cytotoxicité considérablement améliorée du COSBA amphiphile contre les cellules cancéreuses HepG2 et MCF -7 (informations complémentaires, Fig. S18), qui sont tout à fait cohérentes avec le concept de conception. Après co-assemblage avec Ce6, nous avons constaté que les NP COS-BA/Ce6 sans irradiation présentaient une cytotoxicité remarquablement inhibée contre les cellules cancéreuses 4T1 par rapport au COS-BA équivalent, en particulier à 11,5 mg/mL, mais l'activité PDT de base n'était pas affectée ( Figure 4F). Pour valider ce phénomène plus complètement, nous avons étudié plus en détail la cytotoxicité in vitro des NP COS-BA/Ce6 contre d'autres cellules cancéreuses, notamment MCF-7 et HepG2. Il est intéressant de noter que le COS-BA amphiphile a montré une cytotoxicité très forte contre les cellules MCF-7 (Fig. 4G), mais l'activité chimiothérapeutique a diminué de manière significative après le co-assemblage avec Ce6, c'est-à-dire les NP COS-BA/Ce6 non irradiées. Des résultats similaires ont également été observés dans les cellules HepG2, avec une légère diminution seulement (Fig. 4H). Pour étayer davantage les conclusions ci-dessus, nous avons également évalué les effets chimiothérapeutiques des nano-assemblages et du COS-BA contre les cellules L929 de fibroblastes de souris normales et les hépatocytes LO2 humains (Fig. 4I). Les résultats ont indiqué que les NP COS-BA/Ce6 assemblées réduisaient de manière significative le médicament amphiphile hautement toxique original COS-BA, montrant une excellente biocompatibilité. En analysant la cytotoxicité, les valeurs IC50 du COS-BA amphiphile étaient significativement inférieures à celles des NP COS-BA/Ce6 co-assemblées, indépendamment du cancer ou des cellules normales (Fig. 4J). C’est-à-dire que la construction de nano-coassemblages complètement hydrophiles et sensibles aux stimuli peut supprimer efficacement à l’avance la cytotoxicité élevée du médicament amphiphile COS-BA. Compte tenu de la caractéristique distinctive sensible au pH, il semble que les NP COS-BA/Ce6 seront dormantes dans les tissus normaux avec une faible toxicité souhaitée en chimiothérapie, mais actives dans les tissus tumoraux en raison de leur libération stimulante de COS-BA hautement toxique dans la tumeur faiblement acide. microenvironnement. Pris ensemble, contrairement à la néofonctionnalisation largement rapportée de réactifs chimiothérapeutiques qui ont amélioré l'activité anticancéreuse22,23, les nano-assemblages amphiphiles médiés par COS-BA présentent non seulement une caractéristique de « dormance » intelligente avec des effets de chimiothérapie insidieux, mais conservent également une activité PDT spécialisée, montrant un énorme potentiel. pour une thérapie antitumorale intelligente.

Figure 4 (A) Profils de libération de Ce6 in vitro à partir de NP COS-BA/Ce6 dans du PBS (pH 7,4, 6,5 ou 5,6) contenant du Tween 80 (0,5 %, v/v) à 37 C. (B) Le mécanisme possible sensible au pH par lequel Hþ déclenche le désassemblage des NP. (C) Le désassemblage des NP COS-BA/Ce6 après incubation directe dans de l'eau d'environ pH 4. 0. (D) L’angle de contact des NP libres BA, Ce6, COS-BA et COS-BA/Ce6, respectivement. (E) Cytotoxicité cellulaire du BA libre, du COS et du COS-BA amphiphile contre les cellules cancéreuses 4T1 représentatives et les cellules LO2 normales. Viabilité cellulaire des cellules cancéreuses (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 après avoir été incubées avec des NP COS-BA, COS-BA/Ce6 libres avec/sans irradiation à la concentration équivalente de COS-BA indiquée pendant 24h. (I) Cytotoxicité cellulaire des NP COS-BA libres, COS-BA/Ce6 non irradiés contre les cellules LO2 et L929 normales. (J) L'analyse IC50 du COS-BA contre le cancer et les cellules normales. Les données sont exprimées en moyenne SD (n Z 6). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 et ***P ˂ 0,001 montrent les différences significatives.

Pour explorer les raisons possibles de cette caractéristique de dormance de la chimiothérapie, le comportement d'absorption cellulaire en fonction du temps des NP COS-BA/Ce6 a été évalué successivement par incubation avec des cellules cancéreuses 4T1. Les résultats ont indiqué que, bien que les NP COS-BA / Ce6 présentaient une extinction remarquable de la fluorescence, elles présentaient toujours une efficacité phagocytaire améliorée par rapport au Ce6 libre en raison de la fluorescence rouge cytoplasmique plus forte, déterminée par analyse quantitative par cytométrie en flux (Fig. 5A). Cette internalisation cellulaire améliorée des NP peut être attribuée à l’endocytose21. Pris ensemble, nous avons émis l'hypothèse que, bien que les co-assemblages COS-BA/Ce6 NP hautement solubles dans l'eau (angle de contact q : 36,7) présentaient une endocytose cellulaire améliorée par rapport au Ce6 lipophile (q : 132,6, proche de BA), l'efficacité de phagocytose réduite de Les NP pourraient apparaître par rapport à la molécule amphiphile COS-BA, semblant ainsi supprimer la cytotoxicité chimiothérapeutique des NP COS-BA/Ce6. C’est-à-dire l’efficacité d’absorption cellulaire de élevée à faible en tant que séquence : COS-BA amphiphile, NP COS-BA/Ce6 hydrophiles, BA lipophile ou Ce6. Plus important encore, le désassemblage inadéquat des NP cellulaires pourrait être une autre raison importante de l’affaiblissement de l’effet chimiothérapeutique, qui pourrait être lié à la dormance intelligente des NP COS-BA/Ce6 en chimiothérapie. En outre, étant donné que le désassemblage des NP a été spécifiquement effectué dans l'environnement acide des cellules tumorales, afin de démontrer la caractéristique sensible au pH, nous avons en outre tenté de comparer les effets d'absorption des NP COS-BA/Ce6 dans des cellules LO2 normales (Fig. 5B). . Cependant, les NP COS-BA/Ce6 ne présentaient pas d'inhibition significative de la fluorescence rouge Ce6 dans les cellules LO2. En revanche, le comportement d'absorption par LO2 était similaire à celui des cellules cancéreuses 4T1, ce qui suggère que les NP COS-BA/Ce6 peuvent également se désassembler même dans les cellules normales, ce qui peut résulter des compartiments intracellulaires au pH faiblement acide (endosomes/lysosomes) existants à l'intérieur. à la fois le cancer et les cellules normales46. Étant donné que l’absorption cellulaire des NP dépend du processus d’endocytose, l’incubation directe du médicament pourrait ne pas mettre en évidence la réactivité au pH des NP COS-BA/Ce6 au niveau cellulaire. Néanmoins, le microenvironnement tumoral (TME) est très acide par rapport aux tissus normaux47. Indépendamment du cancer intracellulaire ou du TME, les NP COS-BA/Ce6 peuvent être sensibles au pH et démontés pour déclencher la libération de COS-BA hautement toxique. Alors que, dans les tissus normaux, les NP COS-BA/Ce6 ne pouvaient être désassemblés qu’après être entrés dans un environnement cellulaire normal, réduisant ainsi la probabilité de libération de COSBA. Par conséquent, nous déduisons que la caractéristique de dormance de chimiothérapie des NP COS-BA/Ce6 dans le microenvironnement tumoral est valide et fiable, et que l’idée de conception de la présente étude est réalisable.

3.5. Efficacité anticancéreuse de la chimiothérapie in vitro/PDT des NP COS-BA/Ce6

De plus, avant de détailler l'efficacité anticancéreuse de la chimiothérapie in vitro/PDT des NP COS-BA/Ce6 et pour mieux découvrir le mécanisme de l'endocytose, nous étudions les quatre principales voies de l'endocytose en ajoutant des inhibiteurs endocytaires correspondants, notamment la chlorpromazine (à médiation par la clathrine), le phosphate de chloroquine ( inhibiteur de l'acidification des lysosomes), la nystatine (à médiation par les caveoles) et un inhibiteur de la macropinocytose EIPA (amiloride d'éthylisopropyle) (Fig. 5C et D). Nous observons que l'introduction de la nystatine et de la chlorpromazine pourrait inhiber plus efficacement l'efficacité phagocytaire que l'EIPA et le phosphate de chloroquine, montrant une fluorescence cellulaire significativement diminuée par rapport à la normale 37 C. Ces résultats ont indiqué que les NP COS-BA/Ce6 étaient internalisées par de multiples mécanismes, principalement par le biais de les voies d'endocytose médiées par la clathrine et les cavéoles. Depuis l'augmentation de la génération de 1 O2 via des interactions intermoléculaires, les NP COS-BA/Ce6 présentent un rendement en ROS intercellulaire significativement amélioré par rapport à celui de Ce6, comme l'indique la fluorescence verte plus forte de la sonde DCFH (Fig. 5E), ce qui implique une efficacité photodynamique plus élevée. Les tests MTT démontrent que les NP COS-BA / Ce6 sous irradiation exercent un effet d'inhibition remarquablement amélioré sur les cellules 4T1 par rapport à celui du Ce6 équivalent, tout en présentant une cytotoxicité relativement modérée sans irradiation (Fig. 5F). De manière significative, la CI50 du Ce6 (0,53 mg/mL) dans les NP COS-BA/Ce6 était bien inférieure à celle du Ce6 libre (1,39 mg/mL) (Fig. 5G), suggérant une efficacité PDT remarquablement améliorée, qui était en outre parfaitement démontrée par la cytotoxicité des NP COSBA/Ce6 contre les cellules cancéreuses humaines MCF-7 et HepG2 (informations complémentaires, figure S19). De même, par rapport au Ce6 libre, les valeurs IC25, IC50 et IC75 relativement inférieures ont également été observées dans les co-assemblages (Fig. 5G). Pendant ce temps, par rapport à la Ce6 PDT seule et à une chimiothérapie unique de NP dans l'obscurité, les NP COS-BA/Ce6 sous irradiation ont permis d'obtenir une chimiothérapie combinée/PDT plus efficace contre les trois cellules cancéreuses ci-dessus, montrant une synergie (indice de combinaison : IC ˂ 1) ( Figure 5I). En outre, la double coloration par fluorescence des cellules vivantes/mortes utilisant l'ester de calcéine-acétoxyméthyle (calcéine-AM) et l'iodure de propidium (PI) a en outre confirmé que les NP COS-BA/Ce6 pouvaient induire efficacement l'apoptose et la nécrose cellulaire, car les cellules traitées étaient presque colorées. avec un signal de fluorescence PI rouge lorsqu'il est cultivé pendant 10 h supplémentaires après l'irradiation (Fig. 5H). Pendant ce temps, les NP COS-BA/Ce6 non irradiés (dose plus élevée de Ce6 : 3,2 mg/mL) avaient également une certaine activité chimiothérapeutique, comme le montrent simultanément les signaux AM et PI. Cette activité PDT remarquablement améliorée des NP COS-BA/Ce6 a été en outre validée par la coloration AM/PI après un traitement de 20 h supplémentaires (informations complémentaires, figure S20). De plus, lors de l'ajout d'azoture de sodium (SA) et de D-mannitol (DM), un extincteur spécial séparé de 1 O2 et $OH48, aux cellules 4T1 traitées avec COS-BA/Ce6 NPs-PDT, la viabilité cellulaire évidemment accrue impliquait que Des photoréactions de type I ($ OH) et de type II (1 O2) se sont produites simultanément dans le processus PDT médié par les NP COSBA / Ce6 (Fig. 5J). De plus, les NP COS-BA/Ce6 possèdent particulièrement une meilleure compatibilité sanguine, comme l'indique l'hémolyse négligeable des globules rouges (Fig. 5K), suggérant le potentiel d'applications biomédicales via une administration intraveineuse.

3.6. Biodistribution in vivo des NP COS-BA/Ce6

Par la suite, avant l'enquête sur la distribution in vivo, nous avons ensuite évalué la pharmacocinétique des NP COS-BA/Ce6 en surveillant la concentration de Ce6 dans le sang après injection par voie intraveineuse avec des NP Ce6 ou COS-BA/Ce6 équivalentes. Les profils concentration-temps de Ce6 dans le sang (Fig. 6A) et les paramètres pharmacocinétiques comparatifs (tableau d'informations complémentaires S1) confirment clairement que les NP COS-BA/Ce6 ont une circulation prolongée dans la circulation sanguine, ce qui peut permettre une plus grande accumulation au niveau de la tumeur. des sites. En particulier, les NP COS-BA/Ce6 ont montré une élimination sanguine rapide en 2 heures, ce qui implique une biodégradabilité favorable. En conséquence, nous avons ensuite étudié la biodistribution in vivo et la capacité d’accumulation tumorale des NP COS-BA/Ce6 (Fig. 6B et C). Semblables aux nanocomposites Ce6 universellement rapportés, les NP COS-BA/Ce6 peuvent être distribués rapidement dans tout le corps. En particulier au cours des 4 premières heures, les assemblages ont présenté une émission de fluorescence évidemment plus forte au niveau des sites tumoraux que le Ce6 libre, ce qui suggère une meilleure capacité de rétention et d'accumulation ciblée sur la tumeur des NP COS-BA/Ce6, probablement attribuée à l'effet passif de rétention de perméabilité améliorée (EPR). apportés par les nanoparticules14. Six heures après l'injection, l'intensité de la fluorescence au niveau des sites tumoraux a progressivement diminué rapidement. Notamment, contrairement aux nanocomposites couramment rapportés avec une accumulation tumorale significativement accrue par rapport au médicament positif libre29, les NP COS-BA/Ce6 n'ont pas montré d'accumulation très importante au niveau des sites tumoraux 24 h après l'injection par rapport au Ce6 libre (Fig. 6C), qui était renforcé en outre par l'imagerie de la tumeur excisée (Fig. 6D et E). L’excellente biodégradabilité des NP pourrait être responsable de l’introduction de petites molécules organiques naturelles. Cela a également été observé avec d’autres nano-assemblages médiés par de petites molécules de terpénoïdes49. En outre, les NP COS-BA / Ce6 présentaient également une distribution tissulaire similaire à celle du Ce6 libre (Fig. 6E), et l'intensité moyenne de fluorescence ex vivo était généralement inférieure à celle présentée in vivo, ce qui implique en outre une bonne biodégradabilité. De plus, compte tenu de la différence étroite de niveau de fluorescence entre 2 et 4 h après l'injection de NP et de Ce6, ainsi que de l'opérabilité expérimentale permettant des intervalles suffisants pour l'irradiation, 4 h après l'administration ont été choisies comme moment de lumière pour le traitement PDT ultérieur.

Compte tenu de l'accumulation de tumeurs peu importante à 24 h par rapport au Ce6 libre, pour valider davantage l'effet EPR accru des NP COS-BA/Ce6, nous avons immédiatement surveillé les images de fluorescence ex vivo des tumeurs à différents moments après l'injection intraveineuse de nanomédicaments ( Fig.6F et G). Remarquablement, que ce soit 20 minutes ou 12 heures après l'injection, les NP COS-BA/Ce6 ont en effet montré une émission de fluorescence plus forte au niveau des sites tumoraux que le Ce6 libre, démontrant une capacité excellente et améliorée d'accumulation de tumeur. Pendant ce temps, au fil du temps, les intensités de fluorescence retenues dans le tissu tumoral se sont progressivement affaiblies (Fig. 6G), ce qui est tout à fait cohérent avec les résultats de l'imagerie de fluorescence animale in vivo. De toute évidence, ce métabolisme biologique rapide et cette accumulation accrue de tumeurs ont permis d’éviter une toxicité potentielle à long terme, garantissant ainsi une thérapie antitumorale très efficace avec une meilleure biosécurité.

Figure 5 Efficacité anticancéreuse in vitro des NP COS-BA/Ce6. Internalisation cellulaire de (A) cellules cancéreuses 4T1 et (B) cellules normales LO2 incubées dans des NP Ce6 ou COS-BA/Ce6 libres pendant 0,5 et 3 h, et analyse cytométrique en flux correspondante de l’intensité de fluorescence. (C) Inhibition de l'absorption d'études spécifiques de la voie endocytaire et (D) intensité de fluorescence correspondante des cellules mesurée par cytométrie en flux après incubation avec des NP COSBA/Ce6 avec/sans inhibiteurs endocytaires, notamment la chlorpromazine, la chloroquine, la nystatine et l'amiloride d'éthylisopropyle (EIPA). Barres d'échelle Z 20 mm. (E) Génération de ROS cellulaires induite par des NP libres Ce6 ou COS-BA/Ce6 (équivalent Ce6 : 1,6 mg/mL). Barres d'échelle Z 20 mm. (F) Viabilité cellulaire des cellules 4T1 après divers traitements pendant 24 h. (G) Analyse IC25, IC50, IC75 des NP libres Ce6 et COS-BA/Ce6 contre les cellules 4T1, MCF-7 et HepG2, respectivement. (H) Coloration vivante/morte de calcéine-AM/iodure de propidium (PI) des cellules 4T1 traitées par COS-BA/Ce6 (Ce6 : 1,6 mg/mL) après incubation pendant 10 h supplémentaires, ainsi que des cellules COS- non irradiées. NP BA/Ce6 (Ce6 : 3,2 mg/mL). Barres d'échelle Z 50 mm. (I) Indice de combinaison (CI) des NP COS-BA/Ce6 sur les cellules 4T1, MCF-7 et HepG2, tel que déterminé par le calcul du théorème de Chou Talalay. (J) Mécanismes PDT (Type I et Type II) induits par l'irradiation de NP COS-BA/Ce6 et évalués par l'azide de sodium (SA) et le D-mannitol (DM) spécifiques d'extincteurs 1 O2 et $OH, respectivement. (K) Pourcentage d’hémolyse des globules rouges après incubation avec des NP COS-BA/Ce6 pendant 4 h. Les données sont exprimées en moyenne SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 et ***P ˂ 0,001 montrent les différences significatives.

Figure 6 Circulation sanguine in vivo et biodistribution des NP COS-BA/Ce6. (A) Profils de concentration-temps de Ce6 dans le sang après des injections iv de Ce6 équivalents ou de NP COS-BA/Ce6 co-assemblés (n Z 3). (B) Images de fluorescence du corps entier de souris porteuses de tumeur 4T1 après injections iv des médicaments indiqués à différents moments. (C) Intensité moyenne de fluorescence obtenue à partir des sites tumoraux en (B). (D) Images de fluorescence ex vivo de tumeurs et d’organes majeurs excisés des souris ci-dessus à 24 h, et résultat quantitatif d’intensité de fluorescence correspondant (E) (n Z 3). (F) Images de fluorescence ex vivo de tumeurs et d’organes majeurs à différents moments après des injections iv de NP Ce6 ou COS-BA/Ce6, et (G) analyse d’intensité de fluorescence correspondante des tumeurs. Les données sont exprimées en moyenne SD (n Z 3).

3.7. Traitement antitumoral combinatoire chimiothérapie in vivo/PDT 

Motivée par la caractéristique unique de dormance, la bonne biodégradabilité et l’activité PDT, la thérapie antitumorale combinée chimiothérapie/PDT in vivo a été étudiée. Des souris porteuses de tumeur 4T1 ont été divisées au hasard en 6 groupes et ont reçu une injection intraveineuse de Ce6 équivalent (3,5 mg/kg de corps) tous les 2 jours pour un total de trois doses. Quatre heures après l'injection, les sites tumoraux des souris des groupes lumineux ont été irradiés pendant 15 minutes (Fig. 7A). Pendant ce temps, les volumes tumoraux ou poids corporels correspondants ont été enregistrés tous les deux jours. Après 14 jours de traitement (Fig. 7B), le Ce6 libre avec irradiation et le COS-BA libre étaient inefficaces pour la suppression de la tumeur, probablement en raison de l'accumulation limitée du médicament dans le tissu tumoral. En revanche, après irradiation des NP COS-BA/Ce6, l’inhibition tumorale la plus significative a été observée, validant l’excellente efficacité de l’association chimiothérapie/PDT. Les poids moyens des tumeurs (Fig. 7D) et les photographies correspondantes de tumeurs disséquées (Fig. 7E) ont tous deux démontré la meilleure efficacité antitumorale des NP COS-BA/Ce6 sous irradiation, car les souris traitées présentaient les tailles de tumeurs les plus petites que celles des autres groupes. Le taux moyen d'inhibition tumorale des NP COS-BA/Ce6 traités par PDT a atteint 80,3 %, supérieur à celui du Ce6 PDT libre (42,4 %) et du COS-BA libre (38,5 %). Notamment, bien que des études in vitro antérieures aient montré que les NP COS-BA/Ce6 sans lumière présentaient une fonction dormante d'activité chimiothérapeutique, elles présentent toujours une efficacité antitumorale améliorée (49,5 %) par rapport au COS-BA libre (Fig. 7D). Nous avons émis l’hypothèse que deux raisons possibles contribuent à ce résultat : l’une est l’accumulation tumorale plus élevée de NP COS-BA/Ce6 en raison de l’effet EPR largement rapporté. Un autre facteur est le microenvironnement tumoral faiblement acide qui a stimulé la libération de COS-BA hautement toxique. En raison de la concentration micellaire critique plus élevée (CMC, 187 mg/mL) de COS-BA (informations complémentaires Fig. S21), il pourrait exister à l'état monomère dans l'environnement tumoral, favorisant ainsi la chimiothérapie améliorée du COS-BA non irradié. NP BA/Ce6. En outre, pour vérifier davantage l'efficacité anticancéreuse supérieure des NP COS-BA / Ce6, une coloration des tumeurs à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) a été réalisée (Fig. 7G).

Figure 7 Étude d'efficacité avec un modèle de xénogreffe sous-cutanée 4T1. (A) Illustration schématique du traitement PDT in vivo. (B) Profils de croissance tumorale, (C) changements de poids corporel et (D) poids de tumeur excisés contenant des taux d'inhibition tumorale de souris portant 4T1- après divers traitements dans les groupes indiqués (n Z 5 pour chaque groupe). (E) Images de tumeurs excisées provenant de souris représentatives après traitement. (F) Analyse biochimique sérique après traitement avec des NP COS-BA/Ce6 pendant 14 jours. (G) Coloration H&E représentative des sections de tumeur excisées après différents traitements. Barres d'échelle Z 50 mm. (H) Coloration TUNEL de sections tumorales libres traitées par Ce6 et COS-BA/Ce6 NPs PDT. Barres d'échelle Z 20 mm **P < 0,01 indique les différences significatives.

Les résultats ont indiqué que les coupes de tumeurs traitées par COS-BA/Ce6 NPs-PDT présentaient une grave détérioration des tissus et un déficit en noyaux, tandis qu'une nécrose tissulaire modérée était observée dans les autres groupes. Simultanément, par rapport à la lumière Ce6 libre, les NP COS-BA/Ce6 sous irradiation ont remarquablement augmenté le nombre de cellules TUNEL-positives présentant une coloration nucléaire brune plus forte (Fig. 7H), confirmant ainsi l'excellente thérapie combinée chimiothérapie/PDT. De plus, aucune variation évidente du poids corporel n'a été observée dans tous les groupes (Fig. 7C). Même si les groupes COSBA/Ce6 NP ou Ce6 légers présentaient une légère perte de poids corporel pendant l'administration, le poids corporel revenait à la normale après quelques jours. Aucun dommage évident ni lésion inflammatoire n'a pu être trouvé dans les principaux organes prélevés à la fin des traitements (informations complémentaires, Fig. S22), ce qui indique la faible ou l'absence de toxicité systémique et la bonne biosécurité des NP COS-BA/Ce6. De plus, bien que les NP COS-BA/Ce6 soient principalement accumulées dans les tissus hépatiques, les marqueurs de la fonction hépatique correspondants (ALT, AST et ALP) n'ont pas montré de changements significatifs par rapport aux souris normales en bonne santé (Fig. 7F), suggérant une meilleure biocompatibilité. De plus, les marqueurs de la fonction rénale (BUN, CRE et UA) et les paramètres biochimiques (ALB et TBIL) semblaient également similaires à ceux des souris normales, ce qui implique en outre une meilleure biosécurité. De toute évidence, ces co-assemblages COS-BA/Ce6 NP médiés par COS-BA, petites molécules organiques promédicament, possèdent de multiples caractéristiques thérapeutiques favorables qui ouvrent des possibilités attrayantes pour des applications en médecine clinique.

3.8. Immunité antitumorale de la chimiothérapie combinée/PDT et du blocage anti-PD-L1

Récemment, de nombreuses études innovantes ont montré que la combinaison de l’immunothérapie anticancéreuse avec d’autres modalités de traitement pourrait effectivement susciter des réponses immunitaires spécifiques à la tumeur pour éliminer les tumeurs primaires ou distantes1. Encouragés par la fonction unique de dormance de la chimiothérapie et l'excellente efficacité antitumorale des NP COS-BA/Ce6 en chimiothérapie/PDT, nous nous demandons donc si elles pourraient également déclencher des réponses immunologiques avec l'aide d'un adjuvant immunitaire anti-PD-L1 pour provoquer une thérapie antitumorale très efficace. . Pourrait-il traiter des tumeurs distantes qui ne peuvent pas être traitées directement par traitement PDT, offrant ainsi une stratégie alternative pour les applications cliniques anticancéreuses ? Pour tester cette hypothèse, dans cette étude, un modèle à « deux tumeurs » a été établi et des procédures expérimentales détaillées ont été présentées sur la figure 8A. En règle générale, deux tumeurs 4T1 ont été inoculées dans les flancs gauche et droit de chaque souris. Considérant que l'anti-PD-L1 seul n'a pas d'effet immunothérapeutique évident50, les expériences ont été divisées en 5 groupes comprenant un groupe non traité, les NP COS-BA/Ce6, les NP COS-BA/Ce6 avec anti-PD-L1, COS- NP BA/Ce6 avec lumière, NP COS-BA/Ce6 avec lumière et anti-PD-L1. Après une seule injection iv de NPs (Ce6 : 3,5 mg/kg), les tumeurs droites (tumeur primaire) des groupes clairs ont été irradiées pendant 15 min pour évaluer les effets immunologiques de la PDT/chimiothérapie, tandis que les tumeurs gauches (tumeurs distantes) dans tous les groupes sans aucun traitement ont été sélectionnés pour une chimiothérapie individuelle. Par la suite, les jours 2, 4 et 6, des souris des groupes immuns ont reçu une injection iv d'anticorps anti-PD-L1 (15 mg par souris et par injection) pour un total de trois doses. De manière significative, indépendamment du traitement PDT ou non, les NP COS-BA/Ce6 plus anti-PD-L1 pourraient inhiber efficacement la progression de la tumeur primaire (Fig. 8B). Et les taux moyens d'inhibition de la tumeur correspondants ont atteint séparément 86,7 % (irradiation) et 76,5 % (pas d'irradiation), bien plus élevés que la chimiothérapie individuelle (5,7 %) ou le traitement chimiothérapie/PDT (27,4 %) (Fig. 8C). . Les photographies de tumeurs disséquées (Fig. 8D) et de souris porteuses de 4T 1- (informations complémentaires, Fig. S23) après 14 jours de traitement ont également étayé visuellement la conclusion ci-dessus. Ces résultats suggèrent que la chimiothérapie à base de NP et la chimiothérapie/PDT pourraient activer efficacement l'immunité antitumorale. Pendant ce temps, de manière plus frappante, le blocage anti-PD-L1 plus les NP offraient également un effet d'inhibition tumorale remarquable sur les tumeurs distantes (à gauche) non irradiées (Fig. 8E et F), généralement plus fort que les NP COS-BA/Ce6 seuls, ce qui était également confirmé par les images de tumeurs et de souris disséquées correspondantes après traitement (Fig. 8D et Fig. S23), démontrant en outre la réponse immunitaire antitumorale efficace induite par les NP COS-BA/Ce6.

Pour explorer pleinement cette réponse immunitaire antitumorale efficace, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8þ, un immunocyte essentiel pour l'immunothérapie du cancer4, ont été évalués plus en détail en analysant les cellules immunitaires des tumeurs droites ou gauches après 14 jours de traitement. Il a été constaté que les NP COS-BA / Ce6 plus anti-PD-L1 avec ou sans traitement PDT induisaient une forte infiltration de CD8þ CTL dans les tumeurs primaires (Fig. 8H et J). L'infiltration de CD8þ CTL était jusqu'à 11,3 % après une chimiothérapie/PDT à base de NP COS-BA/Ce6 plus un traitement anti-PD-L1, légèrement supérieure à celle des NP COS-BA/Ce6 plus anti-PD-L1 (9,63 %), et beaucoup plus élevé que celui des autres groupes sans anti-PD-L1, y compris le traitement par chimiothérapie à base de COS-BA/Ce6 NP (5,12 %) ou la chimiothérapie/PDT seule (4,07 %). De même, par rapport aux groupes non immuns, une infiltration significativement accrue de CTL a également été observée dans les tumeurs gauches (lointaines) chez les souris après NP COS-BA/Ce6 plus antiPD-L1 avec ou sans traitement PDT (Fig. 8I et K), en outre impliquant des réponses immunitaires très efficaces induites par la chimiothérapie ou la thérapie combinée chimiothérapie/PDT. Pendant ce temps, après l'introduction de l'anti-PD-L1, la chimiothérapie à base de COS-BA/Ce6- et la chimiothérapie/PDT ont conduit à une production robuste de plusieurs cytokines qui jouent un rôle central dans la régulation des fonctions cytotoxiques des CTL8, y compris les tumeurs. facteur de nécrose alpha (TNF-a) (Fig. 8L) et interféron gamma (IFN-g) (Fig. 8M) dans les échantillons de sérum de souris après 14 jours de traitement, confirmant en outre l'existence de réponses immunitaires antitumorales efficaces. En outre, aucun changement apparent dans le poids corporel n'a été observé dans les différents groupes de traitement (Fig. 8N), ce qui indique la biosécurité favorable de cette combinaison chimiothérapie/PDT/immunothérapie. Pris ensemble, nous avons constaté que même si les NP anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 avec la lumière présentaient un taux d'inhibition tumorale légèrement plus élevé (86,7 %) que le groupe non irradié (76,5 %) contre les bonnes tumeurs. en raison de l'influence de la PDT (Fig. 8B‒D), aucune différence significative dans les effets thérapeutiques sur les tumeurs gauches n'a été observée en présence (77,8%) ou en absence (78,4%) de PDT (Fig. 8E‒G). Nous pensons que les raisons possibles suivantes conduisent à ce phénomène. Premièrement, concernant le mécanisme de la chimiothérapie ou de la PDT renforçant les effets immunologiques du blocage des points de contrôle anti-PD-L1, de plus en plus d'études ont démontré que ces modalités de traitement pourraient déclencher une inflammation aiguë dans la zone tumorale, augmentant ainsi la présentation d'antigènes associés à la tumeur à T. cellules, induisant ainsi les cellules cancéreuses à subir la CIM8,9. Les cellules tumorales soumises à un DCI réguleraient positivement les signaux « mangez-moi » en exposant la calréticuline (CRT) à la surface des cellules tumorales mourantes de manière immunogène et les signaux de « danger » en libérant la boîte de groupe à haute mobilité 1 (HMGB1), favorisant l'activation des cellules dendritiques. pour activer les CTL, dont l'activité pourrait être renforcée par les anti-PD-L1, entraînant ainsi une immunothérapie anticancéreuse considérablement améliorée51.

Figure 8 Effet antitumoral de la chimiothérapie/PDT à base de NP COS-BA/Ce6 plus immunothérapie anti-PD-L1 avec blocage des points de contrôle. (A) Illustration schématique de la chimiothérapie/PDT à base de CNP avec thérapie anti-PD-L1. (BeD) (B) Les profils de croissance tumorale, (C) les poids moyens des tumeurs et (D) les images de tumeurs excisées provenant de souris représentatives pour les tumeurs primaires (à droite) après divers traitements pendant 14 jours comme indiqué. (EeG) (E) Les courbes de croissance tumorale, (F) les poids moyens des tumeurs et (G) les images de tumeurs excisées pour les tumeurs distantes (à gauche) non irradiées après différents traitements comme indiqué. (H) Les populations de lymphocytes T CD8þ dans les tumeurs droites et (J) les pourcentages d'infiltration de CTL ont été détectés quantitativement par cytométrie en flux après 14 jours de traitement. (I, K) Les populations de lymphocytes T CD8þ dans les tumeurs gauches au jour 14 ont été détectées quantitativement par cytométrie en flux (n Z 3). Sécrétion de cytokines dans les sérums après 14 jours de traitement dont (L) IFN-g et (M) TNF-a mesurés par test ELISA (n Z 3). (N) Modifications du poids corporel des souris au cours de divers traitements. *P < 0.05, **P < 0.01 et ***P < 0,001 montrent les différences significatives.

Deuxièmement, dans ce travail, les NP COS-BA/Ce6 pourraient être distribuées simultanément sur les tumeurs gauche et droite. La chimiothérapie gauche et la chimiothérapie/PDT droite ont un énorme potentiel pour induire des cellules tumorales subissant une DCI. Tandis que les NP COS-BA/Ce6 sont administrés en une seule dose, l'immunothérapie dépend principalement de trois doses d'anti-PD-L1, qu'il s'agisse d'une chimiothérapie ou d'une chimiothérapie/PDT, ce ne sont que des amorces. Les différences thérapeutiques dans l'induction d'un DCI de cellules tumorales entre la chimiothérapie individuelle et les traitements combinés chimiothérapie/PDT pourraient ne pas être très importantes. Le pourcentage de CTL CD8þ sur les tumeurs gauche (Fig. 8I et K) et droite (Fig. 8H et J) a également soutenu la spéculation ci-dessus, aucune différence significative dans les CTL CD8þ n'a été observée en présence ou en absence de PDT. Par conséquent, les NP COS-BA/Ce6 plus anti-PD-L1 avec ou sans irradiation ont atteint une efficacité anticancéreuse similaire contre les tumeurs gauches. De plus, comme les cellules 4T1 expriment de faibles niveaux de PD-L152, il a été largement prouvé que l’anti-PD-L1 seul avait un effet immunothérapeutique évident sur les cancers du sein 4T153,54. Bien que les effets de l'ICD médiés par les NP COS-BA/Ce6 justifient des recherches plus approfondies, les résultats présentés ont montré que les NP COS-BA/Ce6 obtiennent des réponses immunitaires remarquablement améliorées avec l'aide des anti-PD-L1. Collectivement, il semble que les NP COS-BA/Ce6 aient effectivement potentialisé l’immunothérapie anticancéreuse anti-PD-L1, et pas seulement une thérapie combinée. Bien que les NP anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 avec ou sans traitement PDT n'aient pas montré de différences significatives dans les effets thérapeutiques, les deux ont montré une efficacité antitumorale manifestement améliorée par rapport à une dose de NP COS-BA/Ce6. C'est-à-dire que même sans traitement léger, une fois l'adjuvant immunitaire antiPD-L1 introduit, l'immunogénicité des résidus tumoraux après une chimiothérapie COS-BA/Ce6 NPs peut être renforcée, ce qui entraîne des réponses immunitaires antitumorales systémiques remarquables, conduisant ainsi à une suppression efficace. de tumeurs primitives ou distantes. Ainsi, il devrait être possible d’éliminer les tumeurs primaires et métastatiques au cours d’une immunothérapie anticancéreuse clinique grâce à des traitements répétés avec des NP. De toute évidence, ces résultats fournissent collectivement la preuve de réponses immunitaires antitumorales hautement efficaces et synergiques induites par les NP COS-BA/Ce6 en association avec un blocage anti-PD-L1, soit avec une chimiothérapie seule, soit en association avec une chimiothérapie/PDT.

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4. Conclusions

En résumé, nous avons délibérément conçu, synthétisé et développé un nano-promédicament photo-chimiothérapeutique transformé biocompatible, biodégradable, peu toxique mais hautement efficace et cliniquement disponible, COS-BA/Ce6 NP en combinant trois composants multifonctionnels, une petite molécule naturelle auto-assemblée, l'acide bétulinique. (BA), un COS soluble dans l'eau et un photosensibilisateur Ce6 faiblement toxique pour la chimiothérapie combinée/PDT. Il déclenche ensuite des réponses immunitaires antitumorales hautement efficaces et synergiques en association avec un blocage anti-PD-L1, soit avec une chimiothérapie seule, soit en association avec une chimiothérapie/PDT. Plus précisément, nous montrons que l’arrangement moléculaire en réseau creux pourrait faciliter la formation de nanoparticules structurées en coque. Les modifications du COS hydrosoluble pourraient grandement améliorer l’activité anticancéreuse des petites molécules naturelles lipophiles en construisant un promédicament amphiphile. Nous montrons également que les nanomédicaments résultants présentaient de multiples caractéristiques thérapeutiques favorables, notamment une fonction intelligente de « dormance » avec des effets de chimiothérapie insidieux. Combinés à une réactivité distinctive au pH, ces co-assemblages présentent une faible toxicité et une faible biosécurité avec les tissus normaux, mais sont hautement toxiques pour les tissus tumoraux. Avec la génération améliorée de 1 O2, la bonne biodégradabilité et la biocompatibilité, tout cela a contribué à une chimiothérapie/PDT/immunothérapie anticancéreuse hautement efficace, synergique et sûre. En particulier, la chimiothérapie individuelle sans traitement PDT peut activer des réponses immunitaires antitumorales systémiques, ouvrant ainsi des possibilités intéressantes pour l’immunothérapie par chimiothérapie anticancéreuse cliniquement synergique. Dans l’ensemble, ces travaux fournissent des informations prometteuses pour le développement de nano-immunostimulants naturels multifonctionnels hautement bioactifs et peu toxiques pour l’immunothérapie clinique.

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