Analyse Phytochimique, Anti-prolifératif In-vitro, Anti-oxydant Partie 1

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Arrière plan:Rumex rothschildianus est le seul membre d'une section unique du genre Rumex, dans la famille Polygonaceae. Cette espèce est une petite annuelle dioïque très rare, endémique de Palestine qui est traditionnellement utilisée comme aliment et pour le traitement de diverses maladies. Par conséquent, l'enquête actuelle visait à cribler les constituants chimiques, les antioxydants, l'anti-a-amylase, l'anti-a-glucosidase, l'anticipation et les effets cytotoxiques de quatre fractions de solvants des feuilles de R. rothschildianus.

Méthodes :La poudre séchée de feuilles de R. rothschildianus a été extraite dans quatre solvants de polarités différentes. Plusieurs tests phytochimiques qualitatifs et quantitatifs ont été effectués pour déterminer les composants des extraits. L'analyse colorimétrique a été utilisée pour la détermination quantitative des phénols, des flavonoïdes et des tanins. Des tests in vitro ont été effectués pour évaluer les extraits pour les antioxydants, anti-a-amylase, anti-a-glucosidase et anticiper les activités inhibitrices, ainsi que la cytotoxicité par test MTS contre la lignée cellulaire du carcinome cervical (HeLa) et la lignée cellulaire du cancer du sein. (MCF7).

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Résultats:La fraction d'acétone des feuilles de R. rothschildianus a montré la plus importanteantioxydantactivité, en raison de sa teneur la plus élevée en flavonoïdes et en composés phénoliques, avec une valeur ICso de 6,3±0.4 ug/ml, contre 3,1±0.9 ug/ml pour Trolox, et concernant activité d'inhibition de la lipase la fraction acétone a montré l'activité la plus puissante avec une valeur ICso de 26,3±{{10}}.6 ug/ml, en comparaison avec le témoin positif orlistat ICso 12,3 ug/ml. Le même extrait était l'inhibiteur le plus puissant de l'a-amylase et de l'a-glucosidase, avec des valeurs d'ICso de 19,1 ±0,7 ug/ml et 54,9±0,3 ug/ml, respectivement, par rapport à 28,8, 37,1 ± 0,3 ug/et d'acarbose, respectivement. La fraction d'hexane a montré une inhibition de 99,9 % des cellules HeLa et une inhibition de 97,4 % des cellules MCF7.

Conclusion:La fraction acétone des feuilles de R. rothschildianus pourrait fournir une source de composés bioactifs pour le traitement du stress oxydatif. De même, la fraction hexane indique le potentiel antitumoral prometteur de R. rothschildianus. De toute évidence, ces indications initiales nécessitent une purification supplémentaire des composés potentiellement actifs et, finalement, des études in vivo pour déterminer leur efficacité.

Mots clés:Rumex rothschildianus, Antioxydant, Lipase, Amylase, Trolox, Phytochimie, Activité anti-proliférative

Arrière plan

Les plantes sont utilisées comme thérapies depuis l'Antiquité. Les racines, les graines, l'écorce, les feuilles et les fleurs ont toutes été utilisées à des fins correctives. De nos jours, des médicaments synthétiques sont disponibles et efficaces dans le traitement d'un large éventail de maladies ; cependant, certaines personnes préfèrent encore les plantes médicinales car elles sont considérées comme moins nocives pour le corps humain [1,2]. Les plantes médicinales sont par définition la source de composés phytochimiques possédant des activités thérapeutiques. Ces propriétés reposent sur la présence de différents métabolites secondaires, tels que les composés phénoliques, les terpénoïdes et les alcaloïdes [3]. Rumex rothschildianus Aarons. est le seul membre d'une section unique du genre Rumex, dans la famille Polygonaceae. Cette espèce est une petite annuelle dioïque très rare, endémique de Palestine. Il a une hauteur moyenne de 45 cm et se caractérise par des tiges dressées portant des feuilles pétiolées radicales, courtes à la base et courtement acuminées à l'apex. Les fleurs ont un diamètre de 3-4 mm, tandis que les fleurs pistillées mesurent environ 2 mm de diamètre avec une couche membraneuse coriace [4]. Rumex spp. sont répandus dans différentes régions de Turquie et sont représentés par 22 espèces. Certaines des espèces les plus courantes sont R. patientia L, R. Crispus L, R. acetosa LR caucasicus rech, R. alpinus LR alpinus et R. caucasicus sont des plantes vivaces réparties dans le centre et l'est de l'Anatolie à une altitude de {{10 }} m au-dessus du niveau de la mer. Le genre Rumex a été largement utilisé en médecine traditionnelle en Turquie pour traiter des troubles tels que la constipation, la diarrhée et l'eczéma [5, 6]. Le genre a également des effets laxatifs, diurétiques, antipyrétiques, cicatrisants et anti-inflammatoires. De nombreuses personnes dans la partie orientale de la Turquie utilisent les jeunes feuilles de Rumex spp. comme conservateur dans le fromage, ainsi que pour donner un arôme aux aliments [7].

Diverses recherches ont été menées sur les espèces de Rumex, telles que des activités antimicrobiennes signalées pour certaines espèces. Certains composés phytochimiques bioactifs ont déjà été trouvés dans Rumex vicarious L, tels que les caroténoïdes, les tocophérols, les polyphénols, les flavonoïdes et l'acide ascorbique, qui ont un rôle d'antioxydants et d'agents détoxifiants naturels. L'apport alimentaire de composés phytochimiques antioxydants, comme les caroténoïdes,phénoliques, etflavonoïdespeut protéger contre les maladies non transmissibles chez l'homme, telles que le cancer, les troubles cardiovasculaires et d'autres problèmes de santé liés au stress oxydatif [5, 8]. Les radicaux libres nocifs sont connus pour jouer un rôle important dans de nombreux problèmes de santé majeurs, tels que le cancer, les maladies cardiovasculaires, la polyarthrite rhumatoïde, les cataractes,La maladie d'Alzheimer, et d'autres maladies dégénératives liées au vieillissement. Les antioxydants sont des composants bénéfiques qui neutralisent ces radicaux libres avant qu'ils ne puissent attaquer les cellules, et donc ils préviennent les dommages aux protéines cellulaires, aux lipides etles glucides. Une variété d'antioxydants naturels et synthétiques ont été proposés pour le traitement de maladies humaines. Un tel intérêt pour le rôle des antioxydants dans la santé humaine a suscité des recherches dans les domaines de la science alimentaire et des herbes médicinales, évaluant la fonction des herbes en tant qu'antioxydants. L'action antioxydante comprend la capacité de piégeage des radicaux libres, l'inhibition de la peroxydation des lipides, la capacité de chélation des ions métalliques et également la capacité de réduction [9,10].

Le cancer est l'un des problèmes de santé les plus mondiaux. Le développement et la découverte de nouveaux médicaments anticancéreux restent extrêmement importants en raison de divers facteurs. Ces facteurs comprennent des traitements qui peuvent causer des effets secondaires majeurs ou qui peuvent être assez coûteux. Les alternatives biologiquement plus sûres et plus abordables sont toujours très souhaitables [11-14].

Plusieurs espèces végétales sont considérées comme des sources potentielles de molécules bioactives telles que l'atropine des feuilles de Belladonna, la cocaïne des feuilles de coca, la vincristine de la plante Vinca et bien d'autres qui jouent encore un rôle important dans la médecine moderne [15,16].

Des effets thérapeutiques utiles peuvent provenir du mélange de produits secondaires présents dans les plantes médicinales. Ces composés sont principalement des métabolites secondaires, comme les alcaloïdes, les stéroïdes, les tanins, les flavonoïdes et les composés phénoliques, qui sont synthétisés et déposés dans des parties spécifiques de ces plantes [17,18]. La présente étude examine les activités in vitro anti-a-amylase, anti- -glucosidase, anti-lipase, anti-proliférative et antioxydante de différentes fractions extraites des feuilles de R. rothschildianus.

Méthodes

Matériel végétal, produits chimiques et instruments

Les feuilles de R. rothschildianus ont été récoltées dans les régions occidentales de la Palestine, entre février et mars 2018. Elles ont été identifiées par le Dr Nidal Jaradat, du Laboratoire de pharmacognosie de l'Université nationale d'An-Najah, sous le code de spécimen de bon Pharm-PCT{{3} }. Tous les produits chimiques ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Un spectrophotomètre-UV/Visible (Jenway degree 7135, Stafford-shire, UK), des papiers filtres (Whitman No. 1, Washington, USA), un agitateur (Memmert 531-25-1, Stockholm, Suède), un appareil rotavap (Heidolph -VV 2000, Schwa-bach, Allemagne), broyeur (Aero Plus 500 W Mixer Grinder, I01, Wan Chai, Chine), balance électronique (Radwag, AS 220/c/2, Torunska, Pologne), lyophilisateur-BT85 (Millrock Technology, Chine) et un cryo-dessiccateur (Mill-rock technology, BT85, Kingston, USA) ont été utilisés.

Préparation des extraits et fractionnement

La poudre séchée de feuilles de R. rothschildianus a été extraite en ajoutant des solvants séquentiellement en fonction de leur polarité, en commençant par le solvant non polaire hexane, puis l'acétone (un solvant organique aprotique polaire), le méthanol (alcool polaire) et enfin l'eau distillée (un solvant protique polaire). Pour chaque extraction, environ 25 g de feuilles séchées broyées ont été placées dans du 0.51 hexane pendant 72 h dans un agitateur à 100 rotations par minute à 25 degrés. Tout d'abord, l'hexane a été remplacé par 0,5 litre d'acétone, puis le remplacement ultérieur a impliqué des volumes équivalents de méthanol et d'eau. Les incubations dans les solvants étaient telles que décrites ci-dessus pour l'hexane. Chaque fraction organique a été filtrée et concentrée sous vide sur un évaporateur rotatif, tandis que la fraction aqueuse a été séchée à l'aide d'un lyophilisateur. Enfin, toutes les fractions brutes ont été stockées à 4 degrés [19,20].

Le rendement de chaque fraction a été calculé à l'aide de la formule suivante :

Évaluation phytochimique préliminaire

Des tests de dépistage phytochimique des feuilles de R. rothschildianus en quatre fractions ont été effectués pour identifier les métabolites secondaires actifs. Les résultats qualitatifs ont été exprimés par (plus) pour la présence et (-) pour l'absence de composés phytochimiques bioactifs [10,21].

Détermination de la teneur phénolique totale (TPC)

La procédure pour déterminer le TPC était basée sur celle de Cheung et al. Le TPC a été exprimé en milligrammes d'équivalents d'acide gallique par gramme de poids sec de feuilles (mg GA/g de poids sec). Une solution de carbonate de sodium à 7,5 % fraîchement préparée a été préparée en plaçant 7,5 g de Na2CO3 dans une fiole jaugée et en ajustant le volume à 100 ml avec de l'eau distillée. Une solution de référence standard (solution d'acide gallique) a été préparée en dissolvant 100 mg d'acide gallique dans de l'eau distillée jusqu'à un volume final de 100 ml. À partir de là, une dilution en série a été effectuée pour obtenir des solutions d'acide gallique à 100, 70, 50, 40 et 10 ug/ml）. Les solutions mères des fractions de feuilles ont été préparées en dissolvant 100 mg d'extrait de plante dans de l'eau distillée, et ajustées à un volume total de 100 ml. Les mélanges réactionnels ont été préparés en mélangeant 0,5 ml de chaque solution de fraction avec 2,5 ml de réactif de Folin-Ciocalteu à 10 %, qui a été dissous dans de l'eau avec 2,5 ml de bicarbonate de sodium à 7,5 %. Les tubes échantillons ont été incubés pendant 45 min à 45 degrés. Ensuite, l'absorbance de chacun a été mesurée dans un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 765 nm. Les échantillons de travail ont été préparés en triple pour chaque essai analytique, à partir desquels les valeurs moyennes et d'écart type ont été calculées [21].

Détermination de la teneur totale en flavonoïdes (TFC)

Le TFC dans les quatre fractions foliaires de R. rothschildianus a été évalué à l'aide d'une courbe d'étalonnage de la rutine (composé de référence standard). Les résultats ont été exprimés en milligramme d'équivalent rutine par gramme de poids sec d'extrait de feuilles (mg RU/g de poids sec). Une courbe d'étalonnage pour la rutine a été établie à l'aide de dilutions en série générées à partir d'une solution mère de 1{{10}}0 ug/ml. Pour préparer la solution mère, 10 mg de rutine ont été dissous dans 10 ml d'eau distillée puis dilués à 100 ml. Ensuite, la solution mère a été diluée pour fournir de la rutine à des concentrations de 10, 30, 40, 50, 70 et 100 ug/ml. Pour la préparation de la solution de travail, 0,5 ml de chaque solution de fraction a été mélangé avec 3 ml de méthanol, 0,2 ml d'AlCl3 à 10 %, 0,2 ml d'acétate de potassium 1 M et 5 ml d'eau distillée, puis incubé à température ambiante pendant 30 min. Les étapes précédentes ont été répétées pour chacune des fractions, après quoi l'absorbance a été mesurée à une longueur d'onde de 415 nm. Pour un contrôle à blanc, une solution de travail a été préparée avec de l'eau distillée à la place de l'extrait d'échantillon. Les échantillons ont été préparés en triple pour chaque essai analytique, à partir desquels les valeurs moyennes et d'écart type ont été calculées [22].

Détermination de la teneur totale en tanin (TTC) Le protocole de Sun et al. a été utilisé pour déterminer le TTC dans les quatre fractions foliaires de R. rothschildianus, étant la procédure la plus couramment utilisée. La catéchine a été utilisée comme composé de référence pour construire une courbe d'étalonnage. Un stock de 100 ug/ml dans du méthanol a été préparé, à partir duquel une série de dilutions a été générée pour donner des concentrations de catéchine de 10, 30, 50, 70 et 100 ug/ml. Une solution à 4 % de vanilline dans du méthanol a été fraîchement préparée. Des solutions mères des fractions à 100 ug/ml ont été préparées en utilisant du méthanol comme solvant. Pour la solution de travail, 0,5 ml de chaque solution de fraction a été mélangé avec 3 ml de solution de vanilline et 1,5 ml de HCl concentré. Le mélange a été laissé au repos pendant 15 min, puis l'absorbance à 500 nm a été mesurée, en utilisant une solution de travail préparée avec du méthanol à la place de l'extrait d'échantillon comme blanc. Tous les échantillons de travail ont été analysés en triple, à partir desquels les valeurs moyennes et d'écart type ont été calculées. Le tanin total dans chaque fraction a été exprimé en termes d'équivalents de catéchine (mg de CAE/g de poids sec de feuilles) [23].

Méthode d'activité antioxydante

Le test de piégeage des radicaux libres 2,2-diphényl-picrylhydrazyle (DPPH) a été utilisé pour mesurer l'activité antioxydante dans les différentes fractions de feuilles de R. rothschildianus. Une solution mère à 1000 ug/ml de chaque fraction végétale a été préparée dans du méthanol. De plus, une solution à 1000 ug/ml de Trolox a également été préparée (l'étalon de référence). Une série de dilutions a été préparée à partir des solutions mères pour chaque fraction, donnant six dilutions en série à 2, 5, 10, 20, 50 et 100 ug/ml. Un ml de chaque dilution d'extrait a été mélangé avec 1 ml de 0,002 g/ml de DPPH dans du méthanol. Un ml de méthanol a été ajouté pour donner un volume de travail final de 3 ml. La solution DPPH a été fraîchement préparée, car elle était très sensible à la lumière. Le contrôle à blanc des concentrations en série était du DPPH dans du méthanol dans un rapport de 1:2, sans ajout d'extrait. Toutes les solutions de travail ont été incubées à température ambiante (25 degrés) dans l'obscurité pendant environ 30 minutes. Les densités optiques ont ensuite été mesurées avec un spectrophotomètre à une longueur d'onde de 517 nm. L'équation suivante a été utilisée pour calculer le pourcentage d'inhibition du DPPH pour chaque fraction végétale, avec Trolox comme composé standard :

où, Ag est l'absorbance enregistrée de la solution à blanc, et Ats est l'absorbance enregistrée de la solution d'échantillon testée [21].

Test d'inhibition de la lipase pancréatique porcine

Des solutions mères de 500 ug/ml ont été préparées à partir de chaque fraction végétale dans 10 % de DMSO. A partir de ceux-ci, une série de dilutions de cinq concentrations de 50, 100, 200, 300 et 400 ug/ml a été réalisée. Une solution mère à 1 mg/ml de lipase pancréatique porcine dans du tampon Tris-HCl a été fraîchement préparée juste avant utilisation. Le substrat, le butyrate de p-nitrophényle (PNPB) a été préparé en dissolvant 20,9 mg dans 2 ml d'acétonitrile. Pour chaque solution de travail, 0,1 ml de lipase pancréatique porcine a été mélangé avec 0,2 ml de fraction végétale de chaque membre de la série de dilutions. Tris-HCl a été ajouté pour faire le volume final des solutions de travail 1 ml, et ils ont été incubés à 37 degrés C pendant 15 min. Après incubation, 0,1 ml de solution de butyrate de p-nitrophényle a été ajouté à chaque tube à essai. Le mélange a ensuite été incubé pendant 30 minutes supplémentaires à 37 degrés. L'activité lipase pancréatique a été déterminée en mesurant l'hydrolyse du PNPB en p-nitrophénolate à 410 nm, à l'aide d'un spectrophotomètre UV. La même procédure a été répétée en utilisant l'orlistat comme composé de référence standard. Le pourcentage d'inhibition de la lipase par les fractions végétales a été calculé avec l'équation suivante :

où, Ap est l'absorbance enregistrée de la solution à blanc, et Ats est l'absorbance enregistrée de la solution d'échantillon testée [24]. Dosage inhibiteur de l'a-amylase

A100 mg de chaque fraction a été dissous dans quelques millimètres de 10 % de DMSO, puis dissous jusqu'à 100 ml dans 0,02 M Na HPOq/ NaH-PO4, NaCl 0,006 M, pH 6,9 pour donner finalement des solutions mères avec des concentrations de 1000 ug/ml. A partir de celles-ci, les dilutions suivantes ont été préparées à 10, 50, 70, 100 et 500 ug/ml, en utilisant 10 % de DMSO comme diluant. Un volume de 0,2 ml de 2 unités/ml d'amylase pancréatique porcine a été mélangé avec 0,2 ml

fraction végétale et a été incubé pendant 10min à 30 degré. Après incubation, 0.2 ml d'une solution d'amidon à 1 % fraîchement préparée dans de l'eau ont été ajoutés, et les tubes ont ensuite été incubés pendant au moins trois minutes supplémentaires. À ce stade, la réaction a été arrêtée par l'ajout de 0,2 ml de réactif de couleur 3,5-acide dinitro salicylique (DNSA) et a été diluée avec 5 ml d'eau distillée, avant d'être chauffée à 90 degrés pendant 10 minutes dans de l'eau. bain. Le mélange a ensuite été refroidi à température ambiante et l'absorbance a été mesurée à 540 nm. Le contrôle à blanc a été préparé en utilisant les mêmes quantités décrites ci-dessus, mais en remplaçant la fraction végétale par 0,2 ml de tampon. L'acarbose a été utilisé comme référence standard en suivant la procédure décrite ci-dessus. L'activité inhibitrice de l'a-amylase a été calculée à l'aide de l'équation suivante :

où, Ag : est l'absorbance de l'échantillon à blanc, et Ar est l'absorbance de l'échantillon à tester [25].

Cet article est extrait de Jaradat et al. BMC Médecine et thérapies complémentaires (2021) 21:107