Blessure aux podocytes par interaction entre Tlr8 et son ligand endogène MiR-21 dans le rein obstrué et son rein collatéral

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dysfonction érectile cistanche lié au rein

Alors que l'insuffisance rénale chronique est prévalente chez les adultes, une néphropathie obstructive (ON) a été signalée chez des patients jeunes et âgés. En ON, les lésions tubulo-interstitielles (TIL) ont été largement étudiées, mais les lésions glomérulaires (GL) ont été largement négligées. Ici, nous montrons un nouveau mécanisme sous-jacent au développement de GL dans ON chez les souris jeunes et âgées. Les TIL se développent plus tôt que les GL en raison de l'infiltration de cellules inflammatoires dans le tubulointerstitium, mais les GL se développent suite à l'activation du récepteur de type Toll 8 (Tlr8) malgré l'absence de cellules inflammatoires infiltrant le glomérule. Les protéines TLR8 et interleukine 1 bêta (IL1b) colocalisent avec la réduction des marqueurs de la fonction des podocytes (PFM), indiquant l'activation de la signalisation TLR8 dans les podocytes blessés. De plus, les taux glomérulaires et sériques de miR-21, un ligand endogène de Tlr8, étaient plus élevés dans le modèle de souris ON que dans le témoin fictif. L'expression glomérulaire de Tlr8 est positivement corrélée avec miR-21 et les cytokines en aval Il1b et Il6 et négativement corrélée avec les PFM (Nphs1 et Synpo). Nous montrons également la colocalisation des protéines TLR8 et IL1b avec la réduction des PFM à la fois obstrués etcollatéralreinsde souris jeunes et âgées. De plus, les résultats d'études in vitro ont révélé une expression plus élevée de Tlr8 et de ses cytokines en aval dans les glomérules d'obstructionreinsaprès traitement avec miR- 21 mimique que dans le contrôle. En conclusion, la surexpression de Tlr8 peut servir de mécanisme plausible sous-jacent au développement de GL dans ON par le biais d'une lésion des podocytes.

Mots-clés : maladie rénale chronique,néphropathie obstructive, podocyte, TLR8, rein obstrué et collatéral

INTRODUCTION

Maladie rénale chronique (MRC), un problème majeur de santé publique, touche 8 à 13 % de la population générale (1). Elle est fréquente chez les personnes âgées en raison du vieillissement de la société. La néphropathie obstructive (ON) est d'un grand intérêt pour les cliniciens, car elle a été signalée chez des patients de différents groupes d'âge. L'ON est traitable et réversible, contrairement aux autres MRC (2, 3). Chez les enfants, il survient chez l'un des 1500 jeunes individus, et sa prévalence atteint 1 à 5 % dans les pays développés (4, 5). Chez les adultes, la prévalence de l'ON varie de 5 sur 1 000 à 5 sur 10 000 individus. De plus, la prévalence de l'ON chronique unilatérale est d'environ 0,5 %, tandis que celle de l'ON aiguë unilatérale et chronique bilatérale est d'environ 0,1 % (4–7).

L'ON peut entraîner une lésion rénale aiguë ou CKD, qui implique une diminution progressive de la fonction rénale et des altérations des structures rénales durant plus de 3 mois (8, 9). L'obstruction urétérale unilatérale (UUO) est une stratégie largement utilisée pour étudier l'ON chronique. L'ON dans un rein UUO se caractérise par une hypertrophie, une hydronéphrose, le recrutement de cellules inflammatoires dans la zone interstitielle, la mort des cellules tubulaires par hypoxie et un dépôt de collagène dans le tubulointerstitium, suivi du développement d'une fibrose tubulointerstitielle (TF) (10).

Le TF est une caractéristique importante de l'insuffisance rénale terminale et un déterminant majeur de l'atteinte rénale progressive (11). Le TF a été largement étudié dans les modèles ON, mais les données concernant les lésions glomérulaires, en particulier les anomalies de la barrière sang-urine (BUB), sont rares (8, 9, 12). De plus, des études ont étudié les lésions tubulo-interstitielles (TIL) dans le rein collatéral dans l'ON unilatéral, mais les lésions glomérulaires (GL) ont été largement négligées (12). Plusieurs rapports ont révélé l'implication des capillaires péritubulaires dans la progression des TIL dans l'ON expérimental (13, 14). Cependant, le glomérule et le capillaire glomérulaire se drainent respectivement dans les segments tubulaires des capillaires néphron et péritubulaires. Par conséquent, nous suggérons que la glomérulonéphrite peut également affecter le tubulo-interstitium. Nos études précédentes ont mis en évidence la contribution des lésions aux cellules intrinsèques glomérulaires, principalement les podocytes, au GL et le développement ultérieur de TIL dans un modèle murin de maladie auto-immune en raison de la surexpression de différents récepteurs de type Toll (TLR) (15-18).

L'endothélium capillaire glomérulaire et les podocytes sont des gardiens importants comprenant les BUB. Entre ces deux épithéliums, les podocytes sont continuellement exposés à des signaux de danger, y compris des ligands TLR tels que les modèles moléculaires associés au danger (DAMP) ou les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP), en raison de leur localisation unique dans les glomérules (15). Par conséquent, on pense que l'interaction entre les TLR dans les podocytes et leurs ligands endogènes contribue aux lésions des podocytes dans des conditions non infectieuses. Dans la présente étude, nous nous sommes concentrés sur le développement de GL dans les reins obstrués et collatéraux de souris jeunes et âgées, car l'ON est fréquemment trouvé chez les humains jeunes et plus âgés. Nous avons précisé que GL a été développé en Ontario en raison d'une lésion des podocytes par la surexpression de Tlr8 dans les podocytes des reins obstrués et collatéraux de souris jeunes et âgées.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Déclaration éthique et hébergement d'animaux expérimentaux Toutes les expériences utilisant des animaux de laboratoire ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de la Faculté de médecine vétérinaire de l'Université d'Hokkaido (n° d'approbation 16- 0124). Les auteurs ont suivi le guide approuvé pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Université d'Hokkaido, Faculté de médecine vétérinaire (approuvé par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation de Laboratory Animal Care International). Des souris C57BL/6N âgées de six semaines ont été achetées auprès de Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japon) et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans un environnement clair-obscur 1:1. Les animaux expérimentaux ont reçu de la nourriture et de l'eau potable à volonté.

Conception expérimentale Nous avons utilisé à la fois des souris jeunes (9 semaines) et âgées (12 mois). Des souris de chaque groupe d'âge (n=4) ont été soumises à une opération fictive (groupe témoin) ou à une UUO (2, 7, 11 et 21 jours) pour établir un rein modèle ON, comme décrit dans notre étude précédente (13).

Préparation de l'échantillon Les souris ont été profondément anesthésiées avec un mélange d'agents anesthésiques comme décrit précédemment (16) et euthanasiées par dislocation cervicale. Des échantillons de sang ont été prélevés par l'artère fémorale pour l'analyse des marqueurs sériques. Les reins UUO et collatéraux ont été prélevés et coupés en fines tranches. Les tranches de rein ont été fixées avec 10 % de formol tampon neutre (NBF), 4 % de paraformaldéhyde (PFA) et 2,5 % de glutaraldéhyde (GTA) pour des études histopathologiques, immunohistochimiques et de microscopie électronique, respectivement.

Immunohistochimie et immunofluorescence Des blocs de paraffine fixés au NBF ont été coupés à 2 mm d'épaisseur et colorés avec de l'acide périodique Schiff-hématoxyline (PAS-H) pour examiner l'histopathologie rénale. L'immunodétection des marqueurs cellulaires a été réalisée comme indiqué précédemment (16) pour les cellules B (B220), les cellules T (CD3), l'endothélium capillaire (CD31), IL1b, les macrophages (Iba1), les podocytes (podocine et synaptopodine) et TLR8. Les conditions de coloration sont répertoriées dans le tableau 1.

Histoplanimétrie PAS-H et les coupes rénales immunocolorées ont été converties en lames virtuelles à l'aide de Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd. ; Hamamatsu, Japon). Les cellules positives ont été comptées à partir de 20 glomérules sélectionnés au hasard ou de 20 foyers du tubulointerstitium à un grossissement de 400x à l'aide du logiciel NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Des images de 20 glomérules de sections colorées au PAS-H ont également été capturées à 400x de chaque souris à l'aide d'un microscope à fluorescence tout-en-un BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japon). La zone et la taille mésangiale glomérulaire ont été mesurées à partir d'images capturées à l'aide d'un analyseur BZ-X (Keyence).

Isolement des glomérules pour l'extraction et la culture de l'ARN Les glomérules des reins opérés de manière fictive et UUO ont été isolés comme décrit précédemment (16). En bref, les souris ont été profondément anesthésiées et perfusées par le ventricule gauche avec 40 ml de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) contenant des Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Le rein a été excisé

et coupé en petits morceaux. Les cellules ont ensuite été digérées avec de la collagénase A (1 mg/mL ; Roche, Bâle, Suisse) et de la désoxyribonucléase I (100 U/ml ; Life Technologies) dans du HBSS à 37 degrés pendant 30 min. La suspension contenant le tissu digéré a été doucement pressée à travers un tamis cellulaire de 100- mm (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) à l'aide d'un pilon aplati. La suspension cellulaire résultante a été centrifugée à 200 xg pendant 5 min, et le culot cellulaire a été remis en suspension dans 2 ml de HBSS. Les glomérules contenant des Dynabeads ont été collectés à l'aide d'un concentrateur de particules magnétiques (Life Technologies) et utilisés pour l'isolement de l'ARN.

Transcription inverse et PCR en temps réelL'ARN total a été isolé des glomérules à l'aide d'un kit RNeasy (Qiagen, Hilden, Allemagne). L'ADNc a été synthétisé à partir d'ARN total par transcription inverse à l'aide de l'enzyme transcriptase inverse ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japon) et d'amorces dT aléatoires (Promega). L'ADNc a été utilisé dans une PCR en temps réel avec le mélange maître Brilliant III SYBR Green QPCR et Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). L'expression du gène glomérulaire a été normalisée à l'expression de Actb. Les paires d'amorces utilisées sont présentées dans le tableau 2.

Transcription inverse et PCR en temps réel basée sur TaqManL'ARN total, y compris les microARN (miARN) dans les glomérules isolés, a été isolé à l'aide d'un kit miRNeasy (Qiagen). Des amorces RT spécifiques aux miARN, une transcriptase inverse, un tampon de transcription inverse, des dNTP et un inhibiteur de RNase ont été utilisés pour inverser la transcription de l'ARN total conformément aux instructions du fabricant (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis). Une PCR en temps réel a été réalisée avec l'ADNc résultant à l'aide d'amorces et de sondes spécifiques TaqMan spécifiques à miR -21- (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) et Mx3000P (Agilent Technologies).

Traitement in vitro des glomérules isolés avec des mimiquesLes glomérules ont été isolés à partir d'opérations factices et d'UUOreinsaprès 11 jours d'obstruction. Le milieu Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako, Japon) contenant 300 glomérules a été distribué dans chaque puits d'une 96-plaque de culture à puits (TPP, Trasadingen, Suisse) et traité avec du PBS, un contrôle négatif et miR -21 mimique (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Corée du Sud) à 1 pmol/ µL pendant 4 h à 37 degrés dans 5 % de CO2. L'expression de Tlr8 et de ses cytokines en aval a été mesurée comme décrit dans la section précédente.

La microscopie électronique à balayagePour la microscopie électronique à balayage (MEB) de routine, petitun rein tranchesont été fixés avec du GTA à 2,5 % pendant 4 h et post-fixés avec du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 1 h, suivis d'un traitement avec de l'acide tannique à 1 % pendant 1 h. Les échantillons ont ensuite été fixés avec du tétroxyde d'osmium à 1 % pendant 1 h et traités avec de l'acide tannique 0, 0,5 % et 1 % pendant 10 min et 1 h, respectivement.Un reintranchesont été déshydratés avec des degrés croissants d'alcool, transférés dans de l'3-acétate de méthylbutyle et enfin séchés avec un séchoir à point critique HCP-2 (Hitachi, Tokyo, Japon). Les spécimens ont été soumis à une pulvérisation ionique puis examinés au microscope électronique à balayage S-4100 à une tension accélérée de 12 kV.

Analyses statistiquesLes valeurs sont exprimées en moyenne ± erreur standard (se). Les résultats ont été analysés statistiquement à l'aide d'un test U non paramétrique de Mann-Whitney (P < 0.05).="" le="" test="" de="" kruskal-wallis="" a="" été="" utilisé="" pour="" comparer="" trois="" populations="" ou="" plus,="" et="" des="" comparaisons="" multiples="" ont="" été="" effectuées="" en="" utilisant="" la="" méthode="" de="" scheffe="" une="" fois="" que="" des="" différences="" significatives="" ont="" été="" observées="" (p=""><0.05). la="" corrélation="" entre="" les="" deux="" paramètres="" a="" été="" analysée="" à="" l'aide="" du="" test="" du="" coefficient="" de="" corrélation="" des="" rangs="" de="" spearman="" (p=""><>

RÉSULTATS

TIL et GL dans les reins obstrués de jeunes sourisNous avons d'abord examiné les TIL et les GL dans les reins opérés de manière fictive et UUO de jeunes souris soumises à une obstruction pendant différentes périodes. Alors que les reins opérés de manière fictive montraient un tubulointerstitium normal (figure 1A), les reins obstrués après 2 jours d'UUO montraient des TIL et étaient caractérisés par la dilatation des tubules ; certains tubules contenaient également des cylindres urinaires. Ces lésions ont augmenté avec l'avancement de l'obstruction (Figure 1A). Les GL, principalement la glomérulosclérose, ont été observées au stade tardif à 21 jours après UUO et caractérisées par le dépôt de matériaux positifs à l'acide périodique-Schiff (PAS). La structure glomérulaire était normale dans les reins fictifs et UUO précoces (2, 7 et 11 jours) (Figure 1B). Le nombre de cellules glomérulaires avait tendance à augmenter jusqu'au jour -11 suivant l'obstruction et avait tendance à diminuer le jour -21 dans les reins UUO (Figure 1C). L'accumulation mésangiale glomérulaire avait tendance à augmenter à partir de 7 jours après l'obstruction (figure 1D).

était absent au centre des glomérules des reins UUO à 21 jours après l'obstruction (figure 1F). La réaction en chaîne de la polymérase a révélé une diminution significative des PFM (Nphs1 et Synpo) dans les reins UUO 21 jours après l'obstruction (figure 1G). De plus, l'analyse SEM a révélé des processus normaux du pied des podocytes (PFP) dans les reins opérés de manière fictive; cependant, un effacement du PFP et des structures de type microvillositaires ont été signalés dans les reins UUO 21 jours après l'obstruction (Figure 1H). Ensemble, ces résultats suggèrent la survenue d'une lésion des podocytes dans le rein obstrué 21 jours après l'obstruction.

Absence de cellules immunitaires infiltrantes dans le rein obstrué Nous avons précédemment montré qu'une lésion des podocytes est en corrélation avec des cellules immunitaires infiltrantes dans le glomérule (13, 16, 18). Par conséquent, nous avons examiné l'infiltration des cellules B et T ainsi que des macrophages dans les TIL et les GL des reins opérés de manière fictive et UUO (Figure 2). De nombreux lymphocytes B, T et macrophages infiltrants ont été observés dans les TIL des reins UUO tous les jours suivant l'obstruction, mais ils étaient presque absents ou peu nombreux dans les glomérules des reins fictifs et UUO (figures 2A – E). Le nombre de lymphocytes B, T et de macrophages était très faible dans le glomérule (données non présentées) mais significativement plus élevé dans le glomérule.

tubulointerstitium des reins 2-, 7-, 11- et 21- jours par rapport à celui du rein factice (figure 2F). Par conséquent, l'infiltration des cellules immunitaires peut contribuer au développement de TIL dans le rein obstrué. Cependant, d'autres facteurs peuvent être liés au développement de GL.

Expression de différents membres de la famille des TLR et des cytokines en aval dans les reins opérés de façon fictive et obstrués de jeunes souris Des études antérieures ont révélé une expression plus élevée de différents TLR dans les podocytes des reins malades (15, 16, 19, 20). Fait intéressant, nos données ont révélé une expression significativement plus élevée de Tlr8 et Tlr9 dans les glomérules isolés du groupe de jour UUO 21- que dans les glomérules du groupe fictif (figure 3A). De plus, nous avons examiné l'expression des cytokines en aval des membres de la famille TLR dans les glomérules des groupes simulés et UUO 21- jours et avons trouvé une régulation à la hausse significative dans l'expression des gènes codant à la fois pour l'interleukine 1 bêta (Il1b) et l'interleukine 6. (Il6) dans le groupe UUO par rapport à celui du groupe fictif (Figure 3B).

TLR8 co-localisé avec PFM Comme l'expression de Tlr8 et Tlr9 était élevée dans les glomérules isolés du rein obstrué, nous avons examiné leur localisation par coloration par immunofluorescence. La protéine TLR8 n'a pas été détectée dans les reins opérés de manière fictive (figure 4A), mais a été colocalisée avec la synaptopodine PFM dans le rein UUO (figure 4B). De plus, nous n'avons pas réussi à détecter l'expression de la protéine TLR9 dans le rein de souris opérées de manière fictive ou UUO (données non présentées).

Production d'IL1b à partir de podocytes dans le rein obstrué de jeunes souris. Par conséquent, nous avons examiné la source d'IL1b dans les glomérules des reins UUO par coloration par immunofluorescence. L'expression de la protéine IL1b n'a pas été détectée dans les glomérules de reins fictifs, mais a été observée dans les glomérules de reins UUO (figures 4C, D). En outre, IL1b colocalisé avec la podocine PFM (figure 4D).

dans l'UUOun reinà 21 jours que celle du simulacreun rein.Par conséquent, nous avons examiné la source d'IL1b dans les glomérules des reins UUO par coloration par immunofluorescence. L'expression de la protéine IL1b n'a pas été détectée dans les glomérules de shamreinsmais a été observé dans les glomérules de UUOreins(Figures 4C, D). En outre, IL1b colocalisé avec la podocine PFM (figure 4D).

Augmentation du niveau du ligand endogène putatif Tlr8 chez les souris modèles ON Une étude précédente a montré que miR-21 sert de ligand pour TLR8 (21). Par conséquent, nous avons comparé les niveaux glomérulaires et sériques de miR-21 entre les groupes simulés et UUO 21-jours. Fait intéressant, le groupe de jour UUO 21- a montré des niveaux significativement plus élevés de miR glomérulaire -21 que celui du groupe fictif (P <0.05), cependant,="" une="" tendance="" croissante="" de="" mir="" sérique="" {="" {10}}="" a="" été="" observé="" dans="" le="" premier="" groupe="" que="" dans="" le="" second="" (p="0.06)" (figure="">

Corrélation de l'expression de Tlr8 avec son ligand miR-21 et les PFM dans l'obstructionUn reinComme le montre le tableau 3, nous avons observé une corrélation positive significative entre l'expression glomérulaire de l'ARNm de Tlr8 et son ligand endogène (miR-21) ainsi que les cytokines en aval Il1b et Il6. D'autre part, une corrélation négative était évidente entre l'ARNm de Tlr8 et les PFM Nphs1 et Synpo.

La stimulation in vitro des glomérules avec miR{{0}} Mimic active l'expression de Tlr8 et de ses cytokines en aval L'expression de Tlr8 avait tendance à augmenter (P=0.06) mais ses cytokines en aval (Ifng et Il1b) ont été significativement (P < 0,05 et 0,01) augmentées dans les glomérules de souris fictives après

traitement avec miR -21 mimique par rapport à celui dans les glomérules de souris traitées avec du PBS et mimique de contrôle négatif (figure 5A). Cependant, aucune corrélation significative n'a été observée entre l'expression de Tlr8 et ses cytokines en aval dans les glomérules de souris fictives après traitement avec des mimiques (tableau 4). L'expression de Tlr8 et de ses cytokines en aval était significativement plus élevée dans les glomérules d'UUOreins, après traitement avec miR-21 imitent que ceux des glomérules d'UUOreinstraité avec du PBS et mimique de contrôle négatif (figure 5B). Une corrélation significative a été détectée entre l'expression de Tlr8 et ses cytokines en aval dans les glomérules des reins UUO après un traitement avec des mimiques, indiquant une activation plus élevée de la voie du facteur nucléaire kappa B (NF-kB) médiée par Tlr8- et sécrétion de cytokines pro-inflammatoires dans le rein obstrué (tableau 4).

Localisation de TLR8 et lésion des podocytes dans les reins collatéraux de jeunes sourisLes reins opérés de manière fictive présentaient un glomérule normal, tandis que les reins collatéraux présentaient une hypertrophie glomérulaire, une augmentation du nombre de cellules glomérulaires et une dilatation des capillaires glomérulaires (figure 6A). Les glomérules des reins opérés de manière fictive étaient positifs pour l'expression de la synaptopodine et manquaient d'expression de TLR8 (figure 6B). D'autre part, les reins collatéraux ont perdu l'expression de la synaptopodine au centre des glomérules mais ont montré l'expression de TLR8 le long du taux glomérulaire (figure 6C). De plus, la protéine TLR8 a été co-localisée avec la synaptopodine (figure 6C). Les reins opérés de manière fictive ont montré une expression normale de podocine mais aucune expression d'IL1b dans les glomérules (figure 6D). Cependant, les glomérules dans le rein collatéral ont perdu l'expression de la podocine au centre mais avaient une expression d'IL1b le long du taux glomérulaire (figure 6E). De plus, la protéine IL1b a été colocalisée avec la podocine (figure 6E). L'analyse SEM a révélé des PFP normaux dans les reins de souris opérés de manière fictive, mais l'effacement des PFP et des structures de type microvillositaires étaient visibles dans les reins collatéraux (figure 6F).

Localisation de TLR8 et lésion des podocytes dans les reins obstrués et collatéraux de souris âgéesLes reins opérés de manière fictive ont montré une expression normale de la synaptopodine mais n'ont révélé aucune coloration pour la protéine TLR8 dans leurs glomérules (figure 7A). Fait intéressant, les reins collatéraux et UUO ont montré une perte d'expression de la synaptopodine au centre des glomérules mais ont maintenu l'expression de TLR8 le long du rete glomérulaire (figures 7B, C). La protéine TLR8 a été colocalisée avec la synaptopodine dans les reins collatéraux et UUO (figures 7B, C). Les reins opérés de manière fictive ont montré de la même manière une expression normale de la podocine mais n'avaient aucune expression d'IL1b dans leurs glomérules (figure 7D). D'autre part, les reins collatéraux et UUO ont perdu l'expression de la podocine au centre des glomérules mais ont montré l'expression de l'IL1b le long du rete glomérulaire (figures 7E, F). La coloration positive s'est avérée colocalisée avec la podocine dans les glomérules des reins collatéraux et UUO (figures 7E, F). L'examen SEM a révélé des PFP normaux dans les reins de souris opérés de manière fictive, un effacement de PFP et des structures de type microvillositaires dans les reins collatéraux et UUO de souris âgées (figure 7G).

DISCUSSIONSUR

la prévalence est courante chez les nourrissons ainsi que chez les personnes âgées (4–7). Par conséquent, nous avons soumis des souris jeunes et âgées à UUO pour imiter l'état ON d'individus de différents groupes d'âge et examiné les TIL et les GL. Dans le rein obstrué, la progression des TIL était évidente à un stade précoce de l'obstruction (2 jours) ; cependant, la progression des GL ainsi que les lésions des podocytes ont été observées à un stade ultérieur. Le rein collatéral a montré des lésions des GL et des podocytes en même temps. Cette observation indique que la lésion des podocytes se produit à la fois dans les reins obstrués et collatéraux, bien que l'agression initiale puisse varier. Nos études précédentes ont mis en évidence la corrélation entre la lésion des podocytes et l'infiltration de cellules immunitaires dans le glomérule (13, 16, 18). Cependant, l'infiltration de cellules immunitaires dans les glomérules de reins fictifs ou obstrués n'a pas été observée dans la présente étude. Par conséquent, nous avons considéré l'implication d'autres facteurs dans la lésion des podocytes dans le rein obstrué. Nous avons émis l'hypothèse que les signaux de danger (DAMP ou PAMP), d'origine circulatoire ou provenant d'un épithélium tubulaire endommagé, peuvent contribuer à la lésion des podocytes dans l'ON, en raison de sa localisation unique dans le glomérule. Il est important de noter qu'il a été démontré que l'interaction entre les DAMP et les TLR joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies non infectieuses (15). Différents membres de la famille TLR sont exprimés sur la membrane plasmique cellulaire ou les vésicules intracellulaires (22) et sont caractérisés comme des capteurs immunitaires innés qui reconnaissent efficacement les DAMP ou les PAMP. Lors de l'activation par les DAMP ou PAMP correspondants, les TLR ont amélioré l'expression des cytokines en aval via la voie NF-kB et ont induit le système de défense de l'hôte (22). De plus, les DAMP transmettent la présence de lésions tissulaires aux cellules immunitaires ou aux cellules intrinsèques locales et, par conséquent, aggravent les lésions tissulaires (23-26). Il est important de noter que tous les TLR activent la voie NF-kB qui contrôle l'expression d'un ensemble de gènes de cytokines inflammatoires (27). De plus, l'activation des TLR signale à leurs voies en aval d'activer NF-kB, qui est responsable de l'inflammation et lié à la pathogenèse des tissus endommagés (28). Shichita et al. ont révélé les interactions pathologiques entre les ligands endogènes et TLR2 ou TLR4, qui contribuent aux lésions cérébrales ischémiques (25). Des études antérieures ont également démontré la capacité des membres de la famille TLR à induire des TIL dans le rein (TLR2, 4, 5, 7 et 11) et des GL (TLR1–6, 8 et 9) (17, 29–33 ). Dans la présente étude, nous avons trouvé une lésion des podocytes dans les reins obstrués et collatéraux et avons clarifié la

rôles des différents membres de la famille TLR qui peuvent contribuer à la lésion des podocytes (15, 16, 19, 20). Comme nous l'avons supposé, l'expression glomérulaire de Tlr8 et Tlr9 était plus élevée dans les glomérules isolés du rein UUO que dans ceux des souris opérées de manière fictive. De plus, l'expression glomérulaire des cytokines inflammatoires liées à la voie NF-kB, y compris Il1b et Il6, était plus élevée dans le rein UUO 21 jours après l'obstruction. Par conséquent, nous avons conclu que la voie NF-kB médiée par le TLR joue un rôle important dans la pathogenèse de la GL dans le rein obstructif. Contrairement aux autres membres de la famille TLR, TLR8 et TLR9 sont détectés dans les endosomes des cellules. TLR8 reconnaît les ARN simple brin et les ARN courts double brin des micro-organismes et active la production de plusieurs cytokines médiées par NF-kB (22). D'autre part, TLR9 reconnaît les ADN double brin et active la voie NF-kB pour produire des cytokines en aval (16, 34). Dans cette étude, nous n'avons reconnu que la colocalisation de la protéine TLR8 avec la synaptopodine PFM dans les glomérules. Nos études précédentes ont également montré que TLR8 et TLR9 colocalisent avec les PFM et activent la production de cytokines inflammatoires médiées par NF-kB pour induire une lésion des podocytes (15, 16). De plus, d'autres études ont montré la corrélation pathologique entre les voies médiées par le TLR et les lésions des podocytes in vitro (34, 35). Banas et al. ont révélé l'interaction de TLR4 dans les podocytes avec le système immunitaire au cours du développement de GL (35). Ainsi, les podocytes peuvent contribuer à la surveillance immunitaire par des voies médiées par les TLR. Dans cette étude, nous avons montré à la fois l'expression du gène TLR8 et la localisation des protéines dans les podocytes du rein obstrué ainsi que l'expression plus élevée des cytokines en aval dans le glomérule. Par conséquent, nous concluons que les voies médiées par le TLR 8- contribuent au développement de la GL par le biais d'une lésion des podocytes dans le rein obstrué.

Une étude précédente a montré que miR-21, un ligand endogène de TLR8, peut atteindre et se lier à TLR8 dans les endosomes cellulaires, où il peut induire l'activation médiée par TLR8- de la voie NFkB et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (21). Dans la présente étude, nous avons trouvé des niveaux significativement plus élevés de miR glomérulaire -21 ainsi que des niveaux élevés de miR sérique -21 dans le rein UUO que ceux des témoins fictifs et avons démontré sa corrélation avec l'expression glomérulaire de Tlr8 . Fait intéressant, les glomérules des reins UUO traités avec miR -21 mimique ont montré une expression plus élevée de Tlr8 et de ses cytokines en aval par rapport à ceux des glomérules de souris fictives traitées avec miR -21 mimique, indiquant une disponibilité accrue de miR endogène -21 des tissus endommagés dans le rein obstrué et l'activation de la surexpression de Tlr8 dans les reins UUO se comparent à celle d'un simulacre. Ensemble, nous concluons qu'un volume plus élevé de miR-21 dans le rein obstrué atteint les endosomes dans les podocytes et induit l'activation médiée par Tlr8- de la voie NF-kB et la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Ces cytokines, à leur tour, participent au développement des GL par le biais de lésions des podocytes.

L'IL1b est l'une des cytokines importantes en aval de la voie NF-kB, principalement produite par les podocytes dans le glomérule dans des conditions pathologiques. Des études antérieures ont montré que l'IL1b induit une lésion des podocytes en réduisant les PFM (36, 37). Dans la présente étude, nous avons montré une expression glomérulaire plus élevée d'Il1b et sa colocalisation avec les PFM, qui ont montré une expression réduite. De plus, l'expression glomérulaire d'Il1b était corrélée à Tlr8 et tendait à être corrélée à l'expression des PFM (Nphs1 et Synpo). Par conséquent, ces résultats indiquent que les facteurs en aval de Tlr8, y compris Il1b et Il6, peuvent provoquer des lésions des podocytes dans le rein obstrué en réduisant l'expression de PFM.

Les reins collatéraux de jeunes souris ont également montré des GL et une perte de PFM. Ce résultat a été confirmé par SEM, qui a révélé une lésion des podocytes dans le rein collatéral. Nous avons également trouvé des niveaux plus élevés de miR sérique -21 dans le modèle de souris ON. De plus, la protéine IL1b est co-localisée avec le PFM. Ces résultats indiquent que le sérum miR-21 interagit avec TLR8 dans les podocytes du rein collatéral et active la production de cytokines en aval, ce qui réduit à son tour la fonction des podocytes et les lésions des podocytes. Des lésions des podocytes ont également été observées dans les reins obstrués et collatéraux de souris âgées via un mécanisme similaire à celui observé chez les jeunes souris.

En conclusion (Figure 8), l'expression glomérulaire de miR-21 est élevée après une obstruction urétérale unilatérale, dans laquelle il interagit avec TLR8 dans les podocytes et induit la production de cytokines en aval (Il1b et Il6) suggérant l'activation de la voie NF-kB. Des niveaux plus élevés de cytokines réduisent les PFM, entraînant des lésions des podocytes et le développement ultérieur de GL. Des niveaux élevés de miR sérique -21 activent TLR8 dans les podocytes du rein collatéral et induisent des GL par lésion des podocytes. Par conséquent, cette étude montre clairement le développement de GL dans les reins obstrués et collatéraux par une lésion des podocytes suite à la surexpression de Tlr8.