ABSTRACT

Arrière-plan:Un bis résorcinol a été isolé comme constituant principal du tronc des terminaux d'Heliciopsis (Proteaceae). Récemment, le résorcinol est appliqué comme agent blanchissant actif dans divers produits cosmétiques. En raison de l'imitation structurelle du résorcinol, les avantages du bis-résorcinol en tant qu'antagoniste des enzymes du vieillissement ont été démontrés dans cette étude.

Selon des études pertinentes, le cistanche est une herbe commune connue comme "l'herbe miracle qui prolonge la vie". Son composant principal est le cistanoside, qui a divers effets tels que la promotion de la fonction antioxydante, anti-inflammatoire et immunitaire. Le mécanisme entre le cistanche et le blanchiment de la peau réside dans l'effet antioxydant des glycosides du cistanche. La mélanine dans la peau humaine est produite par l'oxydation de la tyrosine catalysée par la tyrosinase, et la réaction d'oxydation nécessite la participation d'oxygène, de sorte que les radicaux sans oxygène dans le corps deviennent un facteur important affectant la production de mélanine. Cistanche contient du cistanoside, qui est un antioxydant et peut réduire la génération de radicaux libres dans le corps, inhibant ainsi la production de mélanine.

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Méthodes :Le bis résorcinol a été purifié à partir de l'extrait éthanolique brut du tronc des terminaux H. par extraction au solvant et chromatographie préparative, respectivement. L'activité inhibitrice sur la collagénase, l'élastase et la tyrosinase du composé a été étudiée en utilisant une technique spectroscopique différente. L'amarrage moléculaire a été réalisé pour prédire les interactions possibles de la substance autour des sites actifs enzymatiques.

Résultats:Les valeurs IC50 sur la collagénase du bis résorcinol et de l'acide caféique étaient respectivement de 156,7 ± 0,7 et 308,9 ± 1,6 µmole L−1. Pour l'activité élastase, des IC50 de 33,2 ± 0,5 et 34,3 ± 0,3 µmol L-1 ont été déterminées respectivement pour le bis résorcinol et l'acide ursolique. Le bis résorcinol était inhibiteur de la tyrosinase en présentant une IC50 de 22,8 µmole L-1, et celle de 78,4 µmole L-1 était présente pour l'-arbutine. Le bis résorcinol s'est lié à la collagénase, l'élastase et la tyrosinase avec les énergies de liaison respectives de -5,89, -5,69 et -6,57 kcal mol-1. Ces énergies de liaison étaient dans les mêmes gammes que les inhibiteurs testés. Les groupes phénol aromatiques dans la structure étaient responsables du principe ainsi que du soutien des interactions de liaison avec les enzymes. La liaison de l'hydrogène due aux groupes hydroxyle et aux forces d'attraction liées à π d'un ou plusieurs cycles aromatiques a fourni une polyvalence de liaison au bis résorcinol.

Conclusion:Le bis résorcinol purifié à partir des terminaux H. pourrait être utile pour être inclus dans des produits cosmétiques en tant qu'antagoniste des enzymes du vieillissement.

Sujets Biochimie, bioinformatique, biologie cellulaire, dermatologie, exploration de données et apprentissage automatique

Mots clésTerminaux Heliciopsis, Bisresorcinol, Collagénase, Elastase, Tyrosinase, Propriété anti-âge, Amarrage moléculaire, Inhibition enzymatique

INTRODUCTION

Un bis résorcinol, (8′Z)-3,5-dihydroxy-1-[16′-(3″, 5″-dihydroxy phényl)-8′-hexadécène{{ 11}}′-yl] benzène, a été isolé en tant que constituant abondant du tronc des terminaux d'Heliciopsis (Kurz) Sleumer, qui est une plante de la famille des Proteaceae et a été utilisé par les ethnies du Vietnam pour son effet hépatoprotecteur. À ce jour, les avantages médicaux de ce composé en tant qu'agent anti-inflammatoire, inhibiteur de la production de malondialdéhyde (MDA) et hépatoprotecteur ont été clarifiés in vitro et in vivo (Giang et al., 2019). Il est évident qu'une molécule de bis résorcinol contient deux molécules de résorcinol (EC No 203-585-2), liées ensemble par une liaison méta-C7H14C=CC7H14 (Fig. 1A). Le résorcinol est récemment appliqué sous forme de sérum concentré pour le visage pour la thérapie blanche. D'après le Comité scientifique pour la sécurité des consommateurs, Bruxelles, Belgique (SCCS 1270/09, Commission européenne, Comité scientifique pour la sécurité des consommateurs, 2010), le résorcinol a été réglementé en tant qu'oxydant dans les produits destinés à colorer les cils à des concentrations allant jusqu'à 1,25 %. , ou dans les lotions capillaires et les shampoings à des concentrations allant jusqu'à 0,5 pour cent . Les applications cosmétiques du résorcinol sont donc diverses. Pour les agents blanchissants, l'inhibition de la synthèse de mélanine par les mélanocytes qui résident dans la couche cellulaire basale de l'épiderme a été supposée. La tyrosinase (EC 1.14.18.1) est une enzyme clé pour catalyser la mélanogenèse dans laquelle la L-tyrosine est utilisée comme substrat. Bien que la mélanine aide à protéger la peau des dommages causés par les rayons UV, une production excessive de mélanine peut provoquer une hyperpigmentation, des taches de rousseur et des taches de vieillesse. En plus du résorcinol, il a été démontré que divers composés synthétiques et naturels avec des structures chimiques distinctes présentent une activité anti-tyrosinase (Dobos et al., 2015).

Le rayonnement UV est un facteur externe majeur qui provoque le vieillissement cutané. Au lieu de cela, les peaux peuvent vieillir avec le temps à cause des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et des peroxydes lipidiques qui sont produits en interne après une exposition aux UV. Les produits secondaires des métabolismes des peroxydes lipidiques peuvent endommager les fibres d'élastine et de collagène des matrices extracellulaires (ECM). Par conséquent, l'exposition aux rayons UV peut entraîner une déshydratation, une perte d'élasticité, ainsi que des rides de la peau. À notre connaissance, les ECM sont périodiquement remodelés pour maintenir des structures tissulaires normales en même temps que les protéines tissulaires expirées sont correctement dégradées par les métalloprotéases matricielles, telles que les collagénases, et les sérine protéases comme les élastases (Thring, Hili & Naughton, 2009). De plus, les quantités et les activités des enzymes de vieillissement ont été augmentées par le stress oxydatif, entraînant une dégradation importante de la MEC et un vieillissement progressif (Sherratt et al., 2019). Par conséquent, les composés qui peuvent former des complexes avec des ions métalliques devraient être inhibiteurs des collagénases, des élastases et de la tyrosinase en conséquence (Selvaraj et al., 2014). Ce projet vise à déterminer les effets biologiques du bis résorcinol sur la tyrosinase, la collagénase et l'élastase in vitro, et une technique d'amarrage a été réalisée pour clarifier leurs interactions au niveau moléculaire. On espère retarder le processus de vieillissement et améliorer l'apparence de la peau avec le bis résorcinol.

MATÉRIAUX & MÉTHODES

Produits chimiques et instruments

Purification, identification et ratification des composés

L'extrait brut dans l'éthanol du tronc des terminaux H. a été généreusement obtenu auprès du professeur PM Giang, Faculté de chimie, Université nationale du Vietnam, Hanoï, Vietnam avec le numéro de spécimen de référence HNIP-18473. Ensuite, il a été partagé dans du méthanol/n-hexane par trois répétitions. La couche de méthanol a été évaporée jusqu'à ce qu'elle soit presque sèche, puis partagée dans de l'acétate d'éthyle/1-butane. La couche d' acétate d' éthyle a été vaporisée jusqu'à ce que son volume soit réduit de 80 % . Le liquide visqueux résultant a ensuite été purifié sur une colonne de gel de silice en utilisant un gradient d'élution chloroforme/méthanol comme suit : 100 % de chloroforme, 30 : 1, 20 : 1, 10 : 1, 7 : 1, 5 : 1, 3 : 1, 3 :2 et 2:1 de chloroforme/méthanol et 100 % de méthanol, respectivement. L'éluant du solvant mixte 5:1 a été recueilli et évaporé à un quart de volume, suivi par la séparation sur la colonne ODS en utilisant un gradient d'élution de méthanol et d'acétone. Le composé souhaité, c'est-à-dire le bis résorcinol (Fig. 1), a été obtenu à partir d'éluants contenant 70 % d'acétone et confirmé par spectroscopies MS, RMN et IR concernant les données de la bibliothèque instrumentale. La chromatographie sur couche mince a été utilisée pour l'estimation de sa pureté.

Dosages d'activité biologique

In vitro, des expériences consistant en des dosages inhibiteurs d'enzymes sur la collagénase, l'élastase et la tyrosinase pour le bis résorcinol et les inhibiteurs connus ont été réalisées comme suit.

Inhibition de la collagénase

Le test anti-collagénase récent a été modifié par rapport à celui précédemment décrit par Widyowati et al. (2016). En bref, 50 mmol L-1 de tampon tricine pH 7,5 additionné de 400 mmol L-1 NaCl et 10 mmol L-1 CaCl2 ont été utilisés comme diluant tampon. La collagénase de Clostridium histolyticum (EC.3.4.24.3) a été dissoute dans le tampon à une concentration de 1 mg L-1. L'enzyme-substrat, MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr(Dnp)-Ala-Arg-NH2, a été préalablement dissous dans du DMSO puis dilué dans le tampon à une concentration de 1 mmol L-1. Un échantillon dissous dans du DMSO a été dilué à différentes concentrations en utilisant le tampon. Une solution d'échantillon de 2- µl a été incubée avec 100 µl de solution enzymatique à 37 °C pendant 10 min. Ensuite, un substrat de 50- µl a été ajouté et soigneusement mélangé. L'émission de fluorescence (F) à 405 nm a été immédiatement enregistrée et surveillée en continu pendant 30 min en utilisant une longueur d'onde de 320 nm pour l'excitation. L'acide caféique a été utilisé comme contrôle de position (Fig. 1). Le contrôle négatif a été réalisé avec de l'eau. Le pourcentage d'inhibition (pourcentage) a été calculé à partir de l'équation ci-dessous :

pourcentage d'inhibition {{0}}{1 - (Fsam ; 30 - Fsam ; 0)÷(Fcont ; 30 - Fcont ; 0)} ×100.

Inhibition de l'élastase

Le dosage selon Abhijit & Manjushree (2010) a été appliqué avec quelques modifications. En bref, le système tampon était un tampon 0.2 mM Tris-HCl (pH 8,0). Une solution de 1 µg mL-1 d'élastase pancréatique porcine (EC.3.4.21.36) a été préparée dans de l'eau stérile. Le substrat enzymatique, N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide (SANA), a été dissous dans le tampon à une concentration de 80 mmol L-1. Un échantillon dissous dans du DMSO a été dilué à diverses concentrations en utilisant le tampon. Une solution d'échantillon de 100- µl a été mélangée à 50 µl de solution d'enzyme et incubée pendant 15 min. Après cela, 50 ul de la solution enzyme-substrat ont été ajoutés et soigneusement mélangés. La DO410 a été mesurée immédiatement (0 min) et après incubation pendant une nuit (o/n) à 37 degrés en utilisant un lecteur de microplaques. L'acide ursolique a été utilisé comme contrôle positif (Fig. 1) et l'eau a été utilisée comme contrôle négatif. Le pourcentage d'inhibition (pourcentage) a été calculé par l'équation suivante :

pourcentage d'inhibition {{0}} {1 - [(Asam ; o/n - Asam ; 0)÷(Acont ; o/n - Acont ; 0)]} ×100 :

Inhibition de la tyrosinase

Le dosage inhibiteur de la tyrosinase utilisé a été adapté de la méthode décrite précédemment (Jiratchayamaethasakul et al., 2020). En bref, le dosage a été effectué dans du tampon phosphate 0.05 mol L-1 pH 6,8. La tyrosinase de champignon (EC.1.14.18.1) a été dissoute dans le tampon à une concentration de 100 unités mL-1. La L-tyrosine, un substrat enzymatique, a été préparée à une concentration de 0,25 mg mL-1 dans le tampon. Un composé test dissous dans du DMSO a été dilué à des concentrations comprises entre 0,625 et 10 mg mL-1. Dans un puits de 96-plaques à puits, un échantillon de 10 µl et 40 µl de solution de L-tyrosine ont été mélangés et incubés pendant 10 minutes à température ambiante. Après cela, 50 ul de solution enzymatique ont été inoculés et mélangés soigneusement. La réaction a ensuite été stoppée par incubation sur glace pendant 1 min. La DO475 a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques. -L'arbutine et l'eau ont été utilisées comme contrôle positif (Fig. 1) et contrepartie négative, respectivement. Le pourcentage d'inhibition (pourcentage) a été calculé par l'équation suivante :

ÉTUDE D'AMARRAGE MOLÉCULAIRE

Préparation des ligands et des récepteurs

Les structures tridimensionnelles (3D) du bis résorcinol (CID 8917124) et des composés de référence, y compris les substrats et les inhibiteurs, ont été téléchargées à partir de la base de données PubChem pour une étude d'amarrage moléculaire. Une structure de ligand a été préparée dans un fichier au format Protein Data Bank (PDB) à l'aide du traducteur SMILES en ligne et du générateur de fichiers de structure. Les structures cristallines des enzymes, telles que la collagénase (PDB ID 2Y6I), l'élastase (PDB ID 1BRU) et la tyrosinase (PDB ID 2Y9X) ont été obtenues à partir de la base de données de protéines RCSB. L'eau et les molécules attachées ont été disséquées de toutes les structures protéiques sélectionnées. Pendant ce temps, des atomes d'hydrogène polaires ont été ajoutés aux structures protéiques cristallisées par AutoDockTools 1.5.6. Les fichiers de protéines cibles et d'autres composés utilisés ont été enregistrés au format PDBQT avant d'effectuer l'amarrage moléculaire.

Sélection des résidus du site actif et ancrage moléculaire

Les protocoles de grille et d'amarrage des prédictions de site actif ont été préparés à l'aide d'AutoDockTools 1.5.6. Les sites de grille ont été définis avec un espacement de 0.375 Å. Les dimensions xyz ont été fixées à 126-135-160 Å3 pour la collagénase, 130-120-126 Å3 pour l'élastase et 80-80-80 Å3 pour la tyrosinase. Les centres des boîtes de grille (avec des valeurs de décalage dans AutoDockTools) étaient de 31,869 (5,000), −19,41 (−25,{{20}}) et 17,815 pour la collagénase , 30.048 (−0.972), 51.253 (−2.722), 17.6 pour l'élastase et −8.407 (−1.000), −23.795 (−0.250), −36.019 (−3.500 ) pour la tyrosinase, respectivement. La structure protéique a été utilisée comme une entité rigide tandis que le composé ligand a été défini comme une molécule flexible. L'étude d'amarrage a été réalisée à l'aide de l'algorithme génétique lamarckien (AG) mis en œuvre par AutoDock4 version 4.2. Le nombre d'essais GA était de 50 avec une taille populaire de 200. L'énergie de liaison (ΔGbind) a été analysée par ADT. Les interactions ont été visualisées à l'aide de BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). L'interaction moléculaire entre le composé et un récepteur protéique a été analysée et visualisée à l'aide du logiciel BIOVIA Discovery Studio (BIOVIA, 2020). La structure du composé du site de liaison de la protéine a été visualisée à l'aide du progiciel Visual Molecular Dynamics (VMD) (Humphrey, Dalke & Schulten, 1996).

analyses statistiques

RÉSULTATS

Un constituant majeur a été purifié avec succès à partir du tronc des terminaux H. en utilisant respectivement des techniques d'extraction par solvant et de HPLC en phase inverse. Les spectres 1H-NMR et 13C-NMR acquis ont été comparés à ceux des substances de référence via le SciFinder (https://scififinder.cas.org/) et se sont avérés correspondre à (8′Z)-1,{ {6}}dihydroxy-5- [16′-(3″,5″-dihydroxyphényl)-8′-hexadécène-1′-yl] benzène (Chaturvedula et al., 2{{ 23}}02). Il a été classé comme l'un des bisresorcinols. Ce bis résorcinol récent avait la formule moléculaire de C28H40O4 avec un poids moléculaire de 463,2819 Dalton. Le rendement d'extraction a été calculé comme étant de 0,086 %, basé sur le poids séché du tronc. Sa pureté était supérieure à 98%, concernant les spectres RMN 1H et 13C acquis (voir Figs. S1 et S2).

Analyse de la bioactivité in vitro

Les effets antagonistes du bisrésorcinol sur les enzymes du vieillissement, telles que la collagénase, l'élastase et la tyrosinase, ont été déterminés in vitro en utilisant une méthode spectroscopique distincte. Les résultats ont été résumés dans le tableau 1 et la figure 2. Pour l'inhibition de la collagénase, des échantillons de test dans une plage de 50 à 550 µmol L-1 ont été préparés à l'aide de MOCAc-PRO-Leu-Gly-Leu-A2pr (Dnp) -Ala Arg-NH2 comme substrat enzymatique et l'acide caféique comme inhibiteur enzymatique. Il a été indiqué que le bisrésorcinol à une concentration de 156,7 µmol L-1 diminuait l'activité enzymatique de 50 % (IC50). Au lieu de cela, l'IC50 de l'acide caféique était de 308,9 ± 13,7 µmol L-1. Ainsi, l'activité anti-collagénase du bisrésorcinol était significativement plus forte que celle de l'acide caféique.

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