Isolement préparatif et purification de quatre composés de Cistanches Deserticola YC Ma par chromatographie à contre-courant à grande vitesse

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Résumé:

Suite à une étape d'enrichissement des constituants sur colonne de gel de silice, quatreglycosides phényléthanoïdesont été isolés avec succès deCistanches deserticolaet purifié par chromatographie préparative à contre-courant à grande vitesse (HSCCC) avec un système de solvant à deux phases composé d'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (40 : 6 : 6 : 50, v/v /v/v). Un total de 30,9 mg d'actéoside, 13,0 mg d'isoactéoside, 12,5 mg de syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside et 7,2 mg de 2'-acétylactéoside d'une pureté supérieure à 95 %, déterminée par HPLC-ELSD, ont été obtenu en une seule étape de séparation à partir de 297 mg deExtrait de Cistanche désertique, respectivement. Leurs structures ont été identifiées par HR-MS, 1H-NMR et 13C-NMR.

Mots clés : chromatographie à contre-courant à grande vitesse ;Cistanches deserticola YC Ma;glycosides phényléthanoïdes; l'actéoside; isoacteoside; syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside ; 2'-acétylactéoside.

Introduction

Cistanches deserticolaYC Ma, une espèce deCistanchesqui appartient à la famille des Orobanchaceae, est une médecine traditionnelle chinoise bien connue pour le traitement de l'insuffisance rénale, de l'infertilité féminine, de la leucorrhée morbide, de la neurapraxie et de la constipation sénile [1]. C'est une plante parasite largement répandue dans le nord-ouest de la Chine. Jusqu'à présent, plusieurs composés, dont les glycosides phényléthanoïdes (PhG), les iridoïdes et les lignanes ont été isolés de cette espèce [2]. Il a été rapporté que certains des PhG possèdent des activités antioxydantes, hépatoprotectrices et neuroprotectrices [3–6]. Cependant, la procédure d'isolement et de purification des PhG est difficile et prend du temps. De plus, les méthodes chromatographiques multiples classiques utilisent non seulement un grand nombre de solvants organiques, mais donnent également une récupération d'échantillon plus faible. La chromatographie à contre-courant à grande vitesse (HSCCC), une technique de chromatographie de partage liquide-liquide sans support, offre une excellente récupération d'échantillon par rapport à certaines méthodes conventionnelles et a été largement utilisée pour la séparation et la purification de divers produits naturels [7–9] . Bien que plusieurs PhG aient été purifiés à partir deCistanchesgenre et autres par HSCCC [10–14], aucun article n'a rapporté la purification de l'actéoside, de l'isoactéoside, du syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside et du 2'-acétylactéoside dans un système biphasique.

Dans cet article, nous rapportons une méthode simple pour la séparation et la purification de quatre PhG de C. deserticola. Enfin, 30,9 mg d'actéoside, 13,0 mg d'isoactéoside, 12,5 mg de syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside et 7,2 mg de 2'-acétylactéoside ont été obtenus en une seule étape. séparation à partir de 297 mg de fraction avec des puretés de 99 %, 95 %, 99 % et 98 %, respectivement. Leurs structures ont été caractérisées sur la base des données spectrales RMN 1H et 13C et des spectres HR-MS. Les structures des quatre PhG identifiées dans cette enquête sont illustrées à la figure 1.

Résultats et discussion

Analyse HPLC de l'extrait brut

La fraction enrichie en constituants de l'extrait n-butanoïque de C. deserticola a été analysée par HPLC-UV. La colonne utilisée était une Accurasil C18 (250 mm × 4,6 mm, id 5 μm) (Thermo-Fisher Scientific Instruments, city, state abrev, USA), la phase mobile était méthanol-eau (30:70, v/v). Le débit était de 1 mL/min. La longueur d'onde du détecteur a été fixée à 254 nm. Le chromatogramme HPLC est illustré à la figure 2. Les pics 1 à 4 correspondent à l'actéoside (1), l'isoactéoside (2), le syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside (3) et le 2'-acétylactéoside (4), respectivement.

Sélection du système de solvant à deux phases

Une séparation réussie par HSCCC dépend en grande partie de la sélection d'un système de solvant à deux phases approprié, le système de solvant à deux phases a été sélectionné en fonction des valeurs de coefficient de partage (K) de chaque composant cible et une plage optimale de K doit être de {{ 2}}.5 à 2.

Dans l'expérience, les valeurs K pour les composants cibles de plusieurs systèmes de solvants à deux phases sont présentées dans le tableau 1 (bien qu'un peu plus élevées pour le pic 4, les résultats se sont avérés acceptables). Parmi eux, l'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (40:6:6:50, v/v/v/v) a donné des coefficients de partage appropriés pour les composés cibles. Finalement, le système de solvant composé d'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (40:6:6:50, v/v/v/v) a été utilisé pour isoler et purifier quatre composés de C. deserticola, comme indiqué dans Figure 3. Comme le montre la figure 2, l'analyse HPLC de chaque fraction HSCCC a révélé que quatre PhG purs (actéoside, 99 % ; isoactéoside, 95 % ; syringalide A 3′- -L-rhamnopyranoside 99 % et 2′- acétylactéoside 98 pour cent) pourrait être obtenu à partir de la fraction brute.

Expérimental

Appareil

L'équipement HSCCC utilisé dans la présente étude était un système de chromatographie à contre-courant à grande vitesse TBE-300B (Shanghai Tauto Biotech Co., Shanghai, Chine) avec trois colonnes de séparation multicouches préparatives connectées en série (diamètre du tube=2.6 mm, volume total=300 mL) et une boucle d'échantillon de 20 mL. Le rayon de révolution ou la distance entre l'axe du support et le centreaxe de la centrifugeuse (l'axe de la centrifugeuse (R) était de 5 cm, et la valeur variait de 0.5 au terminal interne à 0.8 au terminal externe (= r/R, où r est la distance entre la bobine et l'arbre du support). Un instrument de circulation à température constante HX 105 (Beijing Changliu Lab Instrument Company, Pékin, Chine) a été utilisé pour contrôler la température dans l'expérience. Le système HSCCC était équipé d'une pompe à débit constant à pression moyenne modèle TBP-5002, d'un détecteur UV modèle TBP-2000 fonctionnant à 254 nm et d'un poste de travail modèle V4.0 (Jinda Biochemistry Instrument Company, Shangai, Chine).

L'équipement de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) utilisé était un système Agilent 1200 composé d'une pompe binaire G1312A, d'un échantillonneur automatique G1329A, d'un détecteur à longueur d'onde variable (VWD) G1314A, d'un compartiment à colonne thermostaté G1316A, d'un dégazeur G1379B et d'un LC Agilent poste de travail. Un ELSD Alltech 3300 a été utilisé pour la détection des puretés. Des spectromètres RMN Agilent 6520 Q-TOF et Bruker AVANCE III 500-ont été utilisés pour l'identification structurelle des composés. Les spectres 1H et 13C-RMN (à 500 et 125 MHz, respectivement) ont été mesurés à température ambiante (22 degrés/295,1 K).

Réactifs et matériaux

L'acétate d'éthyle, le n-butanol et l'éthanol étaient de qualité analytique et le méthanol était de qualité HPLC. Tous les solvants ont été achetés auprès de Tianjin Concord Technology Company (Tianjin, Chine). De l'eau Milli-Q (18,2 MΩ) (Millipore, Bedford, MA, USA) a été utilisée pour toutes les solutions et dilutions. Le rhizome de C. deserticola a été collecté dans la province de Mongolie intérieure, République populaire de Chine, en juin 2009. La plante a été identifiée par le professeur Lijuan Zhang, et un spécimen de référence (n° 20091001) a été déposé dans notre laboratoire.

Préparation de l'échantillon brut

Des tiges charnues séchées à l'air en poudre de C. deserticola (1 kg) ont été chauffées au reflux deux fois avec de l'éthanol aqueux (8 L, 60 % v/v) pendant 2 h à chaque fois. L'extrait est évaporé sous pression réduite et à une température de 60 degrés jusqu'à évaporation totale de l'éthanol. Le résidu a été mis en suspension dans de l'eau et extrait successivement trois fois avec du chloroforme, de l'acétate d'éthyle et du n-butanol, donnant 5,16 g d'extrait n-butanoïque après évaporation à sec sous pression réduite. L'extrait n-butanoïque a ensuite été séparé sur une colonne de gel de silice (200–300 mesh) en utilisant un gradient d'élution progressif (CHCl3–MeOH, 10:1 → 1:1) pour donner huit fractions. La fraction 6 (297 mg) a été utilisée pour un isolement et une séparation supplémentaires de HSCCC.

Sélection des systèmes de solvants à deux phases

Les systèmes de solvants à deux phases ont été sélectionnés en fonction du coefficient de partage (K) des composants cibles dans la fraction de C. deserticola. Les valeurs K ont été déterminées par analyse LC comme suit : une quantité appropriée de poudre d'extrait brut (fraction 6) a été dissoute dans la phase inférieure du système de solvant et analysée par HPLC. Les aires des pics ont été enregistrées comme A1. Ensuite, un volume égal de la phase supérieure a été ajouté à la solution et mélangé soigneusement pour atteindre l'équilibre de partage. La phase inférieure a ensuite été analysée à nouveau par HPLC. Ces dernières zones de pic ont été enregistrées comme A2. Les valeurs de K ont été calculées selon l'équation suivante : K=(A1 − A2)/A2 [15,16].

Préparation du système de solvant à deux phases et de la solution d'échantillon

Dans la présente étude, le système de solvant à deux phases composé d'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (40:6:6:50, v/v/v/v) a été utilisé pour la séparation HSCCC. Chaque solvant a été ajouté à une ampoule à décanter et parfaitement équilibré à température ambiante. La phase supérieure et la phase inférieure ont été séparées et dégazées par sonication pendant 30 min peu avant utilisation. La solution d'échantillon a été préparée en dissolvant 297 mg de Fraction 6 dans 15 ml de la phase inférieure d'acétate d'éthyle-n-butanol-éthanol-eau (40:6:6:50, v/v/v/v).

Procédure de séparation HSCCC

Le HSCCC a été réalisé comme suit. La colonne spiralée multicouche a d'abord été remplie avec la phase stationnaire organique supérieure. La phase mobile aqueuse inférieure a ensuite été pompée dans l'extrémité de tête de la colonne à un débit de 1,5 ml/min, et en même temps, l'appareil HSCCC a fonctionné à une vitesse de rotation de 900 tr/min. Une fois l'équilibre hydrodynamique établi, comme indiqué par une phase mobile claire s'éluant à la sortie de la queue (environ deux heures plus tard), une solution d'échantillon de 15 ml contenant 297 mg d'extrait brut (fraction 6) a été injectée par la vanne d'injection. L'effluent de la colonne a été contrôlé en continu sous 254 nm. Quatre fractions de pic ont été recueillies selon le chromatogramme puis évaporées sous pression réduite. La température de l'appareil a été fixée à 25 degrés.

Analyse HPLC et identification des fractions de pic HSCCC

Les fractions maximales de HSCCC ont été analysées par HPLC-ELSD. La colonne utilisée était une Accurasil C18 (250 mm x 4,6 mm, id 5 μm), la phase mobile était du méthanol-eau (30:70, v/v). Le débit était de 1 mL/min. L'ELSD a fonctionné dans les conditions suivantes : température 45 degrés, gaz 1,6 L/min. L'identification structurale des quatre fractions de pic HSCCC a été réalisée par spectroscopie HR-ESI-MS, 1H et 13C-NMR.

L'identification structurelle

Fraction I : HR-ESI-MS observé à m/z 623,2001 (M-H)-, calculé pour C29H35O15, 623,1981. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) δ ppm : 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 du rhamnose), 2,79 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, ré, J=8 Hz, H-1 de glucose), 5,18 (1H, ré, J=1 Hz, H{{34} } de rhamnose), 6,27 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar -CH=CH-), 6,5–7,1 (6H, H aromatique). }), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4), 116,4 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,6 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,3 (Caf-2), 146,9 (Caf-3), 149,8 (Caf-4), 116,6 (Caf{{ 98}}), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 114,8 (Caf- ), 148,1 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,1 (Glc{{116} }), 81,7 (Glc-3), 70,5 (Glc-4), 76,3 (Glc-5), 62,4 (Glc-6), 103,1 (Rha{{131} }), 72,3 (Rha-2), 72,1 (Rha-3), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,5 (Rha{{146} }). Par rapport aux données de la littérature [17], la fraction I correspondait à l'actéoside.

Fraction II : HR-ESI-MS observé à m/z 623,1987 (M-H)-, calculé pour C29H35O15, 623,1981. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) δ ppm : 1,25 (3H, d, J=6,5 Hz, CH3 du rhamnose), 2,78 (2H, t, J=7 Hz, Ar-CH2-), 4,33 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucose), 5,17 (1H, d, J {{ 33}} Hz, H-1 de rhamnose), 6,28 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,56 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromatique). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) δ ppm : 131,5 (C-1), 117,2 (C-2), 146,2 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,5 (C-5), 121,3 (C-6), 72,4 (C- ), 36,7 (C- ), 127,8 (Caf-1), 115,2 (Caf{{89 }}), 146,8 (Caf-3), 149,7 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 169,2 (Caf- ), 115,0 (Caf- ), 147,3 (Caf- ), 104,5 (G-1), 75,5 (Glc-2), 84,2 (Glc-3), 70,1 (Glc-4 ), 75,7 (Glc-5), 64,7 (Glc-6), 102,8 (Rha-1), 72,4 (Rha-2), 72,4 (Rha-3 ), 74,1 (Rha-4), 70,5 (Rha-5), 17,9 (Rha-6). Les données spectrales 1H-NMR et 13C-NMR étaient en accord avec celles de l'isoacteoside telles que rapportées dans la littérature [18].

Fraction III : HR-ESI-MS observé à m/z 6{{108}}7,2032 (M−H)−, calculé pour C29H35O14, 607,2032. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) δ ppm : 1,09 (3H, d, J=6 Hz, CH3 du rhamnose), 2,84 (2H, t, J=7.5 Hz, Ar-CH 2-), 4,37 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucose), 5,19 (1H, d, J=1.5 Hz, H{{ 35}} de rhamnose), 6,27 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH=CH-), 7,59 (1H, d, J=16 Hz, Ar-CH =CH-), 6,6–7,1 (7H, H aromatique). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) δ ppm : 130,8 (C-1), 116,2 (C-2), 130,9 (C-3), 156,8 (C-4 ), 130,8 (C-5), 116,2 (C-6), 72,4 (C- ), 36,4 (C- ), 127,8 (Caf-1), 114,8 (Caf{{88 }}), 149,8 (Caf-3), 146,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,3 (Caf- ), 115,4 (Caf- ), 148,0 (Caf- ), 104,3 (G-1), 76,3 (Glc-2), 81,7 (Glc-3), 70,4 (Glc-4 ), 76,1 (Glc-5), 62,5 (Glc-6), 103,0 (Rha-1), 72,3 (Rha-2), 72,2 (Rha-3 ), 73,9 (Rha-4), 70,7 (Rha-5), 18,4 (Rha-6). Selon la littérature [18], la fraction III correspondait au syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside.

Fraction IV : HR-ESI-MS observé à m/z 665,21{{20}} (M−H)−, calculé pour C31H37O16, 665,2087. 1H-RMN (500 MHz, CD3OD) δ ppm : 1,09 (3H, d, J=6.5 Hz, CH3 du rhamnose), 2,00 (3H, s, OAc), 2,72 (2H, t, J { {25}}.5 Hz, Ar-CH2-), 4,55 (1H, d, J=8 Hz, H-1 de glucose), 4,90 (1H, d, J { {37}} Hz, H-1 de rhamnose), 6,29 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 7,62 (1H, d, J=15.5 Hz, Ar-CH=CH-), 6,5–7,0 (6H, H aromatique). 13C-RMN (125 MHz, CD3OD) δ ppm : 131,9 (C-1), 117,3 (C-2), 146,1 (C-3), 144,7 (C-4 ), 116,4 (C-5), 121,4 (C-6), 72,7 (C- ), 36,4 (C- ), 127,7 (Caf-1), 115,4 (Caf{{93 }}), 146,9 (Caf-3), 149,9 (Caf-4), 116,6 (Caf-5), 123,2 (Caf-6), 168,1 (Caf- ), 114,7 (Caf- ), 148,2 (Caf- ), 101,8 (G-1), 75,3 (Glc-2), 80,3 (Glc-3), 70,8 (Glc-4 ), 76,2 (Glc-5), 62,3 (Glc-6), 103,3 (Rha-1), 72,0 (Rha-2), 71,8 (Rha-3 ), 73,7 (Rha-4), 70,8 (Rha-5), 18,5 (Rha-6), 171,5 (C=O), 20,9 (OAC). Les données spectrales RMN 1H et RMN 13C étaient en accord avec celles du 2'-acétylactéoside [17].

conclusion

Méthode HSCCC pour la séparation préparative et la purification de l'actéoside, de l'isoactéoside, du syringalide A 3'- -L-rhamnopyranoside et du 2'-acétylactéoside à partir deCistanches deserticola YC Maa été établi. La présente étude indique que HSCCC est une technique très puissante pour la séparation préparative et la purification des composants bioactifs à partir de matières végétales. En outre, les composés peuvent être isolés à une échelle suffisamment grande avec des puretés élevées et peuvent ensuite être utilisés comme substances de référence pour des études de chromatographie ou de bioactivité. La méthode est une technique faisable, économique et efficace pour l'isolement préparatif rapide de produits naturels compliqués.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le programme pour les boursiers de Changjiang et l'équipe de recherche innovante de l'université (PCSIRT), le projet de plan de coopération internationale du ministère des Sciences et de la Technologie de Chine (2008DFB30070) et le programme scientifique de Left Banner of Alashan ({{2 }}).

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