Effets protecteurs de l'acide alpha-lipoïque contre la mucosite gastro-intestinale induite par le 5-fluorouracile chez le rat, partie 1

Abstrait: L'acide alpha-lipoïque (ALA) est largement utilisé dans les formules multivitaminées et les produits anti-âge. Le but de cette étude était d'étudier les avantages protecteurs potentiels de l'ALA sur la mucosite gastro-intestinale induite par le 5-fluorouracile (5-FU) chez des rats Wistar albinos. Des tissus de l'estomac, de l'intestin grêle et du gros intestin ont été excisés et des sérums sanguins ont été obtenus pour identifier les indices biochimiques tels que TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 et TIMP-1. Une étude histopathologique a également été réalisée. Les résultats ont révélé des taux élevés de TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 et TIMP-1 dans les tissus et les sérums et ces valeurs ont chuté de façon spectaculaire après le traitement à l'ALA. Les activités SOD et GPx réduites dans les groupes de mucosite ont été inversées dans les groupes traités à l'ALA. Les dommages produits par la mucosite dans l'estomac et l'intestin grêle ont régressé dans le groupe traité à l'ALA, selon l'évaluation histopathologique. Par conséquent, la mise en œuvre de la supplémentation en ALA dans la thérapie 5-FU peut agir comme une intervention protectrice pour les patients cancéreux atteints de mucosite gastro-intestinale. À la lumière des résultats, l'ALA, un antioxydant d'origine alimentaire doté de propriétés pléiotropes, pourrait constituer un traitement efficace pour la mucosite gastro-intestinale induite par le 5-FU et prévenir le stress oxydatif, l'inflammation et les lésions tissulaires chez les patients cancéreux recevant du {{ 24}}Thérapie FU.

Le glycoside de cistanche peut également augmenter l'activité de la SOD dans les tissus cardiaques et hépatiques et réduire considérablement la teneur en lipofuscine et en MDA dans chaque tissu, piégeant efficacement divers radicaux réactifs de l'oxygène (OH-, H₂O₂, etc.) et protégeant contre les dommages à l'ADN causés par des radicaux OH. Les glycosides phényléthanoïdes de Cistanche ont une capacité de piégeage robuste des radicaux libres, une capacité de réduction supérieure à celle de la vitamine C, améliorent l'activité de la SOD dans la suspension de sperme, réduisent la teneur en MDA et ont un certain effet protecteur sur la fonction de la membrane du sperme. Les polysaccharides Cistanche peuvent améliorer l'activité de la SOD et du GSH-Px dans les érythrocytes et les tissus pulmonaires de souris sénescentes expérimentalement causées par le D-galactose, ainsi que réduire la teneur en MDA et en collagène dans les poumons et le plasma et augmenter la teneur en élastine, ont un bon effet de piégeage sur le DPPH, prolonge le temps d'hypoxie chez les souris sénescentes, améliore l'activité de la SOD dans le sérum et retarde la dégénérescence physiologique du poumon chez les souris expérimentalement sénescentes Avec la dégénérescence morphologique cellulaire, des expériences ont montré que Cistanche a la bonne capacité antioxydante et a le potentiel d'être un médicament pour prévenir et traiter les maladies du vieillissement cutané. Dans le même temps, l'échinacoside dans Cistanche a une capacité significative à piéger les radicaux libres DPPH et peut piéger les espèces réactives de l'oxygène, empêcher la dégradation du collagène induite par les radicaux libres et a également un bon effet réparateur sur les dommages causés par les anions des radicaux libres thymine.

Cliquez sur Cistanche Tubulosa

【Pour plus d'informations :george.deng@wecistanche.com / WhatApp :86 13632399501】

1. Introduction

L'acide alpha-lipoïque (ALA) est présent dans une large gamme d'aliments, y compris les légumes (épinards, brocolis, tomates) et les viandes (surtout les viscères), ainsi que plusieurs suppléments nutritionnels [1,2]. L'ALA a de nombreux effets antioxydants, notamment l'activation de mécanismes antioxydants endogènes et la chélation d'ions métalliques tels que le fer, le zinc et le cuivre [3,4]. En tant que molécule organosoufrée, l'ALA peut piéger les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et stimuler l'activité des enzymes antioxydantes tissulaires telles que la glutathion peroxydase (GPx) et la superoxyde dismutase (SOD) [5–7]. En raison de ses propriétés antioxydantes, il a été démontré que l'ALA réduit la mort cellulaire dépendante de l'ALA dans le cancer du poumon [8], le cancer du sein [9] et le cancer du côlon [10]. De plus, des recherches antérieures ont montré que l'ALA possède des propriétés anti-inflammatoires [11-16]. L'ALA agit pour réduire l'inflammation en modulant l'expression de cytokines inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-) et l'interleukine-1 (IL-1) [17,18]. Les avantages pharmacologiques de l'ALA ont été prouvés dans une grande variété de domaines liés à la médecine, y compris les modèles cardiovasculaires, neuroprotecteurs, cognitifs et anti-âge [19].

Le cancer est la première cause de mortalité dans tous les pays et un obstacle majeur à la longévité [20]. Les effets secondaires des médicaments chimiothérapeutiques sont l'un des facteurs débilitants les plus importants dans la lutte contre le cancer, et la mucosite est l'une des maladies les plus répandues rencontrées chez les patients atteints de cancer [21]. La mucosite est une affection inflammatoire pathologique caractérisée par une ulcération et une inflammation de la muqueuse du système gastro-intestinal [22]. La mucosite augmente l'utilisation d'analgésiques opioïdes en raison de la douleur et accélère la transition vers une nutrition parentérale totale en raison de problèmes nutritionnels [23]. La mucosite et les difficultés liées à la mucosite diminuent la qualité de vie du patient, tandis que le développement d'affections potentiellement mortelles et les réponses négatives au traitement sont une source de préoccupation en raison d'un mauvais traitement des lésions [24].

Le médicament chimiothérapeutique le plus souvent utilisé dans les tumeurs malignes gastro-intestinales est l'analogue de la pyrimidine 5-fluorouracile (5-FU). Le 5-FU exerce ses effets anticancéreux en inhibant la thymidylate synthase (TS) et en intégrant ses métabolites dans l'ARN et l'ADN [25]. Cependant, cet agent induit une mucosite gastro-intestinale, un effet secondaire débilitant grave [26]. En particulier, la dégradation de l'équilibre oxydant-antioxydant, une élévation des taux de cytokines pro-inflammatoires et l'activité des enzymes protéolytiques jouent un rôle majeur dans le développement de ces effets indésirables. Bien que des médicaments antioxydants et anti-inflammatoires aient été utilisés pour tenter de résoudre ce problème, une méthode thérapeutique particulièrement robuste n'a pas encore été identifiée [27,28].

À ce jour, plusieurs études ont rapporté l'utilisation de 5-FU et ALA ensemble dans différents cancers ; ceux-ci incluent les tumeurs cervicales et colorectales [29,30]. En outre, des médicaments auxiliaires qui pourraient être incorporés dans les procédures de traitement pour prévenir les patients cancéreux des effets indésirables de la mucosite gastro-intestinale induits par le 5-FU seraient avantageux. Ainsi, le but de cette étude était de déterminer les effets biologiques de l'utilisation de l'ALA chez le rat avec un modèle de mucosite créé par 5-FU, en plus d'examiner son utilisation possible en tant qu'agent candidat dans les protocoles de traitement.

2. Matériels et méthodes

2.1. Animaux

Les animaux ont été prélevés dans les unités d'expérimentation animale de l'Université du Proche-Orient. Les rats (Wistar albinos, les deux sexes) ont été maintenus sous un cycle d'obscurité/lumière de 12h12 depuis le début à une température ambiante de 22 ± 2 ◦C dans une installation à humidité contrôlée (50 ± 5 pour cent). L'alimentation était ad libitum sans aucune restriction à leur nourriture standard pour rats et à l'eau potable. Les rats ont été logés dans une cage en plexiglas (4 rats par cage de dimensions 60 × 40 × 40 cm). Le protocole d'étude a été autorisé par le comité d'éthique des expériences animales locales de l'Université du Proche-Orient (approbation n° 2019/01 le 17 janvier 2019 et 2020/11 le 27 novembre 2020), et les directives éthiques mentionnées dans la déclaration d'Helsinki de 1964 et ses modifications ultérieures ont été suivis.

Trente-deux rats Wistar Albinos des deux sexes pesant de 200 à 250 g ont été répartis en quatre groupes de huit rats chacun (n=8) : groupes de contrôle, ALA, mucosite et mucosite plus ALA. Le groupe témoin n'a reçu qu'une solution saline (SF) intrapéritonéale (IP) une fois par jour pendant une semaine. Le groupe ALA a reçu uniquement de l'ALA à une dose de 100 mg/kg ip une fois par jour pendant une semaine à partir du jour 1 [31,32]. Le groupe mucosite a été traité avec SF (ip) le jour 1 et 400 mg/kg 5-FU ip du jour 2 jusqu'à la fin de l'expérience [33]. Le groupe mucosite plus ALA a reçu 100 mg/kg d'ALA ip le jour 1 et 400 mg/kg ip 5-FU le jour 2. Ensuite, l'administration ip de 100 mg/kg/jour d'ALA ip a été poursuivie jusqu'à la fin de l'expérience. . Les animaux ont été surveillés pendant une semaine sans aucun cas de mortalité pendant cette période. Les animaux de tous les groupes ont été euthanasiés à la fin de la période de recherche par l'administration d'une combinaison d'une surdose de kétamine/xylazine. Les tests de laboratoire ont été effectués au laboratoire de diagnostic et au laboratoire d'histopathologie de l'hôpital vétérinaire de l'université du Proche-Orient.

2.2. Prélèvement d'échantillons de sang et de tissus

Des échantillons de sang ont été prélevés et soumis au laboratoire dans des tubes séparateurs de sérum. Les échantillons de sérum ont été séparés à 2000 × g pendant 10 min et conservés à -80 ◦C jusqu'à une analyse plus approfondie. Pour éliminer l'excès de sang, les tissus de l'estomac, de l'intestin grêle et du gros intestin ont été prélevés et rincés avec une solution tampon phosphate (pH=7.4). Puis, après avoir été livrés au laboratoire, ils ont subi une procédure d'homogénéisation. L'homogénéisation des tissus a été réalisée selon le protocole du fabricant en utilisant un tampon RIPA (article n° 10010263, lot n° 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) et un broyeur de tissus Dounce (D8938, Lot. 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) sur la glace. Après homogénéisation, les échantillons ont été centrifugés à 1600 × g pendant 10 min à plus 4 ◦C. La technique de détermination des protéines de Bradford a été utilisée pour quantifier les niveaux de protéines dans les échantillons de tissus, et les surnageants ont ensuite été congelés à -80 ◦C pour une enquête ultérieure.

2.3. Mesures des indices biochimiques

Activités de l'alanine transaminase (ALT), de l'aspartate transaminase (AST), de la phosphatase alcaline (ALP), de la lactate déshydrogénase (LDH), de la lipase (LIP), de l'amylase (AMY), de la créatinine, de l'azote uréique du sang (BUN), des protéines totales (TP) , et les niveaux d'albumine ont été mesurés en tant qu'indices biochimiques dans des échantillons de sérum à l'aide d'un analyseur de chimie clinique automatisé BS-240 VET (Mindray, Shenzhen, Chine).

2.4. Mesure des cytokines dans les sérums et les tissus

Les concentrations de TNF- et d'IL-1 dans le sérum et les échantillons de tissus ont été mesurées à l'aide de kits de test ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) disponibles dans le commerce (ELR-TNF- et ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA) en suivant les instructions du fabricant.

2.5. Mesure des métalloprotéinases matricielles (MMP) et des inhibiteurs tissulaires de la métalloprotéinase-1 (TIMP-1) dans le sérum et les tissus

Les MMP et les TIMP-1, qui sont impliqués dans divers processus biologiques, tels que le cancer et l'inflammation, ont été mesurés dans les homogénats de tissus et les sérums en suivant les instructions du fabricant et les recommandations des tests ELISA spécifiques au rat disponibles dans le commerce (MMP{ {2}} E-EL-R0617 ; Elabscience, Wuhan, Chine ; MMP-2 ELR-MMP2 ; MMP-8 ELR-MMP8 ; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, Géorgie, États-Unis). Les concentrations sériques des MMP et du TIMP -1 ont été exprimées en pg/mL, tandis que les niveaux tissulaires ont été exprimés en pg/mg de protéine.

2.6. Mesure du malondialdéhyde (MDA), GPx et SOD dans les tissus

Les niveaux de MDA dans les tissus ont été évalués à l'aide de kits de dosage disponibles dans le commerce pour déterminer l'état de peroxydation des lipides (TBARS Assay Kit, article n° 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Le principe de mesure est basé sur la réaction avec l'acide thiobarbiturique (TBA) dans de l'eau bouillante pendant 60 min en milieu acide et la mesure de l'absorbance du mélange réactionnel à 532 nm (Ohkawa et al., 1979). Un lecteur de microplaques accordable VersaMax a été utilisé pour mesurer l'absorbance (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Les concentrations de MDA dans les tissus ont été exprimées en nmol de MDA/mg de protéine.

Dans les tissus, l'activité GPx et SOD a été évaluée à l'aide de kits de dosage prêts à l'emploi. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Royaume-Uni) en utilisant un analyseur de chimie clinique BS-240 VET automatisé (Mindray, Shenzhen, Chine). Les quantités de GPx et de SOD dans les échantillons de tissus (estomac, intestin grêle et gros intestin) ont été exprimées en U/mg de protéine.

2.7. Évaluation histopathologique

Les tissus de l'estomac, de l'intestin grêle et du gros intestin obtenus immédiatement après la période expérimentale ont été fixés dans du formol neutre à 10 % (v/v) pendant 24 h à température ambiante. Après fixation, les tissus ont été placés sur un dispositif de suivi des tissus, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne). Les tissus prélevés sur le dispositif de suivi des tissus ont ensuite été inclus dans de la paraffine. Des sections de 5- µm d'épaisseur ont été découpées dans les tissus à l'aide d'un microtome Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Allemagne), et une coloration de routine à l'hématoxyline et à l'éosine (HE) a été effectuée. Les coupes ont été examinées histomorphologiquement avec un microscope optique Leica DM500 couplé au système d'analyse d'imagerie numérique intégré Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite version 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Allemagne).

2.8. Analyses statistiques

Le logiciel GraphPad Prism a été utilisé pour l'analyse statistique (version 7.04, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Les données ont toutes été exprimées en moyenne ± écart type (X ± SD). Un test d'analyse de la variance (ANOVA) a été utilisé pour comparer les groupes de données, suivi du test de comparaison multiple de Tukey. De plus, le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour comparer les scores histomorphologiques entre les groupes. Une différence de p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

3. Résultats

3.1. L'ALA affecte positivement les indices biochimiques

Le tableau 1 présente l'activité enzymatique sérique et les concentrations de métabolites. Par rapport au groupe témoin, le groupe mucosite présentait des niveaux sensiblement plus élevés d'albumine, ALT, AST, ALP, LDH, amylase, lipase, BUN, créatinine et TP (p <0.05 –0.0001). Cependant, il y avait une différence significative dans les niveaux d'albumine, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, créatinine, amylase, BUN et créatinine entre le groupe ALA plus mucite et le groupe mucite (p < 0,05–0,001). Les taux d'ALP, d'ALT, d'AST, de LDH et d'amylase étaient également sensiblement différents entre les groupes mucosite et ALA (p < 0,05–0,0001). En conséquence, les niveaux d'enzymes hépatiques, d'enzymes pancréatiques et de métabolites ont été observés comme étant considérablement réduits dans le groupe mucosite lorsque l'ALA a été ajouté au traitement.

3.2. L'ALA diminue la production de cytokines pro-inflammatoires

Les niveaux de cytokines pro-inflammatoires TNF- et IL-1 dans les échantillons de sérum, d'estomac, d'intestin grêle et de gros intestin sont illustrés à la figure 1. Les niveaux de TNF- et IL-1 dans les sérums et tous les tissus des animaux du groupe Mucosite étaient significativement plus élevés que ceux des groupes Témoin, ALA et Mucosite plus ALA (p <0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Cependant, les niveaux de TNF- et d'IL-1 dans les sérums et tous les tissus ont diminué de manière significative dans le groupe Mucite plus ALA par rapport au groupe Mucite (p <0.05–0.0001). Entre les groupes Contrôle et Mucosite plus ALA, il y avait une différence substantielle dans les niveaux de TNF- dans l'intestin grêle et le gros intestin. (p < 0,01). Il y avait également des différences significatives dans les niveaux de TNF- dans le gros et le petit intestin entre les groupes ALA et mucosite plus ALA. (p < 0,01, p < 0,001, respectivement). De plus, il y avait des différences statistiquement significatives entre les groupes Témoin et Mucosite plus ALA en termes de niveaux d'IL-1 dans l'estomac (p < 0,05). Par conséquent, l'ALA semble supprimer de manière significative les niveaux de cytokines pro-inflammatoires dans la mucosite.

3.3. Le traitement ALA réduit la peroxydation des lipides et augmente les activités des enzymes antioxydantes dans les tissus

Les niveaux de MDA, les activités GPx et SOD ont été quantifiés pour évaluer la peroxydation et le statut antioxydant au niveau tissulaire (Figure 2). Les niveaux de MDA dans l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin du groupe mucosite étaient significativement plus élevés que dans les groupes contrôle, ALA et mucosite plus ALA (p <0.05–0 .0001). De plus, les niveaux de MDA dans le gros intestin du groupe Mucite plus ALA étaient substantiellement différents de ceux des groupes Témoin et ALA (p < 0,0001).

Les rats des groupes Contrôle et ALA présentaient des niveaux de SOD significativement plus élevés dans tous les tissus que les rats du groupe Mucite (p <{0}}.05–0.{{8 }}{{10}}01). Les niveaux de SOD dans les échantillons de gros intestin étaient significativement différents dans les groupes ALA et mucosite plus ALA (p < 0,01). Dans les échantillons d'estomac, les niveaux de SOD étaient significativement plus faibles dans les groupes ALA et mucosite plus ALA (p < 0,05). De plus, les niveaux de SOD dans l'intestin grêle des rats du groupe mucite étaient sensiblement inférieurs aux niveaux de SOD dans le groupe ALA (p < 0,05). Cependant, les niveaux de SOD dans l'estomac et le gros intestin des animaux des groupes mucosite et mucosite plus ALA étaient substantiellement différents (p < 0,05–0,0001).

3.4. Le traitement ALA augmente les niveaux de MMP tissulaires et de TIMP-1

Les activités MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 et TIMP-1 (tableau 2) dans le sérum, l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin étaient significativement plus élevé dans le groupe Mucite par rapport aux groupes Contrôle et ALA (p < 0.05–0.0001). L'augmentation des niveaux de MMP-1, MMP-2, MMP-8 et TIMP-1 dans le sérum et l'estomac, l'intestin grêle et le gros intestin des rats atteints de mucosite a été significativement supprimée chez Mucosite plus rats ALA (p < 0,05–0,0001), bien qu'il n'y ait pas eu de différence significative dans les taux sériques de MMP-8 entre les groupes mucosite plus ALA et mucosite.