Quantification de la dégénérescence des neurites avec une précision et une efficacité améliorées dans un modèle in vitro de la maladie de Parkinson, partie 2

Résultats

Établissement d'un modèle de culture cellulaire de dégénérescence des neurites associée à la MP

Pour développer une méthode d'étude de la dégénérescence des neurites dans un modèle de culture cellulaire de la maladie de Parkinson, nous avons utilisé des cellules LUHMES en culture, une population de cellules mésencéphaliques humaines immortalisées sous condition. Lors de leur différenciation, les cellules LUHMES deviennent postmitotiques, adoptent un profil d'expression génique caractéristique des neurones dopaminergiques matures et développent une morphologie neuronale avec des neurites qui s'étendent jusqu'à 500 mm de longueur (Fig. 1A ; Lotharius et al., 2005 ; Scholz et al. , 2011 ; Kraemer et al., 2021).

La neurodégénérescence, une maladie dans laquelle les cellules nerveuses mutent ou meurent, est étroitement liée à la mémoire. Dans les modèles de culture cellulaire, nous pouvons contrôler les conditions de culture pour atténuer l’expression de la neurodégénérescence et ainsi améliorer les performances de la mémoire.

Des études ont montré que l’homéostasie des cellules nerveuses joue un rôle important dans la survie cellulaire et le fonctionnement du système. Nous pouvons améliorer la stabilité des cellules en contrôlant des facteurs tels que les nutriments et les facteurs de croissance dans le milieu de culture. Dans le même temps, faites attention au maintien de la propreté et au contrôle de la température de l’environnement de culture pour éviter que les cellules ne soient perturbées et endommagées par l’environnement.

De plus, dans le modèle de culture cellulaire, nous pouvons également injecter certains composés ou médicaments dans les cellules pour réduire l’expression de la neuromodulation, améliorant ainsi le taux de survie et les performances de mémoire des cellules. Cette technique est également largement utilisée dans l’étude des maladies neurodégénératives.

En bref, la neurodégénérescence a un impact important sur la stabilité cellulaire et le fonctionnement du système, et la technologie de culture cellulaire est une bonne méthode de recherche modèle, qui peut mener une exploration et des recherches approfondies sur la relation entre la neurodégénérescence et la mémoire. Nous pouvons atténuer les performances de neuromodulation en cultivant le contrôle de l'environnement, en injectant des médicaments dans les cellules, etc., pour améliorer la survie cellulaire et les performances de la mémoire et fournir une base plus complète pour l'étude des maladies neurodégénératives. On voit que nous devons améliorer notre mémoire. Le Cistanche peut améliorer considérablement notre mémoire, car le Cistanche peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme l'augmentation du niveau d'acétylcholine et des facteurs de croissance, qui sont très importants pour la mémoire et l'apprentissage. En outre, la viande peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutrition et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau.

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En raison des qualités optiques supérieures du verre par rapport au plastique, les cultures ont été établies sur des lames de verre contenant huit chambres à milieu. Sur la base de rapports précédents (Lotharius et al., 2005 ; Scholz et al., 2011 ; Kurowska et al., 2014), nous avons initialement tenté d'établir des cultures sur des lames de chambre recouvertes de PLO et de fibronectine ; cependant, ces cultures présentaient des déficits d’adhésion et une faible viabilité. En conséquence, nous avons testé si le revêtement avec des substrats supplémentaires améliorerait la viabilité des cultures cellulaires LUHMES établies sur des surfaces en verre.

Les cultures cellulaires LUHMES ont été établies sur des lames non recouvertes ou recouvertes de PLO et de fibronectine, de PDL et de laminine, ou d'une combinaison des quatre substrats. L'analyse des noyaux viables par microscopie à fluorescence a révélé que le revêtement des lames affectait de manière significative la viabilité des cultures [Friedman x2 (3)=18, p, 0.0001], avec des analyses de comparaisons multiples post hoc révélant que les lames recouvertes d'une combinaison des quatre substrats susmentionnés donnent un taux de cellules viables significativement plus élevé par rapport aux lames recouvertes uniquement de PLO et de fibronectine (p=0,0437 ; Fig. 1B, C).

Après avoir identifié les substrats de revêtement optimaux pour la culture de cellules LUHMES sur des lames de verre, nous avons évalué les effets de la densité cellulaire sur l'adéquation des cultures aux mesures de dégénérescence des neurites. Les cellules LUHMES ont été cultivées dans un milieu de différenciation avec des densités d'étalement de 57 500 cellules par puits, 115 000 cellules par puits ou 230 000 cellules par puits, et à leur cinquième jour de différenciation, les cellules ont été fixés avec 4% de PFA et imagés par microscopie à contraste de phase.

Une densité de 57 500 cellules par puits a donné lieu à des cultures avec des neurites mal connectés et une morphologie irrégulière des neurites, tandis que les cultures établies avec une densité de placage de 230 000 cellules, bien que viables, contenaient des densités de neurites trop élevées pour une mesure précise des neurites. La densité cellulaire intermédiaire de 115,000 cellules par puits offrait une viabilité élevée et des faisceaux d'axones bien séparés propices à des mesures précises de dégénérescence des neurites (Fig. 1D).

Pour modéliser in vitro la dégénérescence des neurites associée à la MP, nous avons exposé des cellules LUHMES différenciées à l'6-OHDA, une neurotoxine largement utilisée qui favorise le stress oxydatif et la dégénérescence des neurones catécholaminergiques (Bové et Perier, 2012). L'exposition de cellules LUHMES différenciées à l'6-OHDA a favorisé une augmentation dose-dépendante de la dégénérescence des neurites, avec 5,0 mM de 6-OHDA et 7,5 mM de 6-OHDA induisant respectivement une dégénérescence des neurites modérée et sévère (Fig. .2F). Pour quantifier la dégénérescence des neurites dans des cultures de cellules LUHMES exposées à 6-OHDA, nous avons utilisé une méthode largement citée dans laquelle les images à contraste de phase des cultures sont binarisées, les corps cellulaires des images sont supprimés numériquement et l'algorithme d'analyse de particules de ImageJ est appliqué pour mesurer la surface des fragments de neurites. Les zones de neurites fragmentées sont ensuite additionnées et divisées par la surface totale des neurites pour déterminer une DI (Fig. 2A – E ; Sasaki et al., 2009 ; Kraemer et al., 2014 ; Di Stefano et al., 2015 ; Hill et al. ., 2018 ; Geisler et al., 2019).

Comme prévu, l'exposition de cellules LUHMES différenciées à 6- OHDA a provoqué une augmentation dose-dépendante du DI (F(3,24)= 119.8, p=0.0001, R{ {8}}.9374 ; figure 2G). Cependant, lors des analyses de cellules exposées à 6-OHDA, nous avons observé plusieurs problèmes qui semblaient avoir un impact négatif sur la précision et l'efficacité des mesures DI. Ainsi, nous avons cherché à optimiser cette méthode courante pour effectuer des mesures DI, que nous appelons désormais la méthode DI traditionnelle, afin de générer un protocole facilitant une mesure plus efficace de la fragmentation des neurites.

Réduire la fragmentation artificielle associée à la binarisation des micrographies

Lors de l'utilisation de la méthode DI traditionnelle, nous avons fréquemment observé un problème dans lequel les neurites intacts dans les images à contraste de phase apparaissaient fragmentés dans leur image binarisée correspondante (Fig. 3A). Cette fragmentation artificielle affectait principalement les neurites de faible importance. Ainsi, nous avons étudié si le problème pouvait être réduit par des procédures améliorant le contraste de l’image. Pour améliorer le contraste de l'image, nous avons d'abord capturé des images de neurites en utilisant diverses intensités lumineuses afin de déterminer le niveau de luminosité de l'image qui produirait un contraste optimal.

Les images capturées avec l'intensité lumineuse optimale ont ensuite été soumises à une amélioration supplémentaire du contraste en utilisant ImageJ pour appliquer une LUT avec des valeurs d'intensité minimale et maximale de 90 et 205, respectivement. L'incorporation de ces améliorations de contraste a fourni une représentation modérément plus précise des neurites dans des images binarisées générées à partir d'images à contraste de phase (Fig. 3B). Néanmoins, l'analyse quantitative d'images binarisées de neurites sains a indiqué que les améliorations de contraste ne diminuaient pas de manière significative la fragmentation artificielle (p=0,9999 ; Fig. 3D). Ainsi, nous avons ensuite étudié si l’utilisation de l’imagerie par immunofluorescence produirait des images avec un contraste supérieur et faciliterait ainsi la production d’images de neurites binarisées plus précises avec une fragmentation artificielle réduite.

Les lames décrites dans la figure 2, présentant des cellules LUHMES fixes exposées à diverses concentrations de 6- OHDA, ont été immunocolorées pour la protéine cytosquelettique b III-tubuline, imagées par microscopie à fluorescence et analysées par un enquêteur en aveugle pour la fragmentation artificielle (Fig. .3C). L'analyse quantitative des images binarisées obtenues à partir de micrographies à fluorescence et de micrographies à contraste de phase correspondantes a révélé que le type de microscopie affectait les niveaux de fragmentation artificielle [Friedman x2 (3)=15.44, p, 0.0001] . Plus précisément, les micrographies à fluorescence ont produit des images binarisées avec une fragmentation artificielle considérablement réduite par rapport à celles des micrographies à contraste de phase (p=0,0016 ; Fig. 3D).

En conséquence, les images de cultures saines ont donné des scores DI significativement inférieurs lorsque des micrographies à fluorescence étaient utilisées plutôt que des micrographies à contraste de phase (F(1,8)= 131.4, p=0.{{12} }001, R2=0.1442 ; figure 3E). De plus, une tendance générale notable est que le changement entre les valeurs moyennes de DI associées aux cultures saines (traitées avec un véhicule) et aux cultures présentant une dégénérescence des neurites (5,0 ou 7,5 mM 6-traitées par l'OHDA) était plus important lorsqu'il était mesuré à l'aide de micrographies à fluorescence. que lorsqu'ils sont obtenus à partir de micrographies à contraste de phase (Fig. 3E). Cela s'est produit malgré que les micrographies à fluorescence de cultures présentant une dégénérescence modérée des neurites (induite par une exposition à 5 mM de 6-OHDA) avaient des scores DI significativement inférieurs à ceux des images de phase correspondantes en raison de la réduction de la fragmentation artificielle (p=0,0001. , ré=0.6312).

Optimisation des paramètres pour la détection des neurites fragmentés et des neurites totaux
La méthode traditionnelle pour effectuer des mesures DI implique l'utilisation du plugin Analyse Particles pour ImageJ avec des paramètres de taille de 20 10,000 pixels pour détecter les fragments de neurites. Cependant, nous avons observé qu'une grande proportion de fragments de neurites n'étaient pas détectés par l'analyseur de particules lors de l'utilisation de ces paramètres largement cités (Shin et al., 2012 ; Di Stefano et al., 2015 ; Sasaki et al., 2016 ; Loreto et al. , 2020 ; Shin et Cho, 2020) pour mesurer la dégénérescence des neurites dans des micrographies à contraste de phase de cellules LUHMES exposées à 6-OHDA, générées comme décrit dans la figure 2.

Ainsi, nous avons réanalysé les images de cet ensemble de données en utilisant différentes limites de taille minimale pour la détection des particules afin de déterminer les paramètres optimaux pour l'identification des fragments de neurites. À partir de l'évaluation qualitative des images binarisées générées à partir de micrographies à contraste de phase, des paramètres de taille de 5 à 10 000 pixels ont amélioré la détection des fragments de neurites, mais ont également été associés à une identification erronée du bruit de fond, des artefacts d'image ou d'autres petits matériel non neurite sous forme de fragments neurites. Cependant, par rapport aux paramètres largement utilisés de 20 à 10 000 pixels, les paramètres de 10 à 10 000 pixels ont amélioré la détection des fragments de neurites sans augmentation notable des faux positifs (Fig. 4A). , gauche).

Des analyses similaires ont également été effectuées avec des images binarisées obtenues à partir de micrographies à fluorescence de cellules LUHMES immunomarquées pour la tubuline b III. Les paramètres de taille de l'analyseur de particules de 5 à 10 000 pixels ont facilité la détection la plus sensible des fragments de neurites et, comme les micrographies à fluorescence présentaient moins de petits débris, ces paramètres n'ont pas sensiblement augmenté l'identification erronée de matériaux non neurites en tant que fragments de neurites. (Fig. 4A, à droite).

La méthode traditionnelle pour effectuer des mesures DI, en utilisant des paramètres de taille de l'analyseur de particules de 20 à 10,000 pixels, exclut les objets inférieurs à 20 pixels des mesures de fragments de neurites.

Cependant, ces petits objets sont généralement inclus par erreur dans les mesures de la surface totale des neurites, puisque la méthode de mesure DI traditionnelle implique de calculer la surface totale des neurites en additionnant tous les pixels noirs dans les images binarisées. Pour résoudre ce problème, nous avons utilisé le plugin Particle Remover pour ImageJ, écrit par le développeur d'ImageJ Wayne Rasband, pour supprimer les petits objets non névrites des images binarisées. L'application de ce plugin lors de l'exécution de mesures DI à l'aide de micrographies à contraste de phase de cellules LUHMES exposées à 6-OHDA, générées comme décrit dans la figure 2, a entraîné une augmentation significative des mesures DI pour toutes les concentrations d'exposition aux neurotoxines (F(1 ,8)=83.43, p=0.0001, R2=0.0416).
De plus, une interaction significative a indiqué que l'augmentation du DI provoquée par l'utilisation du dissolvant de particules devenait plus forte à des concentrations plus élevées (F(1,881,15,05)=59,97, p=0,0001, R{ {8}}.0094 ; figure 4B, C). Nous avons également imagé les mêmes lames de cellules par microscopie à fluorescence et évalué les effets de l'élimination des petites particules sur les mesures DI obtenues à partir de micrographies à fluorescence. Bien que l'élimination des petites particules fournisse des valeurs DI qui sont théoriquement plus précises, ces valeurs ne diffèrent en moyenne pas significativement de celles obtenues sans l'utilisation du plug-in d'élimination des particules lorsqu'elles sont mesurées à l'aide de micrographies à fluorescence (F(1,8)=2. 613, p=0.1446, R2=0.0013 ; figure 4D).

Automatisation des mesures DI à partir de micrographies à fluorescence

L’exécution des mesures DI à l’aide de la méthode traditionnelle nécessite un traitement d’image fastidieux et long, l’utilisation de l’outil à main levée pour supprimer numériquement les corps cellulaires individuels et la mesure des zones de neurites fragmentées et totales des neurites de chaque image. Ainsi, nous avons cherché à améliorer l’efficacité de la méthode en écrivant une macro qui automatise entièrement les analyses DI. Pour automatiser l'élimination du soma, la macro, intitulée ANDI, exécute la binarisation des images de noyaux cellulaires, étiquetées via le colorant nucléaire DAPI, suivie d'une modification de l'image binarisée de telle sorte que les régions nucléaires seuillées soient agrandies pour englober toute la région du soma. De telles images avec des noyaux binarisés et agrandis sont ensuite soustraites des micrographies à fluorescence correspondantes de neurones immunomarqués pour la tubuline b III, générant ainsi une image présentant exclusivement des neurites (Fig. 5A, B).

Pour ajuster les tailles nucléaires variables causées par le retrait ou la fragmentation nucléaire associée à la neurodégénérescence, les images binarisées des noyaux sont agrandies via une combinaison de dilatations et d'érosions qui combinent des fragments nucléaires et élargissent les régions binarisées pour occuper une zone plus grande que les somas des cellules LUHMES différenciées. . Les images contenant exclusivement des neurites sont ensuite binarisées et soumises à une analyse DI via une série de fonctions automatisées (Fig. 5C, D). Pour évaluer la précision des macro-opérations associées à la suppression du soma des images, nous avons comparé les scores DI obtenus suite à la suppression manuelle des corps cellulaires des micrographies à fluorescence à l'aide de l'outil à main levée d'ImageJ (comme décrit précédemment sur la figure 4D) aux scores DI. généré à partir d'analyses d'images identiques après l'élimination automatisée du corps cellulaire à l'aide des opérations d'élimination du soma présentées dans la macro ANDI. Nos analyses ont révélé que les scores DI calculés à l'aide de l'élimination automatisée du corps cellulaire étaient corrélés de manière presque identique aux mesures DI obtenues à partir d'images soumises à l'élimination manuelle du soma (r(34)=0,980, p, 0,0001 ; Fig. 5E).

Pour augmenter la précision des analyses, nous avons incorporé plusieurs des ajustements décrits précédemment qui améliorent les mesures DI dans ANDI. La macro propose des opérations d'amélioration du contraste, l'utilisation du plugin Particle Remover pour supprimer la matière non neurite des images de neurites et la matière non nucléaire des images de noyaux, et la détection de fragments de neurites en utilisant des paramètres de taille de 5 à 10,000 pour le plugin Analyser les particules.

Nous avons émis l'hypothèse que, collectivement, l'utilisation de la microscopie à fluorescence, des opérations d'amélioration du contraste, l'élimination de petits objets avec le dissolvant de particules et des paramètres optimisés pour la détection des particules contribueraient à des mesures plus précises de la dégénérescence des neurites. Pour tester cette hypothèse, les images en contraste de phase de cellules LUHMES exposées à diverses concentrations de 6-OHDA, générées comme décrit dans la figure 2, ont été analysées par notation aveugle et subjective en utilisant une plage de valeurs comprise entre 0. 0 et 1.0, avec des valeurs représentant la proportion apparente de zone de neurite fragmentée. Nous avons ensuite évalué la corrélation entre les scores subjectifs et les mesures DI obtenues via la méthode traditionnelle, ainsi que la corrélation entre les scores subjectifs et les mesures DI obtenues à l'aide de la macro ANDI.

Alors que les mesures DI obtenues à l'aide de la méthode traditionnelle étaient corrélées aux scores subjectifs (r {{0}}.7850, p,0.0001 ; Fig. 5F), la macro ANDI a donné des mesures qui étaient beaucoup plus fortement corrélées aux évaluations subjectives (r 2=0,978, p, 0,0001 ; Fig. 5G). Des comparaisons statistiques directes ont révélé que les scores obtenus via la macro ANDI étaient significativement plus corrélés aux évaluations subjectives que les scores obtenus via la méthode traditionnelle (z=6,626, p, 0,0001 ; Fig. 5F, G). Des analyses plus approfondies ont révélé que la macro facilite la réalisation des mesures DI avec une amélioration robuste et significative de l'efficacité du temps. Les analyses DI effectuées à l'aide de ANDI Macro ont nécessité un temps moyen de 12,75 s par image analysée, contre un temps moyen de 5,27 min par image analysée via la méthode traditionnelle [Friedman x2 (1)=9, p {{22} }.0027]. Dans l’ensemble, ces résultats indiquent que l’ANDI permet une génération rapide de mesures DI qui, par rapport aux scores obtenus via la méthode traditionnelle, se rapprochent davantage de la dégénérescence perçue par les enquêteurs à partir de l’analyse qualitative des images de neurites.

Après avoir déterminé la précision et l'efficacité de la macro ANDI pour mesurer la dégénérescence des neurites dans des cellules LUHMES différenciées exposées à 6-OHDA, nous avons évalué l'adéquation de la macro pour des expériences impliquant d'autres modèles de culture cellulaire. Une étude pilote a d'abord été menée pour évaluer l'exactitude de l'ANDI dans la réalisation de mesures DI à l'aide de micrographies de cultures sympathiques primaires immunomarquées pour la tubuline b III et le DAPI. Il est toutefois intéressant de noter que les corps cellulaires des neurones sympathiques sont plus grands que ceux des cellules LUHMES différenciées et que les opérations dans ANDI liées à l'élimination automatisée du soma n'ont donc pas supprimé la totalité du soma (données non présentées).

Pour surmonter ce problème, nous avons révisé ANDI pour proposer une boîte de dialogue permettant aux utilisateurs de choisir la taille de l'élimination du soma en contrôlant le nombre de fois que les micrographies binarisées des noyaux sont dilatées. Cette version d'ANDI, version 1.1, a ensuite été utilisée pour effectuer des mesures DI à partir de micrographies représentant des neurones sympathiques sains traités avec un véhicule ou des neurones sympathiques dégénératifs exposés au peroxyde d'hydrogène. Les images de neurones exposés au peroxyde d'hydrogène ont donné des scores DI significativement plus élevés par rapport aux images de neurones traités avec un véhicule (F(1,3)=71.2, p=0.0035, R2=0 .9301 ; figures 6A, C). De plus, nous avons comparé ces scores DI obtenus à l'aide d'ANDI aux mesures DI obtenues à partir du même ensemble d'images après suppression manuelle des corps cellulaires des micrographies à fluorescence à l'aide de l'outil à main levée d'ImageJ. Il n'y avait pas de différence significative dans les scores DI calculés après l'élimination manuelle du soma par rapport aux scores obtenus avec ANDI (F (1,3)=0.1082, p=0.7639, R2=0. 0000 ; figures 6A à C). Des tests post-hoc ont également confirmé que les scores DI obtenus avec ANDI n'étaient pas significativement différents à la fois dans le cas de neurones non traités (p=0,0972) et dans le cas de neurones exposés au peroxyde d'hydrogène (p=0. 9986).

De plus, les scores DI produits à partir de l'ANDI étaient en corrélation presque identique avec les scores DI obtenus après le retrait manuel des corps cellulaires des micrographies correspondantes (r (34)=0.991, p, 0.0001). Ces données démontrent que l'ANDI convient à la mesure de la dégénérescence des neurites dans des cultures de neurones primaires, avec des opérations d'élimination du soma que l'utilisateur peut personnaliser pour correspondre à différents types de neurones. De plus, la détection de fragments de neurites dans des cultures exposées au peroxyde d'hydrogène démontre l'applicabilité de la macro pour une utilisation dans des expériences impliquant une dégénérescence des neurites induite par des sources autres que 6-OHDA. Pour vérifier davantage l'utilisation de l'ANDI dans la détection de la dégénérescence des neurites associée à diverses causes, nous avons également utilisé la macro pour mesurer la dégénérescence des neurites sur des micrographies de cultures sympathiques saines ou de cultures soumises au retrait du NGF. Comme prévu, les images de cultures soumises au retrait du NGF ont donné des valeurs DI significativement plus élevées par rapport aux images de cultures saines (F(1,2)= 287, p= 0,0035, R2=0. 958 ; figure 6D, E). Collectivement, ces résultats démontrent que l'ANDI peut être utilisé pour détecter la dégénérescence des neurites associée à divers contextes biologiques.

Étant donné que la coloration du TH est couramment utilisée pour visualiser les neurones catécholaminergiques, nous avons également évalué l’adéquation des micrographies illustrant la coloration du TH pour mesurer la dégénérescence des neurites à l’aide de l’ANDI. Des cultures de neurones sympathiques sains traités avec une solution véhicule ou de neurones sympathiques dégénératifs exposés au peroxyde d'hydrogène ont été fixées et soumises à un marquage par immunofluorescence pour la tubuline TH et b III, ainsi qu'à une contre-coloration pour le DAPI. Des images de neurites illustrant la coloration de la tubuline TH ou b III, ainsi que des images correspondantes de noyaux présentant un marquage DAPI, ont ensuite été capturées dans des champs de vision similaires. ANDI a été exécuté et les images présentant une coloration TH ou une coloration b III-tubuline ont été sélectionnées comme images de neurites. Nos analyses ont révélé que les scores DI obtenus à l'aide d'images de coloration TH étaient très fortement corrélés aux scores obtenus à partir d'images de coloration à la tubuline b III (r (28)=0,962, p, 0,0001 ; Fig .6F,G). Ces données indiquent que des mesures précises de DI peuvent être obtenues par ANDI en utilisant des procédures de coloration alternatives qui marquent l'intégralité des neurites, telles que l'immunomarquage du TH.

Pour démontrer l'utilité de la méthode améliorée pour effectuer des mesures DI dans une expérience scientifique, nous avons utilisé la nouvelle méthode pour évaluer le rôle de JNK dans la dégénérescence des neurites induite par le stress oxydatif dans les cellules mésencéphaliques humaines. Les cellules LUHMES différenciées ont été prétraitées pendant 1 heure avec l'inhibiteur JNK SP600125 ou une solution véhicule. Les cellules ont ensuite été traitées pendant 24 h avec 6- OHDA pour induire un stress oxydatif ou avec une solution véhicule. Les cellules fixées ont été soumises à un immunomarquage pour la coloration à la tubuline b III et au DAPI, et ANDI a été utilisé pour obtenir des mesures DI à partir de micrographies à fluorescence. Alors que les cultures dépourvues de prétraitement avec l'inhibiteur de JNK présentaient une dégénérescence des neurites après une exposition à l'6-OHDA, l'inhibition de la JNK a entraîné une réduction marquée et significative de la dégénérescence des neurites induite par l'6- OHDA (p= 0,0001 , d= 2.0209 ; figure 7). Ces résultats confirment le rôle clé de la signalisation JNK dans la dégénérescence des neurites induite par le stress oxydatif dans les cellules mésencéphaliques humaines et, surtout, démontrent l'utilité de notre nouvelle méthode pour générer des découvertes scientifiques en facilitant la mesure rapide et précise de la dégénérescence des neurites.

Discussion

La dégénérescence des neurites est associée à diverses conditions neuropathologiques, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dégradation des neurites restent incomplètement compris. Les méthodes facilitant une analyse précise et efficace de la dégénérescence des neurites sont essentielles à l’identification réussie de nouveaux facteurs régulant cet événement cellulaire important. Dans la présente étude, nous révélons plusieurs sources d’erreur associées à une méthode couramment utilisée pour quantifier la dégénérescence des neurites. Nous rapportons des données expérimentales prenant en charge les modifications procédurales qui peuvent être mises en œuvre pour réduire les erreurs d'analyse DI, et ces modifications sont incorporées dans une nouvelle macro ImageJ pour fournir un outil pour des analyses DI rapides, précises et objectives à l'aide de logiciels open source et gratuits. De plus, nous démontrons comment la méthode améliorée peut être appliquée pour mesurer la dégénérescence des neurites dans un modèle de culture cellulaire de la maladie de Parkinson, un trouble dans lequel la fragmentation axonale des neurones dopaminergiques est un événement précoce qui précède une éventuelle perte neuronale (Tagliaferro et Burke, 2016). .

Dans la présente étude, nous démontrons l'utilité de la macro ANDI pour mesurer la dégénérescence des neurites dans un modèle de culture cellulaire de MP constitué de cellules LUHMES différenciées exposées à 6-OHDA.

Nous rapportons des résultats expérimentaux soutenant les substrats optimaux sur lesquels les cultures doivent être établies, ainsi que démontrons la densité de placage la plus appropriée pour les analyses de dégénérescence des neurites. L’utilisation de ce système modèle pour étudier la dégénérescence des neurites présente plusieurs avantages. Les cellules développent des neurites bien en réseau et généralement d'une longueur de 0,500 mm, et les cultures sont sensibles à la neurodégénérescence induite par des modèles classiques de neurotoxines de la maladie de Parkinson tels que 6-OHDA, 1-méthyl{{4. }}ion phénylpyridinium (MPP1) et roténone (Lotharius et al., 2005 ; Zhang et al., 2014 ; Smirnova et al., 2016 ; Kraemer et al., 2021). De plus, l'origine humaine des cellules LUHMES augmente la traductibilité des résultats associés au modèle, et l'immortalisation conditionnelle facilite la génération et la propagation rapides des cultures (Scholz et al., 2011). Ainsi, couplées aux analyses automatisées réalisées à l’aide de l’ANDI, les cellules LUHMES peuvent être utilisées pour faire de nouvelles découvertes liées à la dégénérescence des neurites associée à la MP tout en facilitant un débit considérablement plus élevé par rapport aux analyses non automatisées réalisées avec des cultures neuronales primaires.

De nombreux groupes de recherche ont effectué des analyses DI à l'aide d'images à contraste de phase pour mieux comprendre les facteurs qui régulent la dégénérescence des neurites (Press et Milbrandt, 20{{10}}9 ; Kraemer et al., 2014. ; Di Stefano et al., 2015 ; Hill et al., 2018 ; Geisler et al., 2019). Nous rapportons ici un inconvénient important associé à cette méthode largement utilisée pour mesurer la dégénérescence des neurites : la binarisation des images à contraste de phase fait apparaître fragmentée une proportion importante de neurites intacts. Bien que le niveau de contraste pouvant être obtenu lors de la capture de micrographies varie en fonction du système de microscope dont disposent les enquêteurs, ce problème est omniprésent parmi divers groupes de recherche, car un DI de 0,2 est communément accepté comme seuil au-dessus duquel les cultures sont considérées comme dégénératives. axones, et la plupart des rapports scientifiques présentant des mesures de DI à partir de micrographies à contraste de phase ont rapporté des scores de DI pour les neurones sains compris entre 0,1 et 0,3 (Sasaki et al., 2009, 2016 ; Di Stefano et al., 2015 ; Hill et al., 2018 ; Loreto et coll., 2020). Nos analyses DI obtenues à partir de micrographies à fluorescence, ainsi que les scores subjectifs d'enquêteurs en aveugle, indiquent qu'une fragmentation des neurites de 10 à 20 % n'est pas courante dans les cultures de neurones saines. Au contraire, ces cultures ne présentent en moyenne qu’une fragmentation des neurites de 2,5 %. Ainsi, nos résultats soulignent la nécessité de méthodes améliorant la précision des analyses de dégénérescence des neurites en réduisant cette source courante et significative d’erreur de mesure.

Alors que la majorité des études impliquant des mesures DI ont utilisé des images à contraste de phase pour effectuer les analyses de dégénérescence des neurites, plusieurs groupes de recherche ont récemment effectué des mesures DI en utilisant des images de neurones immunomarqués pour les filaments du cytosquelette tels que le polypeptide du milieu des neurofilaments ou la b-b-tubuline (Wakatsuki et al., 2011 ; Li et al., 2017 ; Pease-Raissi et al., 2017 ; Hernandez et al., 2018 ; Sundaramoorthy et al., 2020). Cependant, la forme de microscopie la mieux adaptée aux mesures de dégénérescence des neurites reste floue, car des recherches ont été nécessaires pour comprendre si les changements dans la localisation de ces protéines cytosquelettiques au cours de la dégénérescence des neurites modélisent de manière appropriée les changements totaux dans la morphologie des neurites, ainsi que pour évaluer la degré auquel les mesures DI obtenues avec des micrographies à fluorescence sont en corrélation avec des mesures similaires obtenues à partir de micrographies à contraste de phase. Ici, nous démontrons que les micrographies à fluorescence illustrant la coloration de la tubuline b III représentent non seulement avec précision la fragmentation des neurites, mais facilitent également des mesures DI plus précises en raison de leur contraste supérieur et de leur sensibilité réduite à la fragmentation artificielle lors de la binarisation. Ainsi, nos résultats mettent en évidence l’utilité de l’utilisation de la coloration à la tubuline b III pour mesurer la dégénérescence des neurites.

Parmi les études publiées impliquant des analyses DI pour mesurer la dégénérescence des neurites, les paramètres de taille et de circularité rapportés utilisés pour détecter les fragments de neurites ont considérablement varié. Par exemple, une étude récente impliquant l'évaluation de la dégénérescence des neurites dans des neurones hippocampiques en culture a utilisé des paramètres de taille de 4 à 900 pixels (Li et al., 2017), tandis qu'une étude impliquant des neurones DRG en culture a utilisé des paramètres de détection de 0 à 10,000 pixels (Wakatsuki et al., 2011). Une raison potentielle de cette variation est que l'efficacité des paramètres de taille de l'analyse des particules dans la détection des fragments de neurites varie en fonction de la résolution de l'image, puisque les paramètres de taille pour la détection des particules sont associés aux unités de pixels. Malheureusement, la plupart des études publiées impliquant des analyses DI n'incluent pas de description de la résolution d'image utilisée pour les analyses. Ainsi, l’établissement de paramètres d’analyse standard via un protocole divulguant pleinement les détails importants tels que la résolution d’image recommandée était nécessaire. Ici, nous rapportons que les paramètres les plus couramment cités pour la détection de fragments de neurites, 20 à 10,000 pixels (Shin et al., 2012 ; Di Stefano et al., 2015 ; Sasaki et al., 2016 ; Loreto et al., 2020 ; Shin et Cho, 2020), de grandes proportions de fragments de neurones ne sont pas détectés. La réduction du critère de taille minimale pour la détection des fragments de neurites améliore la sensibilité de la détection des fragments, tout en augmentant simultanément le nombre d'artefacts d'image et de débris non neurites qui sont faussement détectés en tant que fragments de neurites. À la recherche de paramètres permettant d'équilibrer au mieux la sensibilité de détection et les taux de fausses positivité, nous avons identifié des paramètres d'analyse de 10 à 10,000 comme fournissant la détection la plus précise des fragments de neurites dans les images binarisées obtenues à partir de micrographies à contraste de phase, tandis que des paramètres de 5 à 10,000 facilitent la détection la plus précise des fragments de neurites dans les images binarisées obtenues à partir de micrographies à fluorescence. Bien que ces déterminations aient été effectuées en utilisant une résolution d'image de 1280 1024, ces paramètres devraient également permettre une détection précise des fragments de neurites dans les images capturées à d'autres résolutions présentant une taille verticale de 1 024 pixels, comme la résolution plein écran courante de {{ 27}}, puisque les neurones représentés dans de telles images auraient une taille de pixel similaire.

De nombreux groupes de recherche ont utilisé un critère de taille minimale lors de la configuration des paramètres d'analyse des particules afin d'éviter que de petits débris non neurites ne soient inclus dans les mesures de fragments de neurites (Shin et al., 2012 ; Cosker et al., 2013 ; Di Stefano et al., 2015 ; Sasaki et al., 2016 ; Li et al., 2017 ; Loreto et al., 2020 ; Shin et Cho, 2020 ; Sundaramoorthy et al., 2020). Cependant, de telles études ont inclus à tort de petites matières non fragmentées dans les mesures de la surface totale des neurites, puisque ces mesures sont obtenues en additionnant la surface de tous les pixels noirs de l'image. Ici, nous démontrons l’utilité du plugin Particle Remover pour supprimer les petits débris non fragmentés de l’image avant l’analyse DI. L'utilisation du plugin a considérablement augmenté la sensibilité des mesures de dégénérescence des neurites obtenues à partir d'images à contraste de phase. Ainsi, nos résultats mettent en évidence la valeur du plugin Particle Remover pour les enquêteurs effectuant des analyses DI à l’aide de micrographies à contraste de phase. Il est intéressant de noter que les micrographies à fluorescence présentaient moins de petits débris non neurites et qu’un critère de taille inférieur de cinq pixels pouvait donc être utilisé pour la détection des fragments. Bien que l'élimination des particules de débris non neurites de taille inférieure à cinq pixels n'ait pas affecté de manière significative les mesures DI obtenues à partir de micrographies à fluorescence, de telles opérations fournissent des valeurs théoriquement plus précises et ont donc été incluses dans ANDI.

Étant donné que les analyses DI doivent être effectuées à l'aide d'images représentant exclusivement des neurites, l'application de la méthode d'analyse a été principalement limitée à l'utilisation avec des systèmes de culture permettant l'élimination des corps cellulaires, tels que les cultures d'explants dans lesquelles les corps cellulaires peuvent être physiquement excisés (Catenaccio et al. , 2017 ; Shin et Cho, 2020) ou des cultures dans des dispositifs microfluidiques facilitant la ségrégation des compartiments soma et axonaux (Cosker et al., 2013 ; Pease-Raissi et al., 2017 ; Tan et al., 2018). Alternativement, il est possible d'effectuer des analyses DI avec des cultures dissociées grâce à un travail fastidieux et long associé à l'élimination numérique des corps cellulaires des micrographies (Kraemer et al., 2014). Dans la présente étude, nous révélons qu’ANDI permet d’effectuer des mesures DI à partir de micrographies présentant des cellules LUHMES dissociées et distribuées en mosaïque dans un système de culture 2D. Nos résultats démontrent également que ANDI facilite une diminution de 24-fois du temps nécessaire pour effectuer les analyses, et que les opérations dans ANDI liées à l'élimination du soma donnent des résultats d'analyse DI qui sont en corrélation à 98 % avec des analyses similaires effectuées après l'élimination manuelle du soma à l'aide de l'outil. outil à main levée d'ImageJ. Ainsi, la macro augmente considérablement l'efficacité des analyses en effectuant une élimination automatisée du soma via un processus qui ne sacrifie pas la précision, et de telles opérations élargissent la pertinence de la méthode pour analyser des cultures dissociées avec des corps cellulaires distribués en mosaïque.

En plus de faciliter l'élimination automatisée du corps cellulaire des images, ANDI propose plusieurs révisions de la méthode traditionnelle d'analyse DI, notamment l'utilisation de micrographies à fluorescence, des paramètres d'analyse de particules révisés et l'utilisation du dissolvant de particules pour éliminer les petits débris non neurites. à partir d'images. Nos résultats indiquent que ces optimisations produisent collectivement des valeurs DI qui se rapprochent davantage des valeurs obtenues par notation en aveugle et soumise. Ainsi, en plus de réduire considérablement le temps requis pour effectuer les analyses, ANDI facilite les mesures DI qui, par rapport à la méthode traditionnelle, reflètent plus précisément la dégénérescence des neurites que les enquêteurs auraient observée à partir de l'analyse qualitative des images.

Un inconvénient de la méthode traditionnelle pour effectuer des analyses DI est que de telles analyses nécessitent une formation à l'utilisation d'ImageJ afin que l'utilisateur se familiarise avec un ensemble fastidieux d'opérations ImageJ. De plus, pour effectuer les analyses efficacement, une formation supplémentaire est nécessaire pour que l'utilisateur puisse effectuer des analyses par lots ou écrire des scripts pour semi-automatiser l'exécution d'étapes particulières. En automatisant entièrement l'analyse, ANDI facilite les mesures DI en seulement quelques étapes liées au téléchargement et à l'exécution de la macro. Pour accroître la convivialité, la macro comprend du code pour fournir une interface permettant de sélectionner des répertoires contenant des images à analyser, ainsi que pour faciliter la sortie des images de résultats et des tableaux de données dans un répertoire choisi par l'utilisateur. De plus, le script contient de nombreuses fonctionnalités conçues pour éviter les inexactitudes de mesure ou les erreurs des utilisateurs, notamment l'effacement automatique des résultats ImageJ précédents ; suppression des informations sur l'échelle de l'image pour garantir que les mesures sont effectuées avec précision à l'aide d'unités de pixels ; configuration appropriée des paramètres de couleur ImageJ, des paramètres de mesure et des paramètres de l'analyseur de particules ; présentation d'un message d'erreur si les utilisateurs sélectionnent par erreur des répertoires contenant un nombre inégal d'images illustrant la coloration b III-tubuline et la coloration DAPI ; descriptions de journaux indiquant la progression de l'analyse ; et le codage pour éviter les bogues associés à la génération automatisée de fichiers .ini par Windows 10. Dans l'ensemble, ces fonctionnalités rendent les analyses DI plus conviviales, ce qui peut susciter l'intérêt pour les études liées à la dégénérescence des neurites.

Pour démontrer son utilité dans une expérience, nous avons utilisé ANDI pour évaluer les contributions de JNK à la dégénérescence des neurites dans des cultures de cellules LUHMES exposées à 6-OHDA. JNK est une kinase activée par le stress qui a été rapportée comme étant la clé de la dégénérescence des neurites dans les neurones périphériques d'origine non primate (Shin et al., 2012), mais des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre le rôle de la kinase dans la dégénérescence des neurites dans les cellules humaines mésencéphaliques. . Ici, nous démontrons que l’inhibition de JNK protège de manière significative les cellules mésencéphaliques humaines de la dégénérescence des neurites associée au stress oxydatif. De tels résultats révèlent non seulement un rôle important de JNK dans la dégénérescence des neurites associée à un modèle de maladie humaine, mais illustrent également l'utilité de l'ANDI pour effectuer une analyse d'images automatisée et objective afin de réaliser de nouvelles découvertes scientifiques.

Alors que l'ANDI a été initialement conçu pour faciliter une mesure rapide et précise de la dégénérescence des neurites dans des cultures de cellules LUHMES différenciées exposées à l'6-OHDA, nos résultats indiquent également que la macro peut être utilisée pour détecter la dégénérescence des neurites induite par d'autres causes, telles que exposition au peroxyde d’hydrogène ou sevrage des neurotrophines. De plus, la version 1.1 de la macro comporte une boîte de dialogue permettant aux enquêteurs de personnaliser les opérations de suppression du soma pour des neurones de tailles spécifiques. Nos données confirment également que des méthodes de coloration autres que l'immunomarquage de la tubuline b III peuvent être utilisées pour une mesure précise de la dégénérescence des neurites. Bien que nous recommandions l’utilisation d’études pilotes pour vérifier l’exactitude des mesures DI lors de l’utilisation d’ANDI avec des types de cellules ou des méthodes de coloration qui n’ont pas encore été testées, ces résultats confirment que la macro est un outil généralement polyvalent pour mesurer la dégénérescence des neurites dans les neurones en culture. Étant donné que l’ANDI n’a pas été optimisé pour mesurer la dégénérescence des neurites dans les tissus, nous recommandons actuellement son utilisation uniquement pour analyser la dégénérescence des neurites associée aux cellules en culture. Cependant, le code de l'ANDI est accessible au public et peut donc également être utile aux chercheurs souhaitant modifier le script pour l'adapter à des études in vivo ou à d'autres applications.

En conclusion, cet article présente des données révélant des sources d’erreur courantes associées à une méthode largement utilisée pour quantifier la dégénérescence des neurites. Des approches expérimentales ont été utilisées pour améliorer la méthode, et ces améliorations ont été incorporées dans une macro ImageJ gratuite et open source qui peut être utilisée pour effectuer une analyse rapide, précise et objective des micrographies à fluorescence pour la dégénérescence des neurites. Nos résultats révèlent l’efficacité de l’ANDI pour quantifier la dégénérescence des neurites dans des micrographies illustrant un modèle de culture cellulaire de la MP, et fournissent la preuve du principe selon lequel la macro peut détecter la dégénérescence des neurites associée à d’autres contextes biologiques. La macro conviviale réduira le temps nécessaire aux enquêteurs pour apprendre à quantifier la fragmentation des neurites tout en augmentant le débit et la précision des études évaluant les facteurs sous-jacents à la dégénérescence des neurites. La macro ANDI est disponible à l'URL suivante : https:// github.com/kraemerb/kraemerlab.

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