Quantification de la dégénérescence des neurites avec une précision et une efficacité améliorées dans un modèle in vitro de la maladie de Parkinson, partie 1

Abstrait

La dégénérescence des neurites est associée aux premiers stades de troubles neurodégénératifs tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson (MP) et la sclérose latérale amyotrophique. Une méthode couramment utilisée pour analyser la dégénérescence des neurites implique le calcul d’un indice de dégénérescence (DI) suite à l’utilisation de l’outil Analyser les particules d’ImageJ pour détecter des fragments de neurites dans des micrographies de cellules en culture. Cependant, les analyses DI sont sujettes à plusieurs types d’erreurs de mesure, peuvent prendre du temps à réaliser et sont limitées dans leur application.

La neurodégénérescence fait référence aux changements qui se produisent dans ou autour des neurones, qui peuvent affecter la fonction cognitive humaine, l'intelligence, les émotions, le comportement, etc. De nombreuses personnes pensent que la neurodégénérescence est étroitement liée à la détérioration de la mémoire, mais ce n'est peut-être pas le cas.

Premièrement, la neurodégénérescence ne signifie pas nécessairement que la mémoire diminue avec l’âge. Certaines personnes peuvent conserver une bonne mémoire et même comprendre la droiture. En effet, la mémoire d'une personne est affectée par une combinaison de facteurs tels que l'exercice, l'alimentation et le mode de vie.

Deuxièmement, le cerveau humain peut rétablir de nouvelles connexions neuronales et former de nouveaux souvenirs, ce que l’on appelle la plasticité. Quel que soit l’âge, le cerveau apprend constamment et forme de nouveaux souvenirs. La neurodégénérescence est donc simplement un changement naturel dans le cerveau et ne signifie pas nécessairement une détérioration de la mémoire.

Enfin, maintenir une attitude optimiste peut également améliorer la mémoire d’une personne. L’inquiétude et le stress peuvent avoir des effets néfastes sur le cerveau, entraînant une perte de mémoire. Une attitude positive peut favoriser la santé du cerveau et améliorer la mémoire et les capacités cognitives.

En résumé, la neurodégénérescence n’entraîne pas nécessairement une perte de mémoire, et une attitude optimiste face à la vie peut nous aider à maintenir une bonne mémoire et des capacités cognitives. Par conséquent, nous devons maintenir une attitude optimiste et renforcer la gestion de l’exercice, de l’alimentation et du mode de vie pour maintenir la santé cérébrale et la mémoire. On voit que nous devons améliorer notre mémoire. Le Cistanche peut améliorer considérablement la mémoire, car le Cistanche peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme l'augmentation du niveau d'acétylcholine et des facteurs de croissance. Ces substances sont très importantes pour la mémoire et l’apprentissage. En outre, la viande peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutrition et d'énergie, améliorant ainsi la vitalité et l'endurance du cerveau.

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Nous décrivons ici une méthode améliorée pour effectuer des analyses DI. La précision des mesures a été améliorée grâce à la modification des critères de sélection pour détecter les fragments de neurites, à la suppression des artefacts d'image et des matériaux non neurites des images et à l'optimisation du contraste des images. De telles améliorations ont été implémentées dans une macro ImageJ qui permet une analyse DI rapide et entièrement automatisée de plusieurs images. La macro présente des opérations d'élimination automatisée des corps cellulaires des micrographies, élargissant ainsi l'application des analyses DI à des expériences impliquant des cultures dissociées.

Nous présentons des résultats expérimentaux démontrant que, par rapport à la méthode conventionnelle, la méthode d’analyse améliorée donne des mesures avec une précision accrue et nécessite beaucoup moins de temps.

En outre, nous démontrons l’utilité de la méthode pour étudier la dégénérescence des neurites dans un modèle de culture cellulaire de la maladie de Parkinson en menant une expérience révélant les effets de la kinase N-terminale c-Jun (JNK) sur la dégénérescence des neurites induite par le stress oxydatif dans les cellules mésencéphaliques humaines. Cette méthode d’analyse améliorée peut être utilisée pour obtenir de nouvelles informations sur les facteurs sous-jacents à la dégénérescence des neurites et à la progression des troubles neurodégénératifs.

Mots clés:

Dégénérescence axonale ; indice de dégénérescence; dégénérescence des neurites; neurodégénérescence; stress oxydatif ; La maladie de Parkinson.

Déclaration d'importance

La dégénérescence des neurites est un événement cellulaire associé aux premiers stades de plusieurs types de troubles neurodégénératifs. Les facteurs moléculaires qui régulent la dégénérescence des neurites restent mal compris et les méthodes existantes pour étudier la dégénérescence des neurites ont une application et une efficacité limitées. Ici, nous identifions des modifications apportées à une procédure largement utilisée pour analyser la dégénérescence des neurites qui réduit les erreurs de mesure.

De telles améliorations méthodologiques ont été incorporées dans une macro ImageJ, facilitant ainsi une analyse rapide et entièrement automatisée de la dégénérescence des neurites à l’aide de grands ensembles de micrographies. À l’aide d’un modèle de culture cellulaire de la maladie de Parkinson (MP), nous démontrons que la macro facilite des mesures plus précises et plus efficaces de la dégénérescence des neurites tout en élargissant l’adéquation de la méthode d’analyse aux expériences impliquant des cultures dissociées.

Introduction

La dégénérescence des neurites est un processus cellulaire dans lequel les axones ou les dendrites subissent un dysfonctionnement progressif et des changements morphologiques, entraînant une perte de l'intégrité des neurites. La dégénérescence des neurites est un processus conservé au cours de l'évolution qui est essentiel à l'établissement approprié des réseaux neuronaux au cours du développement du système nerveux central (Neukomm et Freeman, 2014).

Cependant, le processus est également déclenché en réponse à diverses formes de blessures telles que des dommages mécaniques ou l'exposition à des médicaments utilisés pour la chimiothérapie (Salvadores et al., 2017). En outre, la dégénérescence des neurites est associée à la progression de divers troubles neurodégénératifs liés à l'âge, notamment la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et la sclérose latérale amyotrophique.

Il est intéressant de noter que pour tous ces troubles neurodégénératifs, de plus en plus de preuves suggèrent que la dégénérescence des neurites est un événement clé à un stade précoce qui précède la mort neuronale ou l'apparition de symptômes cliniques (Serrano-Pozo et al., 2011 ; Adalbert et Coleman, 2013 ; Marangoni et al. ., 2014 ; Suzuki et coll., 2020). Ainsi, les études explorant les facteurs qui régulent ce processus cellulaire pourraient révéler de nouvelles cibles pour traiter diverses maladies neurodégénératives.

L'étude de la dégénérescence des neurites est particulièrement importante pour comprendre la MP, une maladie caractérisée par l'accumulation d'agrégats protéiques contenant de l'a-synucléine, la perte progressive des neurones dopaminergiques dans la substance noire pars compacta (SNpc) et le développement d'une variété de symptômes moteurs et cognitifs. (Aarsland et coll., 2017).

Les preuves issues d'études post-mortem et d'imagerie humaine indiquent que les agrégats d'a-synucléine sont plus abondants dans les fibres neuronales que dans les corps cellulaires, et que la dégradation des axones dopaminergiques se produit dans une plus grande mesure que la perte de neurones dopaminergiques dans le SNpc au cours de la période menant à l'apparition des symptômes. (Tagliaferro et Burke, 2016).

Bien que les interactions moléculaires qui contribuent à la détérioration progressive des neurites dopaminergiques restent incomplètement comprises, des preuves récentes indiquent que la dégénérescence des neurites peut être médiée par des événements indépendants des cascades de signalisation sous-jacentes à la mort neuronale (Fukui, 2016 ; Geden et Deshmukh, 2016). Ainsi, les études qui évaluent directement les fondements physiologiques de la dégénérescence des neurites sont essentielles au développement de thérapies qui entravent la progression précoce de la MP.

En réponse à la preuve du rôle central de la dégénérescence des neurites dans la progression des troubles neurodégénératifs, diverses méthodes ont été développées pour mesurer la dégénérescence des neurites à l'aide de micrographies de neurones en culture. Par exemple, plusieurs méthodes différentes ont été établies pour mesurer la dégénérescence des neurites à l'aide d'un logiciel permettant de détecter une diminution du nombre ou de la longueur des neurites (Ofengeim et al., 2012 ; Johnstone et al., 2018).

Cependant, étant donné que de telles méthodes n'évaluent pas directement la fragmentation des neurites, l'interprétation des résultats visant à déterminer l'impact d'une variable sur la dégénérescence des neurites peut être confondue par les effets potentiels de la variable sur la croissance des neurites. Certains groupes de recherche ont également mesuré la dégénérescence des neurites en notant subjectivement les images des neurites en fonction des caractéristiques morphologiques et du degré de fragmentation apparente (Zhai et al., 2003 ; Nakamura et al., 2016 ; Krishtal et al., 2017). Cependant, cette méthode alternative prend du temps et peut introduire une erreur de l’enquêteur.

Une méthode qui facilite la mesure objective et directe de la fragmentation des neurites implique l’utilisation de l’algorithme Analyser les particules d’ImageJ pour mesurer la surface des fragments de neurites dans des micrographies de cellules en culture. Les mesures sont utilisées pour calculer un indice de dégénérescence (DI), une échelle comprise entre {{0}}.0 et 1,0 reflétant le degré de dégénérescence des neurites (Sasaki et al., 2009).

Bien que les analyses DI puissent être utilisées pour détecter différents degrés de fragmentation des neurites, la précision des mesures est généralement limitée par plusieurs sources d'erreur, et l'application de la méthode a été principalement limitée aux cultures d'explants ou aux cellules cultivées dans des dispositifs microfluidiques compartimentés. De plus, les analyses DI prennent du temps lorsqu’elles sont extrapolées à de grands ensembles d’images. Ainsi, nous avons cherché à surmonter ces limitations en modifiant la procédure d’analyse DI pour faciliter une plus grande précision et efficacité, tout en élargissant son applicabilité.

Dans la présente étude, nous identifions plusieurs sources d’erreur communément associées aux analyses DI et rapportons des révisions méthodologiques qui réduisent les diverses formes d’erreur. Nous intégrons les améliorations procédurales dans une macro ImageJ appelée Index de dégénérescence des neurites automatisés (ANDI) pour automatiser complètement les analyses DI à partir de grands ensembles d'images. Le fonctionnement de la macro ANDI nécessite uniquement des logiciels et des fichiers open source et disponibles gratuitement. Les mesures obtenues à l’aide d’ANDI bénéficient d’une précision accrue tout en réduisant considérablement le temps nécessaire pour effectuer les analyses.

De plus, nous démontrons comment la nouvelle méthode d’analyse peut être appliquée pour effectuer une mesure précise et rapide de la dégénérescence des neurites dans un modèle de culture cellulaire de MP impliquant des cellules dissociées cultivées sans compartimentation. Collectivement, ces améliorations méthodologiques pourraient conduire à de nouvelles connaissances sur les facteurs sous-jacents à un processus cellulaire important associé à la neurodégénérescence.

Matériels et méthodes

Culture de cellules

Des cultures de cellules mésencéphaliques humaines de Lund (LUHMES) ont été établies dans des lames de chambre à huit puits Lab Tek II recouvertes de poly-L-ornithine (PLO) et de fibronectine, de poly-D-lysine (PDL) et de laminine, les quatre substrats, ou non. substrats, comme indiqué. Pour les recouvrir de PLO et de fibronectine, les lames ont été incubées pendant une nuit à température ambiante avec une solution contenant 200 mg/ml de PLO (Sigma-Aldrich, catalogue n° P3655).

Après lavages à l'eau stérile (Avantor), les lames ont été incubées avec 2 mg/ml de fibronectine (Sigma-Aldrich, catalogue n° F0895) pendant 3 h à 37 degrés. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS stérile (Corning Life Sciences, catalogue n° 21-040-CV) et laissées sécher à l'air. Pour les recouvrir de PDL et de laminine, les lames ont été incubées à température ambiante avec une solution contenant 100 ng/ml de PDL (Sigma-Aldrich, catalogue n° P7280) et 10 mg/ml de laminine (Corning, catalogue n° 354232).

Après une nuit d'incubation, les lames ont été lavées avec du PBS stérile et laissées sécher à l'air. Pour revêtir les quatre substrats, les procédures susmentionnées ont été effectuées séquentiellement. Les cellules LUHMES (ATCC, RRID : CVCL_B056) ont été étalées dans des lames de chambre enduites aux densités indiquées dans un milieu de différenciation constitué de DMEM/F12 (Invitrogen, catalogue n° 11330057) complété par 2 mM de glutamine (VWR), Supplément 1 % (v/v) N-2, 1 mg/ml de tétracycline (Sigma-Aldrich, catalogue n°87128-25G), 1 mM N6,29-Odibutyryladénosine AMPc (db-cAMP ; Enzo Life Sciences, catalogue #BML-CN125-0100) et 2 ng/ml de facteur neurotrophique dérivé de la lignée de cellules gliales (GDNF ; R&D Systems, catalogue #212-GD-010).

Sauf indication contraire, toutes les cultures ont été étalées à une densité de 115 000 cellules par puits. Un remplacement de média de 50 % du volume a été effectué toutes les 48 heures jusqu'au traitement. Pour éviter la dérive génétique, des stocks de cellules ayant été soumis à six passages ou moins ont été utilisés pour toutes les expériences.

Des expériences impliquant des cultures primaires de neurones sympathiques ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux de l'université Eastern Kentucky ou de l'université de Virginie. Les ganglions cervicaux supérieurs ont été disséqués chez des souris C56Bl/6 du jour postnatal 0-6, incubés à 37 degrés dans un tampon de dissociation enzymatique et lavés avec un milieu de croissance pour éliminer les enzymes protéolytiques et triturés.

Les suspensions cellulaires ont été étalées à une densité de 7000 cellules par puits dans des lames de chambre à huit puits Lab Tek II. Les médias ont été changés au jour in vitro (DIV) 1, suivi d'un remplacement des médias tous les deux jours. Les milieux ont été complétés avec de la cytosine arabinofuranoside (Ara-C, Millipore-Sigma) sur DIV1 – DIV3 pour empêcher la croissance de cellules non neuronales, suivi de l'élimination de l'Ara-C du milieu pendant au moins 24 h avant le traitement, comme indiqué. Pour les expériences menées à l'Université Eastern Kentucky impliquant un traitement au peroxyde d'hydrogène, les lames de chambre ont été recouvertes de 200 mg/ml de PLO (Sigma-Aldrich, catalogue n° P3655), 2 mg/ml de fibronectine, 100 ng/ml de PDL (Sigma-Aldrich, catalogue n° P3655). # P7280) et 10 mg / ml de laminine (Corning, catalogue # 354232) avant utilisation, et la dissociation a été réalisée via une incubation de 30- minutes dans un tampon constitué de DMEM (ThermoFisher, catalogue # 11960- 044) contenant 0,025 % trypsine (Corning Life Sciences, catalogue #25-053-CI) et 0,3 % de collagénase (Worthington Biochemical, catalogue #LS004176).

Le milieu de croissance pour de telles expériences était constitué de DMEM complété par 10 % de sérum bovin fœtal (Invitrogen, catalogue n° 26140-079), 2 mM de L-glutamine (Corning, catalogue n° 25-005-CI) et 40 ng/ml. facteur de croissance nerveuse (Fisher Scientific, catalogue n° 13-257-019 ); 5 mM d'Ara-C (Sigma-Aldrich) ont été utilisés pour l'élimination des cellules non neuronales.

Pour les expériences menées à l'Université de Virginie impliquant le retrait du NGF, les cellules ont été étalées sur des lames de chambre recouvertes de 100 ng/ml de PDL (Millipore Sigma) et de 10 mg/ml de laminine (Invitrogen), et la dissociation a été réalisée via 20-min. incubation dans un tampon constitué de DMEM/F12 contenant de la BSA (10 mg/ml, Sigma-Aldrich), de la collagénase de type 2 (4 mg/ml, Worthington Biochemical), de la désoxyribonucléase 1 (Millipore Sigma) et de la hyaluronidase (Sigma-Aldrich). Le milieu de croissance pour de telles expériences consistait en DMEM additionné de 10 % de sérum de veau fœtal (Invitrogen), de 1 U/ml de pénicilline/streptomycine (Invitrogen) et de 45 ng/ml de NGF (purifié à partir de glandes salivaires) ; 10 mM d'Ara-C ont été utilisés pour l'élimination des cellules non neuronales.

Traitements cellulaires

Les cellules LUHMES différenciées ont été exposées aux concentrations indiquées de {{0}}hydroxydopamine (6-OHDA ; Sigma-Aldrich, catalogue n° 162957) ou d'une solution véhicule au cours de leur cinquième jour dans le milieu de différenciation. Les stocks de 6- OHDA ont été préparés dans du PBS réfrigéré contenant 0,02 % d'ascorbate (Sigma-Aldrich, catalogue n° A5960), et les aliquotes ont été conservées dans des flacons protégés de la lumière sous gaz inerte à 80 degrés. Après 24 h de traitement, les cellules ont été fixées par incubation dans du PBS contenant 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant 25 min à température ambiante.

Pour déterminer le rôle de la kinase N-terminale c-Jun (JNK) dans la dégénérescence des neurites induite par le stress oxydatif, les cultures ont été prétraitées pendant 1 h avec 1 0 mM de SP600125 (Sigma-Aldrich, catalogue # S5567) ou une solution véhicule. avant le remplacement complet du support par un support contenant 7,5 mM 6-OHDA, 7,5 mM 6-OHDA et 10 mM SP600125, ou des solutions pour véhicules. Des stocks de SP600125 ont été préparés en dissolvant l'inhibiteur dans du diméthylsulfoxyde stérile (DMSO) et des aliquotes congelées ont été conservées dans des flacons protégés contre la lumière et remplis de gaz inerte à 20 degrés. Les traitements ont été effectués de telle sorte que les cellules ne soient pas exposées à plus de 0,1 % de DMSO.

Des cultures primaires de neurones sympathiques ont été traitées sur DIV5. Pour les expériences impliquant la dégénérescence des neurites induite par le peroxyde d'hydrogène, les cultures ont été exposées à 500 mM de peroxyde d'hydrogène (Sigma-Aldrich, catalogue #H1009-100ML) ou à une solution véhicule constituée d'eau stérile (Cytiva, catalogue #SH30529.02). pendant 24h.

Pour les expériences impliquant le retrait du NGF, les cultures SCG ont soit reçu un remplacement du milieu par un milieu de croissance, soit ont été soumises à une privation de NGF. Les cultures SCG devant être privées de NGF ont été rincées trois fois avec un milieu de croissance sans NGF, puis incubées dans un milieu de croissance sans NGF pendant 80 h sans changement de milieu. Après traitement, les cellules ont été fixées par incubation dans du PFA à 4% dans du PBS pendant 30 min, suivie de l'élimination du PFA par rinçage avec du PBS.

Microscopie à coloration et à fluorescence

Pour les expériences avec des cellules LUHMES, ainsi que pour les expériences impliquant des neurones sympathiques traités avec du peroxyde d'hydrogène, des lames de chambre à huit puits contenant des cellules fixées ont été perméabilisées avec du 0,1 % de Triton X-100 dans du PBS et bloquées pendant 1 h avec 10 % de sérum de chèvre normal dans du PBS contenant 0,1 % de Triton X-100. Les lames ont ensuite été incubées avec un anticorps primaire spécifique de la tubuline b I (Covance ; 1 : 1 000, RRID : AB_2313773) dans une solution de blocage à 4 degrés pendant la nuit. Ensuite, les lames ont été lavées avec du PBS, incubées avec un anticorps secondaire couplé à Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific ; 1 : 500, RRID : AB_142495) pendant 90 min à température ambiante et soumises à des lavages supplémentaires.

Pour les expériences impliquant la coloration à la tyrosine hydroxylase (TH), les lames ont été soumises à une incubation supplémentaire dans du PBS contenant 10 % de sérum de chèvre normal, 0,1 % de Triton X-100, un anticorps spécifique du TH (Sigma- Aldrich, 1:400, AB152) à 4 degrés pendant la nuit. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS, incubées avec un anticorps secondaire couplé à Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific ; 1 : 500, RRID : AB_1500889) et soumises à des lavages supplémentaires au PBS.

Une fois l'immunomarquage terminé pour la b III-tubuline ou TH, les lames ont été incubées avec 5 mg/ml de 49,69-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; catalogue n° D9542) dans du PBS pendant 5 min. Les lames ont ensuite été lavées avec du PBS et les lamelles ont été montées à l'aide du milieu de montage Fluoromount G (Southern Biotech, catalogue n° 0100-01).

Pour les expériences impliquant des neurones sympathiques soumis au retrait du NGF, les lames ont été bloquées pendant 1 h par incubation à température ambiante dans un tampon constitué de 5 % de sérum de chèvre normal (Life Technologies) et de 0.0005 % Triton X-100 dans du PBS, suivi d'une incubation dans une solution d'anticorps primaire contenant du Tuj1 anti-souris de souris (1 : 1 000, Covance) pendant la nuit à 4 degrés. Ensuite, les lames ont été rincées avec du PBS, incubées pendant 1 h dans des IgG de chèvre anti-souris Alexa Fluor 488 (1: 800, Invitrogen) et 0,1 mg/ml de Hoechst 33342 (Invitrogen) dans un tampon de blocage, soumises à des rinçages supplémentaires au PBS et laissées sécher. Les lames ont été montées avec Fluoromount-G (Southern Biotech, catalogue n° 0100-01) et conservées à température ambiante.

Les lames contenant des cellules LUHMES ont été visualisées avec un objectif 20 d'un système de microscope inversé Nikon Eclipse II Ti-U avec une source de lumière LED Lumencor Mira 4-Channel. Les images 1280 1024-pixels ont été capturées à l'aide d'un appareil photo CCD Nikon DSQi1Mc 5 MP et de NIS Elements 3.22.15 (Build 738). Sauf indication contraire, toutes les images à contraste de phase ont été capturées à l'aide de paramètres d'intensité lumineuse et de temps d'exposition qui ont produit une intensité d'arrière-plan moyenne de 165 images en 8- bits.

Pour réduire l'ombrage de l'arrière-plan ou d'autres incohérences, avant chaque séance de microscopie, une image d'un puits vide a été capturée et utilisée pour la correction de l'arrière-plan lors de l'imagerie cellulaire LUHMES. Les lames contenant des neurones sympathiques cultivés à l'Université Eastern Kentucky ou à l'Université de Virginie ont été imagées à l'aide d'un système de microscope Zeiss LSM 800 ou d'un système de microscope Zeiss LSM 980, respectivement. Les images ont été capturées avec un grossissement de 20 et une résolution de 1024 1024 à l'aide du logiciel Zen (Carl Zeiss Microscopy).

Analyse de la viabilité cellulaire

Des cultures cellulaires LUHMES différenciées ont été établies sur des lames de chambre à huit puits Lab Tek II recouvertes comme indiqué de divers substrats. Un changement de milieu de 50 % a été effectué toutes les 48 heures et les cellules ont été fixées avec 4 % de PFA dans du PBS le sixième jour de différenciation. Les lames contenant des cellules fixées ont été soumises à une coloration au DAPI et des images de coloration nucléaire ont été capturées avec un système de microscope inversé Nikon Eclipse II Ti-U et une caméra CCD Nikon DS-Fi 1 5 MP.

Les cellules ont été classées comme saines ou malsaines par un enquêteur en aveugle, sur la base de l'apparence des noyaux. Les cellules présentant une zone nucléaire réduite ou une fragmentation nucléaire ont été considérées comme malsaines. Le nombre de cellules saines par image a été noté pour au moins cinq champs de vision par condition dans chaque expérience.

Mesures DI

Les mesures DI traditionnelles ont été effectuées à l'aide d'un package Fiji Is Just ImageJ (FIJI) contenant ImageJ 1.52p via une méthode impliquant des paramètres largement cités pour l'analyse DI (Shin et al., 2012 ; Di Stefano et al., 2015 ; Sasaki et al., 2016 ; Loreto et al., 2020 ; Shin et Cho, 2020). Des images à huit bits de cellules LUHMES différenciées avec des faisceaux axonaux bien séparés ont été soumises à une binarisation à l'aide de l'algorithme de binarisation par défaut, avec des options binaires configurées pour produire une image avec des cellules noires au premier plan et un arrière-plan blanc.

L'outil de dessin à main levée a été utilisé pour tracer manuellement toutes les régions d'image comportant des corps cellulaires, et tous les pixels noirs ont été convertis en blancs dans les régions tracées. L'outil de mesure d'ImageJ a été appliqué pour mesurer la zone noire totale des images binarisées comportant exclusivement des neurites. L'outil Analyser les particules a ensuite été appliqué en utilisant un paramètre de taille de 20–10,000 pixels et un paramètre de circularité de 0,2 à 1,0 pour détecter les fragments de neurites. La surface additionnée de tous les fragments de neurites a ensuite été divisée par la zone noire totale pour calculer la DI de l'image.

Pour les expériences liées à l'optimisation des paramètres de taille pour l'identification des fragments de neurites, les critères de circularité de {{0}}.2–1.00 ont été utilisés pour toutes les mesures de particules. Le plugin Particle Remover (version 20{{10}}4/02/09), développé par Wayne Rasband, a été obtenu auprès de https:// imagej.nih.gov/. Lorsque cela est indiqué, l'application du plugin Particle Remover utilisant des paramètres de taille de 0 à 9 pixels et des paramètres de circularité de 0,0 à 1,0 a été réalisée pour supprimer les petits objets non neurites des images binarisées obtenues à partir de micrographies à contraste de phase.

De même, des paramètres de taille de {{0}} – 4 pixels et des paramètres de circularité de 0 – 1,0 ont été utilisés pour supprimer les petits objets des images binarisées obtenues à partir de micrographies à fluorescence représentant l'immunomarquage de la tubuline b III. Sauf indication contraire, avant l'analyse DI, toutes les images à contraste de phase ont été soumises à une amélioration du contraste en utilisant ImageJ pour appliquer une table de recherche (LUT) avec un minimum de 90 et un maximum de 205.

Mesure de la fragmentation artificielle

Les cultures contenant des cellules LUHMES saines ont été fixées avec 4% de PFA au sixième jour de différenciation et immunomarquées pour la b III-tubuline. À l'aide d'un objectif de 20, des micrographies à contraste de phase et des micrographies à fluorescence de 1280 1024- pixels, chacune représentant des champs de vision identiques, ont été capturées à partir de régions échantillonnées de manière aléatoire. Au total, dix séries d’images provenant de neuf cultures distinctes ont été capturées.

ImageJ a été utilisé pour générer des copies binarisées des micrographies originales à contraste de phase et à fluorescence, ainsi que des copies de micrographies à contraste de phase qui ont été binarisées après amélioration du contraste via l'application d'une LUT avec un minimum de 90 et un maximum de 205. Pour chaque ensemble d'images, un enquêteur en aveugle a identifié une petite région de 150 150- pixels de la micrographie à contraste de phase originale présentant exclusivement des neurites sains et intacts.

La taille et les coordonnées de la région ont ensuite été stockées dans le gestionnaire de régions d'intérêt (ROI) d'ImageJ et utilisées pour effectuer des mesures DI dans des régions analogues d'images binarisées du même ensemble d'images. Les mesures DI ont été effectuées à l'aide de la méthode traditionnelle comportant des paramètres de taille de fragment de 20 -10,000 pixels. Puisque toutes les régions mesurées contenaient exclusivement des neurones intacts, tous les fragments détectés étaient considérés comme des fragments artificiels.

Macro ANDI

La macro ANDI a été écrite en utilisant le langage ImageJ Macro. La macro comporte une série d'opérations qui permettent à l'utilisateur de sélectionner des chemins pour trois répertoires, un répertoire contenant des images de neurones immunomarqués pour un marqueur neuronal tel que la tubuline b III, un deuxième répertoire contenant des images correspondantes illustrant la coloration nucléaire et un troisième répertoire. désigné pour enregistrer les fichiers de résultats. Les zones de fragments et les zones totales de neurites des images dans les répertoires sélectionnés sont ensuite calculées via une série d'opérations ImageJ. En bref, une image représentant le marquage nucléaire est ouverte, soumise à une amélioration du contraste et binarisée. Le plugin de suppression de particules est utilisé pour supprimer les petits artefacts non nucléaires de l'image binarisée, et l'image binarisée est soumise à une série de dilatations et d'érosions.

Une image correspondante de cellules immunomarquées pour la tubuline b III (ou un autre marqueur neuronal) est ouverte et soumise à une amélioration de contraste. L'image binarisée représentant des noyaux cellulaires agrandis est ensuite soustraite de l'image présentant des cellules immunomarquées pour la tubuline b III, générant ainsi une image présentant exclusivement des neurites. L'image des neurites est ensuite binarisée et soumise à la suppression des particules entre 0 et 4 pixels. La zone du fragment Neurite est calculée en appliquant l'algorithme Analyser les particules pour mesurer les particules avec une circularité comprise entre 0,2 et 1.0 et une taille comprise entre 5 et 10,0000 pixels. La zone totale des neurites est calculée en appliquant l’outil Mesurer pour calculer la zone noire totale. Une image représentant la zone de neurites binarisée avec des fragments en surbrillance est enregistrée dans un répertoire désigné par l'utilisateur, avec des fichiers .csv rapportant la zone de neurites fragmentée et les mesures totales de la zone de neurites.

En plus des opérations mentionnées ci-dessus, plusieurs opérations supplémentaires sont incluses dans la macro pour faciliter l'utilisation et limiter les erreurs de l'utilisateur. Celles-ci incluent des fonctions qui suppriment les informations d'échelle des images et garantissent que les mesures sont obtenues en unités de pixels ; configurer les paramètres de couleur ImageJ et les options binaires pour une soustraction et une binarisation d'image appropriées ; vérifier que les répertoires sélectionnés pour les images de coloration b III-tubuline et de coloration DAPI contiennent un nombre égal d'images ; fermez les images précédemment utilisées pour améliorer le temps de traitement ; des résultats clairs des analyses précédentes avant la réalisation de nouvelles analyses ; et évitez les erreurs associées à la création de fichiers .ini par Windows 10.

Pour les expériences impliquant des analyses de neurones sympathiques, la macro ANDI a été révisée pour inclure une opération qui présente une boîte de dialogue permettant à l'utilisateur de contrôler le nombre de fois que les images binarisées des noyaux seront dilatées. La version d'ANDI comportant cette révision a été appelée ANDI v1.1. Changer la valeur dans la boîte de dialogue pour un nombre plus élevé augmente la taille de suppression du soma tandis que changer la valeur pour un nombre inférieur diminue la taille de suppression du soma. La valeur par défaut est 12, qui correspond au nombre de dilatations utilisées pour toutes les expériences impliquant des cellules LUHMES. Une valeur de 16 a été utilisée pour éliminer les plus grandes régions du corps cellulaire lors des analyses des neurones sympathiques.

La macro ANDI est open source et disponible gratuitement pour utilisation ou modification via l'URL suivante : https://github. com/kraemerb/kraemerlab. Le fonctionnement précis d'ANDI a été vérifié à l'aide de plusieurs ordinateurs personnels équipés du système d'exploitation Windows 10. Un ensemble d’images présentant des cultures cellulaires LUHMES présentant divers degrés de dégénérescence des neurites est également disponible à l’adresse Web susmentionnée et peut être utilisé pour étudier l’exécution précise de la macro par d’autres types d’ordinateurs. L'adresse Web donne également accès à un protocole décrivant comment utiliser la macro.

Estimations de temps

Pour évaluer le temps nécessaire pour effectuer manuellement des mesures DI, des micrographies à contraste de phase représentant des cellules LUHMES traitées avec une solution véhicule, 2,5 mM 6-OHDA, 5,0 mM 6-OHDA ou 7,5 mM de 6-OHDA ont été soumis à un score DI en utilisant des méthodes précédemment établies (Kraemer et al., 2014). Chaque image a été soumise à une amélioration du contraste et à une binarisation. L’outil à main levée d’ImageJ a ensuite été utilisé pour supprimer numériquement tous les corps cellulaires représentés des images binarisées. L'outil Analyser les particules a été utilisé pour mesurer des fragments avec une circularité comprise entre 0,2 et 1,0 et une taille comprise entre 20 et 10,000 pixels, et l'outil Mesurer a été utilisé pour déterminer la surface totale des neurites.

Les valeurs concernant la surface fragmentée des neurites et la surface totale des neurites ont été transférées vers une feuille de calcul dans Microsoft Excel, et une opération mathématique dans Excel a été utilisée pour calculer les scores DI. Après l'ouverture d'une image avec ImageJ, le temps nécessaire pour effectuer manuellement chacune de ces procédures a été mesuré. Les temps d'analyse moyens ont été calculés à partir de 36 images au total. Les images ont été obtenues à partir de neuf préparations de culture cellulaire indépendantes et les analyses ont été effectuées en utilisant une image par condition de traitement provenant de chaque préparation de culture cellulaire. Pour déterminer la vitesse des mesures DI effectuées à l'aide de la macro ANDI, les mêmes ensembles d'images ont été utilisés pour déterminer le temps nécessaire pour ouvrir la macro dans ImageJ, exécuter les opérations de macro, transférer les données vers une feuille de calcul Excel et calculer la DI.

Statistiques

Les comparaisons quantitatives sont présentées sous forme de diagrammes en boîtes et moustaches, où la ligne médiane représente la médiane, les boîtes s'étendent jusqu'aux 25e et 75e percentiles et les moustaches représentent les 5e et 95e percentiles. Les moyennes ont été comparées statistiquement dans GraphPad Prism 9.1.2 par une ANOVA à mesures répétées avec des comparaisons post-hoc utilisant une correction Sidák. La normalité des données quantitatives a été testée à l'aide du test Shapiro-Wilk dans IBM SPSS 26.

Lorsque l'hypothèse de normalité a été violée (Fig. 1C, 3D), des comparaisons de groupes ont été effectuées via le test non paramétrique de Friedman, le test de Dunn étant effectué pour des comparaisons post-hoc. Les analyses corrélationnelles sont représentées sous forme de nuages ​​de points et incluent les lignes de meilleur ajustement. De telles relations ont été analysées à l'aide des corrélations produit-moment de Pearson ou du r de Spearman lorsque l'hypothèse de normalité était violée. La normalité des résidus pour l'analyse corrélationnelle a été évaluée par inspection visuelle des tracés QQ correspondants.

Les coefficients de corrélation produit-moment de Pearson ont été comparés les uns aux autres à l'aide du test z asymptotique de Steiger (Steiger, 1980 ; Lee et Preacher, 2013). Aucune valeur aberrante n’a été exclue. La signification statistique a été acceptée à p 0,05. Les valeurs P sont arrondies à quatre décimales et rapportées dans tout le texte principal. Les tailles d'effet et les intervalles de confiance à 95 % sont également indiqués pour les analyses paramétriques, les tailles d'effet étant décrites dans le texte principal et les intervalles de confiance répertoriés dans le tableau 1.

Disponibilité des données

Des données supplémentaires sur le présent article seront partagées sur demande raisonnable.

Accessibilité du code

Le code/logiciel décrit dans l'article est disponible gratuitement en ligne sur https://github.com/kraemerb/kraemerlab. Le code est disponible sous forme de données étendues 1.

For more information:1950477648nn@gmail.com