Analyse protéomique quantitative des patients COVID-19 : la fétuine-A et la tétranectine comme modulateurs potentiels des réponses immunitaires innées

ABSTRAIT

Le traitement des cas graves de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est extrêmement important pour minimiser les décès et les dommages aux organes cibles. Ici, nous avons effectué une analyse protéomique d'échantillons de plasma provenant de patients COVID -19 légers, modérés et sévères. L'analyse a révélé des protéines exprimées de manière différentielle et différentes cibles thérapeutiques potentielles liées aux réponses immunitaires innées telles que la fétuine-A, la vitronectine (TN) et la paraoxonase-1 (PON1). De plus, les changements protéiques dans le plasma ont montré une dérégulation des cascades du complément et de la coagulation chez les patients COVID-19 par rapport aux témoins sains. En conclusion, nos données protéomiques suggèrent que la fétuine-A et la TN sont des cibles potentielles qui pourraient être utilisées pour le diagnostic ainsi que des signatures pour une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie COVID-19.

Les organes terminaux font référence aux tissus ou organes qui remplissent finalement des fonctions spécifiques dans le corps humain, tels que le foie, les reins et les poumons. Les dommages à ces organes peuvent entraîner diverses maladies majeures, telles que la maladie rénale chronique, la cirrhose du foie et la maladie pulmonaire obstructive chronique. L'immunité fait référence à la réponse immunitaire de l'organisme aux micro-organismes et tissus pathogènes étrangers. L'immunité du corps reste normale, ce qui peut prévenir l'apparition et la détérioration de maladies. Par conséquent, les dommages aux organes cibles sont étroitement liés à l'immunité, et ils interagissent pour affecter la fonction immunitaire du corps humain.

Les dommages aux organes cibles peuvent entraîner des dommages au nombre et à la qualité des cellules immunitaires dans le corps. Par exemple, les patients atteints d'une maladie du foie connaîtront une leucopénie, une fonction hépatique anormale et une synthèse d'anticorps réduite, ce qui les rendra plus sensibles à l'infection après la maladie ; une diminution de la fonction rénale entraînera une urémie. Syndrome, anémie, ostéoporose et autres maladies, ces facteurs affecteront également la fonction immunitaire du corps. D'autre part, la réponse immunitaire du corps peut également affecter les organes cibles, par exemple, une réponse immunitaire excessive peut entraîner une hépatite immunitaire ou une pneumonie anaphylactique. L'interaction des dommages aux organes cibles et du dysfonctionnement immunitaire rend le corps plus sensible aux maladies et raccourcit sa durée de vie.

Par conséquent, le maintien d'une fonction normale des organes cibles et d'une fonction immunitaire robuste est essentiel au maintien d'une bonne santé. Les gens devraient prévenir les dommages aux organes cibles grâce à un bon mode de vie, comme une alimentation saine, un exercice physique approprié et la relaxation, et maintenir une fonction immunitaire normale grâce à la prévention et au traitement actifs des maladies. On peut voir que nous devons faire attention à notre immunité. Cistanche peut améliorer l'immunité et l'effet est bon. Les polysaccharides contenus dans la viande peuvent réguler la réponse immunitaire du système immunitaire humain, améliorer la capacité de stress des cellules immunitaires et renforcer les cellules immunitaires. effet bactéricide.

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1. Introduction

Le syndrome respiratoire aigu sévère, coronavirus 2 (SARS-CoV-2), a causé la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) [1]. La maladie COVID-19 se caractérise par différents phénotypes cliniques allant d'asymptomatiques, légers et modérés à sévères ou extrêmement sévères, caractérisés par une pneumonie sévère et un risque élevé de décès dans la population âgée, en particulier chez les patients de plus de 70 ans [ 2,3]. Les vaccins ont été générés fin 2020 et la plupart des personnes dans le monde ont été vaccinées avec au moins 2 doses. Malgré la diminution du nombre de sujets infectés ainsi que les cas graves signalés, le problème est encore loin d'être résolu et la cause de l'évolution de la maladie vers un état grave reste inconnue. De plus, le SRAS-CoV-2, comme d'autres virus, change avec le temps, et de nouvelles variantes peuvent avoir une modification des propriétés d'origine telles que la propagation et la gravité de la maladie associée, et devenir moins (variante omicron) [4] ou plus (delta variante) [5] sévère. L'émergence potentielle de nouvelles variantes est toujours possible et comprendre le mécanisme des voies derrière la maladie COVID-19 est très critique.

Il est bien connu que le dysfonctionnement des réponses immunitaires est le principal problème contre l'élimination du virus et la guérison de la maladie. De plus, les réponses immunitaires innées sont considérées comme les facteurs clés pour moduler la progression de la maladie vers des phénotypes cliniques asymptomatiques, légers, modérés, sévères ou extrêmement sévères [6,7]. Les neutrophiles et les monocytes/macrophages sont les éléments de défense cruciaux de première ligne à l'origine des réponses immunitaires innées pendant l'infection [8,9]. La protéine de pointe SARS-CoV-2 pourrait activer les macrophages directement via le récepteur ACE2 présent dans ces cellules [10].

Tout au long de l'infection, les cellules immunitaires ont libéré plusieurs protéines, cytokines et médiateurs pour réguler l'inflammation et maintenir l'homéostasie physiologique du corps. La protéomique à base de plasma est une approche pratique pour analyser les profils protéiques et trier les changements associés aux conditions physiopathologiques ou à la progression de la maladie [11]. Différentes études protéomiques ont été réalisées pour identifier et caractériser les profils protéomiques dans différentes cohortes COVID-19 en utilisant des tissus [12,13], des cellules [14] ou du plasma [15,16]. Par conséquent, nous avons appliqué la protéomique plasmatique pour identifier les protéines potentielles associées au système immunitaire inné pertinentes pour la progression de la maladie et de la gravité de la COVID-19. Notre objectif est d'étudier le schéma d'expression des protéines plasmatiques chez les patients sains et infectés par le COVID-19-et d'évaluer l'interaction potentielle avec les réponses immunitaires innées.

2. Résultats

2.1. Profils protéomiques plasmatiques

Pour évaluer les réponses de l'hôte au SARS-CoV-2, une analyse protéomique plasmatique d'une cohorte de patients COVID-19 et de témoins sains a été réalisée. Dans notre étude, la méthode iTRAQ 4plex a été soigneusement choisie par rapport aux autres méthodes marquées par la protéomique en raison de sa reproductibilité élevée et de sa couverture protéomique [17]. De plus, pour une meilleure profondeur de couverture totale du protéome, nous avons combiné le fractionnement de peptides échangeurs de cations forts à iTRAQ. Une illustration du flux de travail de l'étude est présentée à la Fig. 1. Un total de 176 protéines a été identifié dans tous les échantillons de plasma de contrôle COVID-19 et sains avec un taux de fausse découverte de<1% at the protein level. Nevertheless, our prime interest was to identify biomarkers and investigate the pathogenesis of COVID-19. Consequently, differentially expressed proteins analysis was performed for healthy control versus other COVID-19 groups (severe, moderate, and mild) by applying pairwise comparison. Supplementary Table S1 shows a list of differentially expressed proteins in all pairwise comparisons including 'severe v. Control', 'moderate v. Control', and 'mild v. Control'. The statistical criteria for the quantitative analysis were set with a cutoff for fold change with >1,20 pour la régulation à la hausse et<0.83 for down-regulation and a p-value of <0.05 (Supplementary Table S2). 

Les résultats ont révélé que le nombre de protéines modifiées parmi les groupes de comparaisons variait, comme le montre la figure 2a. Les résultats comparatifs ont montré que 27 % des mesures de protéines exprimées de manière différentielle se chevauchent dans les trois groupes (Fig. 2b). Le diagramme de Venn a également montré que le nombre de protéines uniques dans la compassion par paires entre léger et témoin a un nombre plus élevé par rapport aux autres groupes. Cela ne reflète pas nécessairement les différences au niveau de l'identification des protéines mais au niveau quantitatif étant donné que les critères statistiques ont été sélectionnés pour le fold change et la p-value. Pour évaluer si les mesures de protéines exprimées de manière différentielle pour toutes les comparaisons peuvent être distinguées entre les groupes COVID -19 ou non, une analyse PCA a été appliquée. Fait intéressant, les résultats ont montré qu'il y avait une distinction claire entre les groupes COVID-19, comme le montre la Fig. 3. 7}} groupes (Fig. 4). Plusieurs des protéines exprimées de manière différentielle dans notre ensemble de données ont déjà été signalées comme biomarqueurs pour COVID-19 [16,18].

L'ontologie des gènes et l'analyse des voies à l'aide de l'outil en ligne « STRING » ont été effectuées sur les mesures de protéines exprimées de manière différentielle pour les patients témoins sains et COVID{{0}}, quel que soit le groupe dans lequel ils se trouvent. Pour l'analyse d'enrichissement, la majorité des protéines différentiellement exprimées se sont avérées impliquées dans la régulation biologique, la région extracellulaire et le régulateur de la fonction moléculaire pour le processus biologique, le complément cellulaire et la fonction moléculaire respectivement (matériel supplémentaire, Fig. S1). De plus, nous avons étudié les protéines différentiellement exprimées et leur implication dans l'analyse des voies à l'aide de la base de données KEGG. Les critères statistiques de l'analyse d'enrichissement ont été choisis pour être p <0, 01 et le classement des termes de la voie était basé sur l'enrichissement en plis, comme indiqué dans le matériel supplémentaire (Fig. S2). Tout au long de l'infection, les cellules endommagées et mortes initient d'importantes réponses immunitaires et libèrent différents composants cellulaires et endotoxines qui activent la cascade de la coagulation sanguine [19]. L'activation de ces voies entraîne un dysfonctionnement endothélial et une inflammation ainsi qu'une stimulation de la migration des leucocytes et de l'infiltration tissulaire, déclenchant ainsi l'activation des réponses immunitaires locales innées [20]. Dans notre étude, le système du complément, qui est le modulateur central des voies en cascade de l'immunité innée et de la coagulation, s'est avéré être le plus important parmi les autres termes de la voie. Plusieurs études de protéomique sur le plasma de patients COVID-19 ont montré que les cascades du complément et de la coagulation étaient l'une des voies les plus enrichies [21,22]. Cependant, notre discussion se concentre sur trois protéines fétuine-A, TN et PON-1 en tant que nouvelles cibles potentielles impliquées dans les réponses immunitaires innées à l'infection par le SRAS-COV-2 et la gravité du COVID{{ 14}} maladie.

2.2. Les taux plasmatiques de TNF sont associés aux symptômes de la maladie COVID-19

La tempête de cytokines induite par le Sars-CoV2 est l'une des signatures des cas graves de maladie COVID-19 [23]. Il a été rapporté que la libération excessive de TNF est associée à la gravité et au mauvais pronostic des patients atteints de la maladie COVID-19 [24,25]. Dans notre étude, la mesure des taux plasmatiques de TNF a montré une augmentation attendue des groupes COVID-19 par rapport aux témoins sains, corroborée par une nouvelle augmentation des échantillons sévères par rapport aux échantillons modérés ou légers.\

3. Débat

Plusieurs études protéomiques non ciblées ont été utilisées pour étudier le changement dans les échantillons de sérum/plasma COVID-19. Le nombre de protéines identifiées à partir de ces études varie en raison des différentes méthodes utilisées. L'approche de quantification sans étiquette utilisant une méthode d'acquisition indépendante des données a montré une couverture protéomique plasmatique plus élevée [26]. Pour l'approche protéomique basée sur le marquage, la méthode de quantification TMT basée sur Orbitrap LC-MS/MS a montré une couverture protéomique plasma/sérum plus élevée avec un nombre de protéines identifiées atteignant 900 [27]. Dans notre étude, le nombre total de protéines identifiées était de 176, ce qui est très proche de deux études publiées qui ont utilisé le même analyseur de masse (TripleTOF) où elles ont identifié 179 et 189 protéines [28,29]. Les protéines en circulation dans le plasma des patients COVID-19 présentent une fenêtre pour la détection de la progression et de la gravité de la maladie, ainsi que la signature de l'inflammation et des réponses immunitaires innées et adaptatives.

La production et la libération excessive de cytokines pro-inflammatoires sont considérées comme le point clé pour faire passer le phénotype clinique d'un état modéré à un état sévère chez les patients COVID-19. Au cours de l'infection, les réponses immunitaires innées sont modulées par des modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) ou des modèles moléculaires associés aux pathogènes (PAMP) [30]. Les protéines de phase aiguë (APP) telles que la fétuine-A sont systématiquement libérées dans le plasma pour soutenir le processus anti-inflammatoire lors de l'inflammation. Dans notre étude, nous observons une nette régulation à la baisse de la fétuine A plasmatique dans les cas modérés et sévères par rapport aux témoins sains (Fig. 4). Il a été démontré que la fétuine-A peut inhiber les médiateurs précoces (TNF, IL-1, IL-6 et INF) et tardifs (HMGB1) libérés par les cellules immunitaires innées telles que les macrophages [31]. L'analyse du TNF dans notre cohorte COVID-19 indique une tendance à l'augmentation de la concentration plasmatique par rapport aux donneurs sains qui sont plus potentialisés dans les cas graves (matériel complémentaire, Fig. S3). Au cours de l'inflammation, les monocytes/macrophages activés libèrent des cytokines pro-inflammatoires qui sont atténuées par une amine biogénique omniprésente appelée spermine [32]. Cependant, les effets anti-inflammatoires de la spermine dépendent de la fétuine-A. Ainsi, la spermine ne pouvait pas inhiber la fonction des cellules déficientes en monocytes/macrophages fétuine-A [33]. De plus, une diminution du taux de fétuine-A pourrait être liée à des anomalies vasculaires et à une thrombose détectée dans des cas extrêmement graves en raison d'une augmentation de la calcification vasculaire et de la dysfonction endothéliale [34,35] et du stress oxydatif [36] associés aux taux de fétuine-A. .

Après infection virale, l'apoptose cellulaire est l'un des mécanismes de défense de l'hôte. Cependant, une suraccumulation de cellules apoptotiques en raison de défauts de clairance des cellules apoptotiques est associée à une hyperinflammation et à une auto-immunité [37]. La diminution du taux plasmatique de fétuine-A pourrait être au moins en partie impliquée dans ce processus car elle augmente la capacité de phagocytose à nettoyer les cellules apoptotiques par les macrophages [38] et les vésicules par les CMLV [39].

Récemment, il a été rapporté que la fétuine-A joue un rôle crucial non seulement en tant qu'inhibiteur de la calcification, mais en tant que composant multi-protecteur en réduisant la fibrose et l'inflammation et en modulant la polarisation des macrophages [40].

Rudloff et al. ont démontré que la fétuine-A est un gène cible du HIF qui a un rôle protecteur dans la dysfonction rénale induite par l'hypoxie [40]. La fétuine-A atténue la surcharge calcique des macrophages due à l'hypoxie. Nous avons récemment démontré que la protéine de pointe du coronavirus SARS-CoV-2 active les -1-comme les macrophages et augmente les niveaux de calcium intracellulaire [41] ; ainsi, la fétuine-A pourrait jouer le rôle de piégeur de calcium pour réguler l'homéostasie cellulaire et moduler une polarisation adéquate pour des réponses immunitaires innées raisonnables, évitant ainsi une sur-inflammation.

Les syndromes de dysfonctionnement d'organes multiples (MODS) ou MODS liés à une infection sont considérés comme l'une des principales causes de décès dans les cas graves de COVID -19 [42]. L'hyperinflammation et le dérèglement immunitaire au cours de l'infection entraînent des lésions des organes cibles en raison de l'échec de la réponse immunitaire innée et de l'hypercytokinémie. Au cours d'une infection systémique, les endotoxines bactériennes et les ARN viraux sont reconnus par le système immunitaire inné qui déclenche l'expression et la libération de cytokines précoces (TNF et INF). De plus, les réponses immunitaires innées de première ligne stimulent la production de médiateurs tardifs tels que la boîte de groupe 1 à haute mobilité (HMGB1) [43]. La HMGB1 intra ou extracellulaire exprimée dans la plupart des cellules est une alarmine libérée lors de la stimulation ou après la mort de la cellule [44]. L'hyper-libération de HMGB1 déclenche la production de cytokines telles que IL-6 [45]. L'augmentation de la concentration d'IL-6 a été associée à des résultats graves dans le syndrome inflammatoire multisystémique chez les enfants (MIS-C) lié à l'infection par le SRAS-CoV-2 [46]. L'IL-6 est sécrétée principalement par les monocytes/macrophages spécifiquement lorsqu'elle est polarisée en un phénotype de type M1-. Il a également été démontré que HMGB1 peut polariser les macrophages via le récepteur de type Toll (TLR) 4 [47].

La tétranectine (CLEC3B) est l'une des protéines de liaison au HMGB1-et son interaction pourrait moduler la fonction biologique et le processus inflammatoire au cours de l'infection. La protéine TN hautement purifiée a inhibé la libération de HMGB1 induite par le LPS de manière dose-dépendante dans les macrophages [48]. La dérégulation du système immunitaire inné conduisant à une suractivation immunitaire est un avenir commun des cas graves de COVID-19 et de septicémie. Il a été démontré récemment que la concentration sanguine de vitronectine est considérablement réduite chez les patients atteints de septicémie extrêmement sévère [48]. Récemment, Yuming Li et al. [49] ont rapporté la régulation à la baisse de la vitronectine dans les cas graves de patients COVID-19 en utilisant la méthode de protéomique quantitative sans étiquette. Nous avons confirmé la diminution plasmatique significative de cette protéine dans notre étude (Fig. 4) avec différents groupes et sur la base de la méthode quantitative de marquage. Ainsi, la vitronectine peut être considérée comme un marqueur potentiel de la dérégulation immunitaire innée associée à la gravité des symptômes de la COVID-19.

La tétranectine est impliquée dans le système de fibrinolyse conduisant au contrôle de la coagulation anormale ; ainsi, la régulation négative de TN est associée à des maladies cardiovasculaires telles que la maladie coronarienne (CAD) [50]. Il convient de noter que de nombreux cas graves de patients infectés par le SRAS-COV-2 présentent un dysfonctionnement vasculaire peut-être dû à un déficit en TN. La baisse du taux sérique de TN s'accompagne d'une réduction de la paraoxonase 1 (PON1) dans différentes maladies cardiovasculaires. Dans notre étude, la régulation à la baisse de PON1 (Fig. 4) pourrait être un marqueur de la progression de la maladie vers des symptômes sévères, car il a été rapporté que la présence d'inflammation et de stress oxydatif est associée à une diminution de PON1 sérique dans les maladies cardiovasculaires [51] . De plus, un faible niveau de PON1 peut exacerber la réaction pro-inflammatoire innée à l'infection virale, car il a été démontré que PON1 supprime la réaction excessive des macrophages et entretient l'inflammation dans l'athérosclérose [52]. La dérégulation de TN exerce une influence sur les effecteurs en aval de l'AMPK tels que HIF1 qui régule le phénotype et la fonction des cellules immunitaires innées et module la polarisation des macrophages vers le phénotype de type M 1- ainsi que la maturation des DC [53,54].

Collectivement, la régulation à la baisse de la vitronectine, de la fétuine-A et de PON1 observée dans les cas modérés et graves pourrait être associée à une dérégulation des réponses immunitaires innées via un dysfonctionnement des monocytes/macrophages, entraînant une hyper-libération de cytokines et la progression du COVID{{4} } maladie à un état grave.

De plus, notre analyse protéomique a révélé une régulation à la hausse de l'APOE (matériel supplémentaire, Fig. S4) dans les cas graves par rapport aux témoins sains. Les taux plasmatiques d'APOE sont connus pour moduler la fonction des lipoprotéines et les maladies cardio-métaboliques. De plus, l'APOE est impliquée dans le processus inflammatoire en inversant la polarisation des macrophages et en affectant les phénotypes pro-/anti-inflammatoires [55]. En accord avec cela, il a été rapporté qu'une augmentation des niveaux d'APOE pourrait être associée à la gravité du COVID-19 [56].

Au cours de l'infection, l'interaction du système macrophage-complément est importante pour les réponses immunitaires innées ainsi que pour la modulation des fonctions du complément et la transition des conditions immunitaires innées aux conditions immunitaires adaptatives [57]. L'interactivité des composants du complément avec différents récepteurs sur les macrophages entraîne le processus inflammatoire et la production de cytokines. Il a été rapporté dans différentes études de protéomique que la dérégulation de la cascade du complément [58,59]chez les patients COVID-19 et que l'activation du système du complément intensifie la cytotoxicité des lymphocytes T dans les cas graves [60]. Nous avons signalé une augmentation significative des compléments 1q, 5, 6, 7 (matériel supplémentaire, Fig. S5) chez les patients COVID -19 modérés et sévères. Au cours du processus de clairance cellulaire apoptotique, C1q contrôle la polarisation monocyte/macrophage et inhibe l'activité de l'inflammasome [61]. L'analyse d'enrichissement a montré un lien significatif entre les composants du complément C1q, C5, C6, C7 et les cascades de coagulation, où l'on trouve également l'implication du système kallicréine-kinine via le kininogène -1 qui module les réactions immunitaires innées via la voie de la bradykinine.

La présente étude présente une limite en termes de taille d'échantillon. Cependant, nos résultats ont montré un bon accord avec les études précédentes de protéomique covid-19 où nous avons identifié des biomarqueurs qui montrent une expression similaire. Cela montre que l'approche protéomique suivie dans cette étude est valide, mais peut-être pas optimale.

4. Conclusion

Au cours de l'infection par le SRAS-COV-2, un trouble des réponses immunitaires est le principal problème à l'origine de l'escalade de la maladie COVID-19 vers des cas graves. Les voies mécanistes conduisant au dysfonctionnement immunitaire inné sont les clés de voûte de la résolution des complications associées à une infection non contrôlée par le SRAS-CoV-2. À notre connaissance, il s'agit de la première étude à utiliser l'approche iTRAQ sur des échantillons de plasma/sérum COVID-19. Les taux sériques de TN, de fétuine-A et de PON1 sont des marqueurs potentiels impliqués au moins en partie dans le système immunitaire inné, en particulier dans l'hyperactivation des macrophages, et, par conséquent, pourraient être considérés comme des cibles potentielles pour le traitement COVID-19.

5. Matériels et méthodes

5.1. Conception et population de l'étude

Nos cohortes d'étude comprennent 25 sujets : témoins sains (n ​​= 5) et 20 patients infectés par le SRAS-COV-2, regroupés selon la gravité de la maladie (Fig. 1) en Léger (n=5) , Modéré (n=5), Sévère (n=5) ​​et Mort (n=5). Le groupe mort a été exclu dès le début de l'étude en raison de comorbidités des sujets qui pourraient affecter la spécificité des effets COVID-19. Tous les patients ont été recrutés au King Abdallah Specialist Children's Hospital (KASCH) et au King Abdulaziz Medical City (KAMC). Un consentement éclairé a été signé par tous les participants alors qu'ils remplissaient un questionnaire sur les symptômes cliniques et les données démographiques.

Prélèvement sanguin : 3 à 5 ml de sang veineux ont été prélevés chez chaque patient. Des tubes EDTA ont été utilisés pour prélever des échantillons de sang ; puis le plasma a été séparé par centrifugation avant stockage à 80 ◦C pour une analyse plus approfondie.

5.2. Préparation d'échantillons de plasma protéomique iTRAQ

Cinq échantillons biologiques de chaque groupe ont été regroupés en un seul échantillon. Tous les échantillons de plasma ont ensuite été soumis aux cartouches Agilent Human14 Multiple Affinity Removal Spin pour éliminer les 14 protéines les plus abondantes du plasma en suivant le protocole de fabrication (Agilent, États-Unis). Ensuite, les digestions de protéines ont été marquées à l'aide de réactifs 4-plex iTRAQ (Sciex, Canada) en suivant le protocole de fabrication avec des modifications mineures. En bref, 100 ug de protéines ont été dénaturées, réduites et alkylées à l'aide de 8 M d'urée/100 mM de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), de 50 mM de Tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) et de méthylméthanethiosulfonate (MMTS) respectivement. Des échantillons de protéines ont ensuite été digérés en peptides en utilisant de la trypsine avec un rapport de 1:40 (trypsine sur protéine). Par la suite, les échantillons de peptides ont été marqués avec 114, 115, 116 et 117 pour le contrôle sain, sévère, modéré et léger respectivement. Les 4 échantillons marqués ont ensuite été mélangés et regroupés en un seul échantillon.

5.3. Fractionnement et dessalage des peptides

L'échantillon regroupé iTRAQ a été fractionné hors ligne sur la base de l'échange de cations à l'aide de la colonne de centrifugation Pierce Strong Cation Exchange (SCX) (Thermo Scientific, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. En bref, la colonne de centrifugation a d'abord été conditionnée en utilisant de l'acide formique {{0}},1 %, puis en chargeant les peptides marqués dans la colonne. Deux étapes de lavage ont été effectuées en utilisant 0,1 % d'acide formique. Les peptides ont ensuite été élués en 22 fractions en modifiant le rapport de 10 % de concentration d'acétonitrile et de formiate d'ammonium de 15 mM à 900 mM. Par la suite, l'étape de dessalage et de nettoyage a été effectuée par un sorbant polymère à phase inversée à l'aide de la cartouche Oasis HLB (Waters, États-Unis). En bref, la cartouche a été conditionnée et équilibrée avec de l'acétonitrile et de l'acide formique à 0,1 % respectivement. Les peptides marqués ont ensuite été chargés et deux étapes de lavage avec 0,1 % d'acide formique ont été appliquées. L'élution des peptides a été effectuée en utilisant de l'acétonitrile à 70 %.

5.4. NanoLC-MS/MS

Chaque fraction (total de 22) a été chargée sur un Ekspert nanoLC 425 (Eksigent, Dublin, CA, USA), couplé à un TripleTOF 5600 (Sciex, Concord, Canada) en triple exemplaire. La séparation des peptides sur NanoLC a été réalisée comme décrit précédemment [41]. Les MS1 et MS/MS pour l'analyse iTRAQ ont été définis comme suit : plage de masse TOF de 250 à 1 500 avec un temps d'accumulation de 0,25 s. Les critères IDA étaient pour les ions supérieurs à 400 m/z avec un état de charge de 2 à 5. Le seuil d'abondance dépasse 200 cps. Le CE ajusté lorsque le paramètre du réactif iTRAQ a été vérifié. Les paramètres de la source d'ions ont été définis comme suit : gaz de source d'ions 1 (GS1), 25 ; Rideau de gaz (CUR), 25 ; tension flottante IonSpray (ISVF), 2250 ; Température de l'élément chauffant de l'interface (HIT), 60.

5.5. Analyse protéomique quantitative iTRAQ

Les données brutes MS iTRAQ ont été traitées à l'aide du logiciel ProteinPilot (v 4.5, Sciex) pour l'identification et la quantification. Les paramètres ont été définis comme suit : type d'échantillon, iTRAQ 4plex, Cys, Alkylation, MMTS, Digestion, Trypsine, Facteurs spéciaux, Dénaturation de l'urée, Espèce, Homo sapiens, Base de données, Base de données UniProt Proteome Humans (téléchargée le 29 octobre 2019) ; FDR global a été vérifié.

Le changement de pli et la valeur p ont été calculés sur la base de la moyenne de l'intensité peptidique et du test t de Student, respectivement. Les données iTRAQ MS ont été déposées dans ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) avec l'identifiant PXD037400.

5.6. Analyse bioinformatique

L'analyse PCA a été réalisée à l'aide de la fonction "principale" du logiciel statistique R. VolcaNoseR [62] a été utilisé pour générer les tracés des volcans. L'outil en ligne STRING [63] a été utilisé pour l'enrichissement génétique et l'analyse des voies avec des critères statistiques définis à p <0.05. La base de données Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) a été appliquée pour l'analyse des voies.

5.7. Mesure des dosages immuno-enzymatiques (ELISA)

Les échantillons ont été préparés comme décrit précédemment [64] à l'aide du facteur de nécrose tumorale (TNF-) et du kit de dosage ELISA (SEKH-0047, Solarbio life sciences). Brièvement, 100 ul d'échantillons ou de standards ont été ajoutés dans chaque puits puis incubés à 37 ◦C pendant 1 h 30 min. Après quatre lavages avec du tampon de lavage, un anticorps de détection conjugué à la biotine (100 ul) a été ajouté avant incubation pendant 1 h à 37 ◦C. Une deuxième étape de lavage (quatre fois) a été effectuée et de la streptavidine-HRP (100 ul) a été ajoutée avant incubation pendant 30 min. Après lavage, une solution de substrat (TMB) (100 ul) a été ajoutée et incubée pendant 15 min dans l'obscurité avant d'ajouter la solution d'arrêt, et la mesure de l'absorbance a été détectée à 450 nm.

Financement

Cet article a été soutenu par une subvention du King Abdullah International Research Center no. RC20/153/R et RC20/205/R et BioBank KAIMRC NGHA.

Approbation éthique et consentement à participer

Cette étude a été approuvée par l'Institutional Review Board (IRB) du King Abdullah International Medical Research Center (KAIMRC) Ethics Committee avec IRB RC20/153/R et RC20/205/R. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants à l'étude.

Contributions des auteurs

BA : Concevoir et concevoir les expériences et analyser et interpréter les données. FAM, H⋅S, KA et HA : ont effectué les expériences. FA, HSA et MR : analyse et interprétation des données. FA, MJ, AH et MB : ont fourni des réactifs, des matériaux, des outils d'analyse ou des données et rédigé l'article. TB : a conçu et conçu les expériences et analysé et interprété les données.

Déclaration de disponibilité des données

Les données associées à cette étude ont été déposées sur Les données iTRAQ MS ont été déposées sur ProteomeXchange Consortium avec l'identifiant PXD037400.

Déclaration d'intérêt

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents ou de relations personnelles connus qui auraient pu sembler influencer le travail rapporté dans cet article.

Remerciements

Les auteurs remercient le Researchers Supporting Project number (RSP-2023/17) de l'université King Saud de Riyad, en Arabie saoudite.

Les références

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