La protéomique quantitative révèle des différences significatives entre les formations cérébrales de souris

S'il vous plaît contactezoscar.xiao@wecistanche.compour plus d'informations

Résumé:Le vieillissement est associé à un déclin général des fonctions cognitives, qui semble être dû à des altérations des quantités de protéines impliquées dans la régulation de la plasticité synaptique. Ici, nous présentons une analyse quantitative des protéines impliquées dans la neurotransmission dans trois régions du cerveau, à savoir l'hippocampe, le cortex cérébral et le cervelet, chez des souris âgées de 1 et 22 mois, en utilisant la technique d'approche des protéines totales. Nous démontrons que bien que le titre de certaines protéines impliquées dans la neurotransmission et la plasticité synaptique soit affecté par le vieillissement de manière similaire dans toutes les formations cérébrales étudiées, en fait, chacune des formations représente son propre mode de vieillissement. Généralement, les protéomes hippocampique et cortical sont beaucoup plus instables au cours de la vie que le protéome cérébelleux. Les données présentées ici fournissent une image générale de l'effet du vieillissement physiologique sur la plasticité synaptique et pourraient suggérer des cibles médicamenteuses potentielles pour les thérapies anti-âge.

Veuillez cliquer ici pour en savoir plus

Mots clés:transmission glutamatergique et GABAergique ; Camk2 ; OXPHOS ; matrice extracellulaire; approche protéine totale;hippocampe;cortex;cervelet

1. Introduction

Le vieillissement physiologique est lié à un déclin progressif des fonctions cognitives, telles que la formation et la rétention de la mémoire, la vitesse de traitement et le raisonnement conceptuel [1]. Il est largement admis que les changements associés au vieillissement sont principalement causés par la perte de cellules neuronales ; cependant, de nombreuses études ont suggéré que la structure du réseau neuronal, plutôt que le nombre de neurones, est affectée au cours du vieillissement [2-4]. Il a été démontré que le vieillissement est associé au raccourcissement des dendrites et à la diminution de leur nombre, à la perte des épines dendritiques, à la diminution du nombre d'axones au sein d'un réseau et au niveau de leur myélinisation et à la perte des synapses [5]. De plus, il a été montré que les mécanismes moléculaires sous-jacents aux phénomènes de plasticité cérébrale tels que la potentialisation et la dépression à long terme des synapses glutamatergiques (LTP et LTD) et GABAergiques (iLTP et iLTD) et l'efficacité de divers systèmes neuromodulateurs déclinent avec l'âge [1]. 6,7]. Plusieurs études ont démontré que les changements cognitifs liés au vieillissement s'accompagnent de changements dans l'expression et/ou la localisation de protéines impliquées dans la transmission synaptique et la plasticité [6,8]. L'expression des protéines dans diverses régions du cerveau des rongeurs a été intensivement étudiée par des techniques protéomiques basées sur la spectrométrie de masse [9,10] et des microréseaux [11,12].cholestérol cistancheCependant, à l'exception de l'étude de Walter et Mann [10] et de l'étude de Duda et al. [8], toutes les investigations ont utilisé des approches semi-quantitatives qui ne fournissent pas d'informations sur la concentration précise de protéines dans les échantillons étudiés.

Récemment, nous avons mesuré les concentrations de protéines impliquées dans la plasticité neuronale dans l'hippocampe, le cortex cérébral et le cervelet chez des souris jeunes (1-mois) et adultes (12-mois--) [8 ]. Nous avons constaté que, bien que la quantité totale de protéines n'ait pas changé au cours de la vie, les titres de protéines liés à la neurotransmission et à la neuroplasticité différaient significativement entre les animaux jeunes et adultes, ce qui indique que les symptômes de transmission du signal et d'affaiblissement de la neuroplasticité peuvent être observés au milieu. souris âgées au niveau protéomique [8].

cistanche peut anti-âge

Dans cet article, nous fournissons les résultats d'une analyse quantitative approfondie des protéomes hippocampiques, corticaux et cérébelleux liés à la plasticité neuronale de jeunes (1- mois) et âgés (22- mois ) souris, se concentrant principalement sur les changements liés au vieillissement de la concentration des protéines engagées dans la signalisation du glutamate, du GABA, de l'acétylcholine et de la monoamine. Nous discutons également des changements dans la concentration des protéines impliquées dans la libération des neurotransmetteurs et la formation des connexions synaptiques, telles que les protéines de l'adhésion cellulaire trans-synaptique et les réseaux périneuronaux.

En utilisant la méthode de l'approche des protéines totales sans étiquette (TPA), nous avons mesuré les titres de plus de 7000 protéines dans chacune des régions cérébrales étudiées [13]. Dans cet article, nous présentons, à ce jour, la description protéomique quantitative la plus approfondie des changements liés à la plasticité synaptique au cours du vieillissement physiologique des souris. À notre connaissance, il s'agit, à ce jour, de la description protéomique quantitative la plus approfondie des changements liés à la plasticité synaptique au cours du vieillissement physiologique des souris.

2. Matériels et méthodes

2.1. Animaux et préparation des tissus

Des cerveaux ont été isolés à partir de cinq souris femelles C57BL/10J à P30 (jeunes) et de cinq souris âgées de 22-mois (âgées). Les animaux ont été traités comme décrit dans [8]. En bref, les animaux ont été anesthésiés avec de l'isoflurane et décapités, et les cerveaux ont été explantés dans un tampon glacé (87 mMNaCl, 2,5 mMKCl, 1,25 mMNaHNPO4, 25 mMNaHCO3, 0,5 mMCaClz, 7 mMMgSO, 25 mM de glucose, 75 mM de saccharose, pH 7,4) . L'ensemble des régions cérébrales : hippocampe droit, cortex frontal de l'hémisphère droit et hémisphère droit du cervelet, de chaque animal, ont été utilisées pour la protéomique quantitative.effets secondaires de cistanche deserticolaToutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique local (Comité d'éthique de Wroclaw, autorisation no.10/2018), et tous les efforts ont été faits pour minimiser le nombre d'animaux utilisés pour les expériences.

2.2.Préparation des lysats tissulaires

Les lysats ont été obtenus comme décrit dans [13]. Les structures isolées ont été homogénéisées dans un tampon de lyse (0.1 M Tris/HCl, 2 % SDS, 50 mM DTT, pH 8,0) et incubées pendant 5 minutes à 99 degrés. Les échantillons ont été stockés à -20 degré jusqu'à l'analyse protéomique. La fluorescence du tryptophane a été utilisée pour déterminer la concentration totale de protéines dans les échantillons [14].

2.3.Préparation d'échantillons assistée par filtre pour digestion multi-enzymatique (MED FASP)

Les lysats contenant 80 ug de protéines totales ont été utilisés pour le MED FASP [15] sans alkylation de la cystéine [16]. Les protéines ont été clivées pendant une nuit avec LysC puis digérées avec de la trypsine pendant 3 h. Le rapport enzyme/protéine était de 1:40. Les digestions ont été effectuées à 37 degrés dans du Tris-HCl 50 mM avec l'ajout de DTI 1 mM, pH 8,5 [13] Des aliquotes contenant 8 ug de peptide total ont été concentrées et stockées à -20 degrés jusqu'à l'analyse par spectrométrie de masse.

2.4.Chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem

L'analyse des mélanges de peptides a été effectuée comme décrit précédemment [13] à l'aide du spectromètre de masse QExactive HF (ThermoFisher Scientific, Palo Alto, CA, USA). Les données ont été déposées dans le Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE [17]. L'identifiant de l'ensemble de données : PXD025978(nom d'utilisateur : reviewer_pxd025978@ebi.ac.uk ; mot de passe : QL3YI7nP).

2.5.Analyse des données protéomiques

MaxQuant v1.2.6.20[18] a été utilisé pour l'analyse des données MS. La base de données UniProtKB/Swiss-Prot a été utilisée pour identifier les protéines à l'aide des données peptidiques MS et MS/MS.

La carbamidométhylation de la cystéine a été définie comme une modification fixe.dose de cistanche redditL'écart de masse initial autorisé de l'ion précurseur était jusqu'à 6 ppm, et pour les masses de fragments, il était jusqu'à 20 ppm. Le taux maximal de découverte de faux peptides a été spécifié à 0,01. La méthode de l'approche des protéines totales [19,20] a été utilisée pour calculer la concentration molaire en protéines en utilisant la relation où la quantité de protéines individuelles (c(i) a été calculée comme le rapport de leur intensité (MSsignal(i)) à la somme de toutes les intensités (signal MS total) dans l'échantillon mesuré, multipliées par le poids moléculaire (MW(i)) des protéines individuelles.

2.6.Analyse statistique

Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD. L'égalité des variances a été calculée à l'aide du test F de Fisher. Pour déterminer les différences entre deux groupes expérimentaux, le test t de Student a été utilisé. L'analyse a été réalisée à l'aide du logiciel SigmaPlot 11 (Systat Software).

3. Résultats

Les données protéomiques complètes ont été déposées dans le consortium ProteomeXchange et sont disponibles avec l'identifiant de l'ensemble de données : PXD0255978 (nom d'utilisateur : reviewer_pxd025978@ebi.ac.uk ; mot de passe : QL3YI7nP). L'analyse des spectres a permis de la quantification de 7547 protéines dans les échantillons analysés.bienfaits de l'extrait de cistancheLes protéines qui ont été identifiées avec au moins un peptide unique ont été utilisées dans l'analyse. En détail, les données d'expression des protéines 7324, 7088 et 7343 dans, respectivement, l'hippocampe, le cortex et le cervelet d'animaux âgés ont été déterminées quantitativement et déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE. Pour les jeunes animaux, les données pour les protéines 7347, 7323 et 7526 dans, respectivement, l'hippocampe, le cortex et le cervelet y ont été déposées.

4. Transmission glutamatergique

Le glutamate, principal neurotransmetteur excitateur du cerveau, agit par l'intermédiaire de récepteurs ionotropes et métabotropes (mGluRs, Grm). Les récepteurs ionotropes appartiennent à l'une des quatre classes : récepteurs de l'acide o-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazole propionique (récepteurs AMPA, Gria), récepteurs du N-méthyl-D-aspartate ( récepteurs NMDA, Grin), récepteurs kaïnate (Grik) et récepteurs delta (Grid). 4.1.Gria

Notre étude révèle que les récepteurs du glutamate les plus abondants dans l'hippocampe sont Gria. Ce sont des protéines hétérotétramères [21], et nous avons constaté que la sous-unité Gria2 était exprimée au titre le plus élevé à la fois chez les hippocampes murins jeunes et âgés (Figure 1A). Le vieillissement n'a eu aucun effet sur l'expression des récepteurs Gria dans l'hippocampe, à l'exception de Gria4, dont le niveau était significativement réduit chez les animaux âgés. Cependant, le titre de Gria4 était très faible en général, par rapport aux autres membres de la famille Garcia.

Dans le cortex cérébral, Gria étaient les récepteurs ionotropes du glutamate les plus omniprésents uniquement chez les animaux âgés (Figure 1B, D). Statistiquement, les changements dans les titres des sous-unités Gria individuelles au cours du vieillissement dans le cortex n'étaient pas significatifs, mais la concentration totale de protéines Gria a été significativement augmentée chez les animaux âgés (figure 1B).cistanche gengis khanSemblable à l'hippocampe, Gria2 était l'isoforme principale du cortex.

Dans le cervelet, les récepteurs du glutamate les plus abondants étaient Grial et Gria2, qui étaient exprimés à des niveaux très similaires, et le vieillissement n'affectait pas leur concentration (Figure 1C). 4.2.Sourire

Les récepteurs NMDA sont des canaux hétérotétramères glutamate-dépendants pour les ions calcium et sodium qui sont cruciaux pour la plasticité synaptique [2] et sont composés d'isoformes de Grin [23]. Nous avons constaté que la principale forme de Grin exprimée dans toutes les structures cérébrales étudiées était Grin1 (Figure 1A-C). La concentration de cette isoforme n'a pas été affectée par le vieillissement dans l'hippocampe et le cervelet ; cependant, il a été significativement réduit dans le cortex (figure 1B). Dans l'ensemble, la concentration totale de toutes les sous-unités NMDA, à l'exception de Grin3a (dont le niveau n'a pas été affecté par le vieillissement et exprimé à un niveau très faible par rapport aux autres protéines Grin), a diminué dans le cortex âgé, alors qu'elle était inchangée dans le cervelet ( Figure 1B,C). Dans l'hippocampe, le vieillissement s'est traduit par une diminution statistiquement significative de la quantité totale de protéines Grin, ainsi que des isoformes Grin2b et Grin3a.

4.3.Grille

Gridl et Grid2 sont des récepteurs ionotropes exprimés presque exclusivement dans le cervelet, et ils sont impliqués dans la régulation de la plasticité synaptique [24]. Nous avons constaté que dans le cervelet, l'isoforme principale est Grid2, et que son titre n'est pas affecté par le vieillissement (figure 1C). Dans l'hippocampe et le cortex, la concentration de, respectivement, Gridl et Grid2 est significativement plus faible chez les animaux âgés ; cependant, le titre de ces récepteurs est très faible en général (Figure 1A,B).

4.4.Grik

Les récepteurs kaïnate sont des canaux sodiques hétéromères assurant la transmission ionotrope et métabotrope [25,26]. Notre analyse a révélé que la concentration de presque tous les membres de la famille des protéines Grik était diminuée dans les anciens hippocampes et cortex (Figure 1A, B). En revanche, le titre des protéines Grik, à l'exception de l'isoforme Grik2, n'était pas affecté par le vieillissement dans le cervelet(Figure 1C).

4.5.Grm

Nous avons identifié sept membres des récepteurs métabotropes dépendants du glutamate, Grm, dans toutes les formations cérébrales étudiées : Grml-7 (Figure 1A-C). La concentration totale de protéines Grm dans l'hippocampe et le cortex a été réduite chez les animaux âgés ( Figure 1A,B), tandis que le titre total de Grms cérébelleux n'a pas été modifié de manière significative par le vieillissement (Figure 1C).

Une analyse détaillée a révélé que les niveaux des isoformes les plus abondantes de Grm (Grm2, Grm3 et Grm5) dans l'hippocampe étaient significativement diminués chez les souris âgées (Figure 1A), tandis que dans le cortex, les changements dans les titres des isoformes les plus abondantes n'ont pas été significativement modifiés (figure 1B).

5. Transmission GABAergique

L'acide y-aminobutyrique est le neurotransmetteur inhibiteur le plus abondant dans le cerveau et il peut interagir avec deux types de récepteurs : le récepteur ionotrope GABAA, qui est un canal chlorure, et le récepteur métabotrope GABAg. Les récepteurs GABA sont des protéines pentamériques composées de diverses sous-unités∶ a（Gabra）, （Gabrb）,y（Gabrg）et δ（Gabrd）【27】GABAg est un récepteur hétérodimérique couplé aux protéines G formé par les sous-unités Gabbrl et Gabbr2[28] . 6.GABAA-Gabr

Notre analyse a démontré que la concentration totale de la protéine GABA était significativement réduite dans l'hippocampe et le cortex de souris âgées, mais qu'elle n'était pas affectée par le vieillissement dans le cervelet (figure 2A). Ces changements se sont traduits par des altérations de l'expression de sous-unités individuelles du récepteur GABAA (figure 2B-D). 6.1.Gabra (sous-unité a)

Nous avons constaté que la concentration globale de sous-unités de Gabra n'était pas affectée par le vieillissement dans toutes les formations cérébrales étudiées (figure 2B-D). L'isoforme la plus abondante était Gabral. Au sein des sous-unités a, seule l'expression de Gabra3 et Gabra5 a été influencée par le vieillissement (figure 2B-D). Le seul changement statistiquement significatif a été associé à Gabra4, dont le titre a diminué dans le cortex des animaux âgés (figure 2C). 6.2.Gabrb (sous-unité)

Notre analyse a montré que la sous-unité était la sous-unité GABAA la plus omniprésente dans toutes les structures cérébrales étudiées, à la fois chez les jeunes et les vieux animaux (Figure 2B-D), et l'isoforme principale de la sous-unité était Gabrb2 (Figure 2B-D). La concentration de Gabr2b était le plus élevé dans le cervelet, tandis que dans l'hippocampe et le cortex, ses titres étaient similaires (figure 2B-D). Nous n'avons observé aucun changement significatif associé au vieillissement dans l'expression des isoformes de la sous-unité dans l'hippocampe et le cervelet. Cependant, dans le cortex, le titre total de Gabrb a été considérablement réduit, ce qui était lié à une diminution du titre de Gabrb2 (figure 2C).

6.3.Gabrg (sous-unité)

Parmi les sous-unités y du récepteur GABAA, Gabrg2 était exprimé au plus haut niveau dans le cortex et le cervelet (Figure 2C,D), et c'était la seule sous-unité y que nous pouvions détecter dans l'hippocampe (Figure 2B). Dans l'hippocampe et cortex, la concentration totale d'isoformes de Gabrg était presque deux fois plus élevée chez les jeunes animaux que chez les personnes âgées (Figure 2A,B). D'autre part, la concentration totale de la sous-unité y n'a pas été affectée par le vieillissement dans le cervelet (Figure 2D). 6.4.Gabrd (sous-unitéδ)

Chez les souris âgées, la sous-unité $ était exprimée principalement dans le cervelet (figure 2B-D). Le titre de Gabrd dans le cervelet de souris âgées était environ dix fois plus élevé que dans le cortex et plus de 25 fois plus élevé que dans l'hippocampe (figure 2B-D). Le vieillissement n'a eu aucun effet sur l'expression de Gabrd dans l'hippocampe et le cervelet, mais dans le cortex, le titre du récepteur a été réduit de plus de trois fois par le vieillissement (figure 2C). 7.GABAb-Gabbr

Gabbr est un récepteur métabotropique hétérodimérique formé par les sous-unités Gabbrl et Gabbr1, et sa fonction est couplée à l'activation d'une protéine G et à la modulation des activités d'effecteurs en aval tels que l'adénylate cyclase [29]. Nous avons constaté que l'expression des deux sous-unités du récepteur métabotropique était diminuée dans l'hippocampe des animaux âgés (figure 2B). Dans le cervelet, la quantité de Gabbr n'était pas affectée par le vieillissement. Nous avons également pu observer une réduction significative de la somme des concentrations de sous-unités de Gabbr dans le cortex, bien que séparément, les changements dans les titres des sous-unités n'étaient pas statistiquement significatifs (figure 2C). 8. Gad

Gad est une enzyme décarboxylant le glutamate pour produire du GABA [30]. Nos données montrent que l'expression de l'isoforme principale de Gad dans l'hippocampe, Gad2, n'est pas affectée par le vieillissement ; cependant, le niveau d'une autre isoforme de Gad, Gad1, était significativement élevé (figure 2B). Nous avons également pu observer des augmentations significatives des titres des deux isoformes de Gad dans le cervelet des animaux âgés (figure 2D), mais il n'y a eu aucun changement dans l'expression de Gad dans le cortex des souris âgées (figure 2C).

9. Kinases dépendantes du calcium/de la calmoduline

L'activation de la protéine kinase dépendante du calcium/calmoduline (Camk) est la première étape de la transformation de la signalisation calcique en diverses formes de plasticité synaptique (pour revue, voir [31,32]). 9.1.Camk1

La seule isoforme de Camkl que nous avons trouvée dans notre analyse était Camkld. Nous avons également observé certains peptides associés à Camkl, mais nous n'avons pas été en mesure de les annoter précisément aux isoformes de Camkl sélectionnées (elles sont décrites comme "Camkl", Figure 3A-C). Dans notre analyse, nous n'avons observé aucun signe significatif associé au vieillissement. changements dans la concentration de ce groupe de Camk dans l'hippocampe et le cortex (figure 3A, B). D'autre part, le titre de Camkl a été significativement augmenté dans le cervelet de souris âgées (figure 3C).

9.2.Camk2

Camk2 appartient aux protéines les plus ubiquitaires dans toutes les structures cérébrales [8,3]. Nous avons constaté que parmi les isoformes de Camk2, le titre de Camk2a est le plus élevé de toutes les structures cérébrales étudiées (Figure 3A-D), et que sa concentration dans l'hippocampe et le cortex est plusieurs fois supérieure au titre de Camk2b, le deuxième plus abondant isoforme de Camk2 (Figure 3A,B). Le vieillissement n'a eu aucun effet sur les concentrations des isoformes de Camk2, à l'exception de Camk2d, dont le niveau a diminué dans l'hippocampe de souris âgées (figure 3A).

9.3.Camk4

Le rôle moléculaire de Camk4 dans la plasticité synaptique est différent de celui de Camk2. Active Camk4 se localise dans le noyau cellulaire et régule la transcription des gènes impliqués dans la phase tardive de formation de la mémoire [32].

Notre étude révèle que la concentration de Camk4 a été réduite de manière significative, presque deux fois, dans toutes les formations cérébrales analysées d'animaux âgés (figure 3A-D). Le titre de protéine était le plus bas dans l'hippocampe et le plus élevé dans le cervelet (figure 3A-D).

9.4.Camkk

Les protéines kinases kinases dépendantes du calcium/calmoduline (Camkk) phosphorylent et régulent l'activité des protéines Camk. Notre analyse a révélé que la concentration totale de Camkk n'était pas statistiquement significativement affectée par le vieillissement dans l'hippocampe et le cortex (Figure 3A, B, D). Dans le cervelet, le niveau de l'isoforme Camkkl était plus que 3- fois augmenté chez les animaux âgés, alors que la concentration de Camkk2 était plus de deux fois plus faible chez les animaux âgés (Figure 3C).

10.Protéine kinase dépendante de l'AMPc Prka (PKA)

Prka est une sérine protéine kinase conservée avec une large distribution et une spécificité relativement faible, qui peut phosphoryler diverses sous-unités des récepteurs AMPA et NMDA et moduler leur fonction [34]. 10.1. Sous-unités catalytiques PKA—Prkac

Notre analyse a démontré que dans l'hippocampe, les sous-unités catalytiques les plus abondantes de PKA sont Prkaca et Prkacb (Figure 4). Les concentrations des sous-unités individuelles n'ont pas été affectées par le vieillissement; cependant, la concentration totale de protéines Prkac était légèrement mais statistiquement significativement diminuée chez les souris âgées (figure 4A, D). Semblable à l'hippocampe, dans le cortex et le cervelet, les sous-unités catalytiques les plus omniprésentes de PKA étaient Prkaca et Prkacb ; cependant, les concentrations des protéines ne différaient pas entre les jeunes et les vieux animaux (Figure 4B,C). 10.2. Sous-unités réglementaires PKA——Prkar

Nous avons constaté que l'expression globale des isoformes de Pekar était la plus élevée dans le cortex, tandis que dans l'hippocampe et le cervelet, le niveau de Prkar était similaire (figure 4A-D). Le vieillissement n'a eu aucun effet sur la concentration totale de Prkar, et la seule différence liée à l'âge était un niveau réduit de Prkar2b dans l'hippocampe de souris âgées (figure 4A).

11. Protéines kinases activées par les mitogènes—Mapk

Les protéines Mark régulent un large spectre de processus cytoplasmiques et nucléaires impliqués dans la plasticité neuronale [35].

Les résultats présentés ici démontrent que l'érable était le Mapk le plus abondant dans l'hippocampe (figure 4A). La concentration totale de Mapk dans l'hippocampe n'a pas été affectée par le vieillissement (figure 4A, D); cependant, l'expression de Mapk3 était d'environ 23 % plus élevée chez les personnes âgées. animaux (Figure 4A), et Mapk15 a été augmenté de près de sept fois chez les hippocampes âgés (Figure 4A).

Tant dans le cortex que dans le cervelet, la concentration totale de Mapk n'a pas été affectée par le vieillissement, et Mapk1 était la principale kinase exprimée dans les deux structures cérébrales (Figure 4B,C).

Cet article est extrait de Cells 2021, 10, 2021. https://doi.org/10.3390/cells10082021 https://www.mdpi.com/journal/cells