La quercétine avec le lycopène module la voie des gènes antioxydants enzymatiques dans la cardiotoxicité de l'isoprotérénol chez le rat Partie 1

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ABSTRAIT

La quercétine (QN) est un composé phénolique naturel présent en grande partie dans les légumes et les fruits. Le lycopène (LY) est un autre phytocomposé naturel, présent en abondance dans les fruits et légumes de couleur rouge. Il a été rapporté que les deux ont des activités bénéfiques chez l'homme. Dans cette étude, nous documentons un modèle expérimental in vivo pourisoprotérénol(ISO) toxicité des lésions cardiaques chez les rats Sprague-Dawley (SD) et traitement avec une concentration optimisée combinée de quercétine et de lycopène (QL). Des rats SD mâles de différents groupes ont été traités avec QL (80 mg/kg QN et 3 mg/kg LY ensemble po) pendant 10 jours avec une administration ISO (100 mg/kg ip) les jours 7 et 8. Après la période expérimentale, CK -MB, TROP, AST, ALT, LDH, GST, GPx, CAT, SOD, Vit. E, vit. C, GSH, GSSG et MDA ont été estimés. Les rats SD ayant reçu de l'ISO ont montré une augmentation évidente des taux d'enzymes marqueurs sériques et des marqueurs de stress oxydatif tissulaire (MDA et GSSG). En outre, des réductions marquées du poids corporel et des augmentations des niveaux d'antioxydants enzymatiques et non enzymatiques ont été observées. Les caractéristiques histologiques du cœur ont également indiqué une perturbation de la structure des myofibrilles cardiaques des rats intoxiqués à l'ISO. En outre, une analyse PCR quantitative a révélé l'implication de gènes antioxydants et de voies associées tels que les gènes Nrf2, HO-1, NQO1, GSTμ, SOD1, SOD2, CAT et BCl-2. QLprétraitementa empêché tous ces effets indésirables de la cardiotoxicité ISO et a considérablement réduit les dommages myocardiques. Une diminution du stress oxydatif a été observée, possiblement par des altérations des niveaux d'expression deenzymatiquegènes antioxydants (GSTμ, SOD1, SOD2 et CAT). En général, QL exerce un fort effet protecteur par les modulations enzymatiquesantioxydantactivité et effet de régulation des voies moléculaires associées dans les maladies cardiovasculaires.

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1. Introduction

Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont un groupe de maladies qui impliquent les vaisseaux sanguins du cœur, du cerveau, des bras et des jambes. Les personnes atteintes de maladies cardiovasculaires sont confrontées à diverses formes de complications telles que l'athérosclérose, l'insuffisance cardiaque et les accidents vasculaires cérébraux. Normalement, l'insuffisance cardiaque et les accidents vasculaires cérébraux sont causés par un blocage des dépôts graisseux sur les parois internes des vaisseaux sanguins qui irriguent le cœur ou le cerveau. Un tel blocage est associé à de nombreuses activités comportementales telles qu'une alimentation malsaine, le manque d'exercice, une consommation excessive d'alcool et de tabac ainsi que des antécédents de diabète et d'hypertension (Turer, AT et Hill, JA2010). Souvent, de nombreux avertissements alarmants de MCV sont importants, notamment un engourdissement ou une douleur au visage et à la poitrine, un souffle court, des nausées, des sueurs froides et une perte de coordination. La manifestation de complications cardiovasculaires non traitées peut entraîner des résultats mortels chezmyocardiqueinfarctus (Ml).

L'ischémie myocardique (IM) fait référence à une exacerbation d'une lésion du tissu cardiaque due à une diminution de l'apport d'oxygène et/ou à une diminution de l'apport sanguin aux tissus cardiaques (Kocak et al., 2016).

L'Organisation mondiale de la santé (OMS) a signalé que l'infarctus du myocarde devrait être la principale cause de mortalité, le taux de mortalité passant à 20 millions de cas. À l'heure actuelle, 130 millions de personnes vivent avec des maladies cardiovasculaires, avec plus de cas chez les hommes (68 %) que chez les femmes (32 %). Environ les trois quarts des décès par MCV proviennent de pays à revenu faible ou intermédiaire comme l'Indonésie, le Pakistan, les Philippines et le Bangladesh (Fajobi et al, 2020). La plupart des habitants des pays à revenu faible ou intermédiaire ont un accès restreint aux traitements de santé pour répondre à leurs besoins. En conséquence, les personnes présentant des facteurs de risque sont diagnostiquées à un stade plus avancé et meurent plus jeunes en raison de maladies cardiovasculaires. L'âge moyen du décès causé par les maladies cardiovasculaires dans les pays à revenu faible ou intermédiaire est d'environ 40 ans, alors qu'il est d'environ 80 ans dans les pays développés. Cependant, une augmentation rapide de l'incidence et de la prévalence des maladies cardiovasculaires dans les pays développés met en évidence la caractéristique spécifique de la phase d'occidentalisation, répondant à une préoccupation alarmante dans la gestion des maladies cardiovasculaires malgré les progrès rapides des services de santé (Ricardo et al., 2019).

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La progression de l'incidence, associant le handicap et la qualité de la santé intimidante à l'augmentation du taux de mortalité dans les pays en développement et développés, a suscité un intérêt substantiel dans la recherche de la gestion thérapeutique avec un composé approprié pour réguler les maladies cardiovasculaires en termes d'efficacité et de sécurité des médicaments. Bien que certains médicaments préviennent les maladies cardiovasculaires, ces médicaments ne sont pas très efficaces pour combattre la maladie ou sont associés à des effets secondaires graves. Des études ont suggéré que l'inflammation joue un rôle important dans la pathogenèse des maladies cardiovasculaires (Pantazi et al, 2016). Une réponse inflammatoire accrue entraîne une série de fluctuations métaboliques et biochimiques anormales dans les cellules cardiaques et cérébrales. La privation prolongée d'oxygène entraîne une accumulation d'acide lactique et une réduction du pH intracellulaire. Ces conditions acides conduisent à la stimulation des espèces réactives de l'oxygène (ROS). L'accumulation de ROS active ensuite la réponse inflammatoire qui élève encore le dysfonctionnement contractile, l'hypertrophie, la fibrose et la mort cellulaire. Ces anomalies peuvent conjointement réagir pour ligniter sévèrement l'ensemble du processus de MCV (Tsutsui et al, 2011).

Une combinaison d'antioxydants et d'actions anti-inflammatoires peut éviter ces événements néfastes et atténuer les maladies cardiovasculaires et leurs complications associées. Avec cette théorie, il a été proposé que l'utilisation de certains composés bioactifs provenant de produits naturels puisse défendre un individu contre les MCV. La quercétine (QN) et le lycopène (LY) sont des antioxydants naturels que l'on trouve principalement dans les fruits et les légumes. En combinaison, ils possèdent des propriétés biologiques uniques telles que des propriétés anti-inflammatoires, antihypertensives, antioxydantes et anticancéreuses (Twinkle et al, 2019 ). Bien que QN et LY aient tous deux une norme préclinique remarquable dans le domaine de la pharmacologie, les stratégies visant à inhiber la réponse inflammatoire dans une combinaison de QN et LY (QL) n'ont pas encore été explorées contre les MCV. De plus, l'amélioration des MCV par l'administration thérapeutique de QL pourrait être une approche prometteuse contre les MCV. Avec ces informations, dans la présente étude, une expérience in vivo a été réalisée pour évaluer l'efficacité cardioprotectrice de QL contre la cardiotoxicité induite par l'isoprotérénol (ISO) chez le rat.

2. Matériel et méthodes

2.1.Produits chimiques et réactifs

QN et LY de qualité analytique ont été achetés pour la présente enquête et ont été préparés dans de l'éthanol à 80 %. Les produits chimiques suivants ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich : l'ISO a été dissoute dans une solution saline de tampon phosphate (PBS), 2,3,5-chlorure de triphényltétrazolium (TTC), dodécylsulfate de sodium (SDS),

(CDB), acide méta-1-chloro,2,4-dinitrobenzène 2 phosphorique (MPA), sulfonate de fluorométhane (M2VP), solution de coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E). Tous les autres produits chimiques utilisés dans l'expérience étaient de qualité analytique.

3. Protocole expérimental 3.7. Modèle animalier

Un total de 32 rats Sprague-Dawley (7-9 semaines ; 170-190 g) exempts de toute maladie ont été mis en cage dans un environnement de laboratoire contrôlé et autorisés à boire librement de l'eau et des granulés pour rongeurs. L'acclimatation aux conditions expérimentales a été effectuée pendant sept jours dans l'animalerie avant le début des expériences. Tous les autres protocoles ont été exécutés pour minimiser la souffrance. Le protocole expérimental a été conçu selon les directives internationales et a été approuvé par le Comité institutionnel d'éthique animale (IAEO).

4. Conception expérimentale et administration de médicaments

Les rats SD ont été regroupés en quatre groupes de huit animaux chacun (n{{0}}). La dose efficace de QL a été fixée sur la base des activités de la créatine kinase-MB sérique (CK-MB) dans l'étude préliminaire d'optimisation de la posologie (données non présentées) et elle était de 80 mg/kg de QN avec 3 mg/kg de LY. Les rats du groupe I (témoin) ont reçu 0,1 % de NaCl tout au long de l'expérimentation (10 jours). Les rats du groupe ll ont reçu une administration orale de QL pendant dix jours. Le sixième et le septième jour, les rats des groupes II et IV ont reçu par voie intrapéritonéale de l'isoprotérénol (100 mg/kg pc). De plus, les rats du groupe IV ont reçu QL simultanément comme dans le groupe II. Voici les informations sur le groupe attribué :

Groupe 1 : Contrôle (0.1 % de NaCl)

Groupe II : QL(Quercétine [QN] 80 mg/kg et lycopène LY] 3 mg/kg p.0.)

Groupe I : isoprotérénol (ISO ; 100 mg/kg ip) Groupe IV : ISO plus QL (comme dans le groupe Ⅲl et le groupe II) Les poids corporels des rats ont été enregistrés quotidiennement jusqu'à la fin de l'expérimentation. Au dixième jour, tous les animaux ont été sacrifiés par décapitation cervicale sous anesthésie au pentobarbital sodique (40 mg/kg). Des échantillons de sang et des tissus cardiaques ont été rapidement préparés pour diverses analyses.

5. Évaluation des indices d'organes (poids du cœur au poids corporel) chez des rats expérimentaux Des échantillons de tissu cardiaque ont été lavés avec du chlorure de potassium glacé (KCl) et ont été buvardés avec du papier filtre pour une sécheresse complète et pesés. Les indices d'organes (poids du cœur par rapport au poids corporel) ont été calculés à l'aide de ces valeurs.

6. Évaluation des marqueurs biochimiques sériques chez les rats expérimentaux

Après décapitation, des échantillons de sang ont été prélevés pour la préparation d'échantillons de sérum par centrifugation. Les activités de l'enzyme marqueur cardiaque sérique (CK-MB), de la troponine cardiaque T (TROP) et de la lactate déshydrogénase (LDH) ont été déterminées par les méthodes d'Okinaka et al. [1957]. Les activités de l'aspartate transaminase sérique (AST) et de l'alanine aminotransférase (ALT) ont été réalisées par la méthode de Reitman et Frankel [1961]. Toutes les analyses ont été réalisées à l'aide de kits de dosage et selon les instructions du protocole du fabricant. Les valeurs d'absorbance ont été enregistrées à l'aide d'un lecteur de microplaques. La protéine totale dans les échantillons a été déterminée par la méthode de Lowry et al. [1951].

7. Évaluation des marqueurs de stress oxydatif à l'aide d'homogénat de tissu sérique et cardiaque chez des rats expérimentaux MDA :

La teneur en malondialdéhyde (MDA) a été analysée pour les produits de la substance réactive à l'acide thiobarbiturique (TBARS) dans le sérum et l'homogénat de tissu cardiaque. La préparation des homogénats de tissu cardiaque a été effectuée en homogénéisant chaque échantillon de cœur, puis en centrifugeant à basse vitesse pendant 30 minutes. Pour le TBARS, les surnageants et le sérum récupérés ont été ajoutés avec 0,1 ml de SDS à 8,1 %, 1 ml d'acide acétique à 20 % et 1 ml de TBA à 8 %. Le mélange réactionnel a été chauffé pendant une heure. Après incubation, les tubes ont été refroidis et encore centrifugés pendant 15 minutes. Le surnageant a été utilisé pour la mesure d'absorbance à une longueur d'onde de 532 nm. Les taux de TBARS ont été exprimés en nmol de MDA par litre dans le sérum et en nmol de MDA par gramme dans le tissu cardiaque.

SGSG :

Le taux de GSSG a été déterminé selon la méthode décrite par Li et al. [2012] avec une modification. Pour la détermination du GSSG, l'échantillon d'essai a été mélangé avec du MPA et du M2VP pour une oxydation supplémentaire. Les valeurs d'absorbance du mélange d'échantillons ont été déterminées à 370 nm et exprimées en nmol/g de tissu.

8. Évaluation de la concentration de myoglobine (MYO) chez les rats expérimentaux

Pour la détermination de la concentration de MYO, des échantillons de cœur ont d'abord été fixés dans du paraformaldéhyde puis dans une solution de glutaraldéhyde pendant 15 minutes. Ensuite, les échantillons ont été incubés pendant 1 h dans du tampon Tris/KCl 80 mM, de l'O-toluidine, de l'éthanol à 90 % et de l'hydroperoxyde de tert-butyle à 70 % à 50 °C. Ensuite, l'absorbance a été mesurée à 436 nm et exprimée en ug/L.

9. Évaluation des antioxydants enzymatiques et des antioxydants non enzymatiques chez les rats expérimentaux

Les surnageants de l'homogénat tissulaire ont été utilisés pour les déterminations des activités des enzymes antioxydantes.

Superoxyde dismutase (SOD):

La valeur de SOD a été mesurée selon la méthode de Marklund et Marklund [1974]. Principalement, la concentration de SOD a été déterminée sur sa capacité à empêcher la réduction médiée par le superoxyde. Une unité de SOD a été supposée comme activité enzymatique pour inhiber 50 % de l'oxydation du pyrogallol. L'échantillon d'essai a été mélangé avec la solution préparée et le tampon. Le mélange a été bien mélangé avant incubation à 37 degrés pendant 20 minutes. L'absorbance a été enregistrée à 450 nm et l'activité SOD a été exprimée en U/mg de protéine.

Catalase (CAT):

L'activité catalase (CAT) a été déterminée par la méthode d'Aebi [1983]. L'échantillon d'essai a été incubé avec le substrat (H, O et NaCl) à 37 degrés pendant une minute. La réaction enzymatique a été stoppée lors de la formation d'un complexe jaune dans la solution et l'absorbance a été mesurée à 405 nm. Une unité de CAT a été définie comme l'activité enzymatique essentielle pour décomposer 1 uM de H2O2 par minute. L'activité de l'enzyme CAT a été exprimée en μM de H2O2 décomposé

par minute par mg de protéines.

Glutathion Peroxydase (GPx):

L'activité de la glutathion peroxydase (GPx) a été complétée selon la méthode décrite par Flohe et Gunzler [1984]. Le surnageant a été mélangé avec du PBS, du GSH, de l'azoture de sodium et de l'HO pour obtenir 1 ml du mélange réactionnel. Après incubation pendant 15 minutes à 37 degrés, la réaction a été arrêtée en ajoutant 5 % de TCA. Les tubes ont été centrifugés à 1000 g pendant 8 min et le surnageant résultant a été obtenu. L'absorbance a été mesurée à 420 nm et l'activité GPx a été exprimée en µM de GSH oxydé par min et par mg de protéine.

Glutathion-S-transférase (GST) :

L'activité totale de la GST a été mesurée selon la méthode de Habig et al. [1974]. L'échantillon de test a été mélangé avec du 1-chloro-2,4-dinitrobenzène(CDNB) et traité avec 10 nM de TCDD pendant 24 h. La conjugaison du CDNB a été mesurée à 340 nm et l'activité a été exprimée en nM de CDNB conjugué par min par mg de protéine.

Glutathion réduit (GSH):

Les niveaux de GSH ont été analysés par la méthode d'Aebi [1983]. L'échantillon d'essai a été dilué avec du tampon phosphate-EDTA et incubé à température ambiante pendant 5 minutes. Après mélange constant et incubation pendant 15 min à température ambiante, la solution a été mesurée à 350 nm et exprimée en mg/dl dans le sérum et en μmol/g dans les tissus.

Vitamine E et vitamine C :

Les niveaux de vitamine E et de vitamine C ont été déterminés par la méthode de Quaife et al. [1949] en utilisant le principe colorimétrique. Un dosage basé sur la diminution de la concentration des tocophérols due à la conversion des ions ferriques en ions ferreux (complexe rouge). L'échantillon d'essai a été additionné d'éthanol et mélangé vigoureusement. Ensuite, le mélange a été mélangé avec du xylène et protégé de la lumière. Après centrifugation pendant 30 minutes, une solution de chlorure ferrique a été ajoutée. Après mélange complet, l'absorbance a été enregistrée à 562 nm et exprimée en mmol par litre pour les deux vitamines.

10. Évaluation des lésions histopathologiques chez les rats expérimentaux

La section de tissu cardiaque a été immergée dans du formol tamponné à 10 % pendant deux jours, puis déshydratée en série dans une série d'éthanol gradué. Après une nouvelle déshydratation avec du formol, les tissus ont été enracinés dans de la paraffine. À l'aide d'un microtome, une section de tissu de 5 μm d'épaisseur a été tranchée et colorée avec H&E pour analyse à l'aide d'un microscope optique. Des coupes de tissus ont été imagées à un grossissement de 40X pour évaluer les changements histopathologiques.

11. PCR quantitative chez des rats expérimentaux Gène Nrf2/HO-1 et ses niveaux d'expression génique associés tels que Nrf2, HO-1, BCl-2, GSTμ, SOD1, SOD2, CAT et NQO1 ont été étudiés par RT-PCR. L'ARN total de l'homogénat tissulaire a été extrait à l'aide du réactif TRIZOL suivi d'un traitement à la DNase-I pour éliminer les traces d'ADN conformément au manuel du fabricant. La pureté de l'ARN extrait a été déterminée par un spectrophotomètre à 260 nm et stockée à -70 degré jusqu'à une utilisation ultérieure. Un ug d'ARN total a été utilisé pour synthétiser l'ADNc en utilisant un kit de synthèse d'ADNc commercial. Les expressions de tous les gènes ont été réalisées à l'aide d'un master mix Maxima SYBR green qPCR. Les données ont été criblées et la normalisation a été effectuée contre le gène GAPDH. Le changement de pli a été calculé à l'aide de la méthode 2-△ACT pour chaque gène. Les amorces utilisées sont listées ci-dessous :

12. Analyse statistique

Les données ont été présentées sous forme de moyenne ± ET pour chaque groupe et ont été calculées à l'aide du progiciel SPSS 17.0. Le niveau de signification a été calculé par le test t de Student avec une analyse posthoc appropriée. AP inférieur ou égal à 0.05 a été considéré comme statistiquement significatif.

Cet article est extrait de LIBYAN JOURNAL OF MEDICINE2021, VOL. 16, 1943924https://doi.org/10.1080/19932820.2021.1943924