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Reprogrammation métabolique rénale médiée par l'IL-22-via PFKFB3 pour traiter les lésions rénales

Wei Chen, et al

Résumé graphique

IL-22 atténueun reinblessurevia la reprogrammation métabolique des TEC rénaux, régule la fonction mitochondriale et la glycolyse dans les TEC endommagés, et atténue l'accumulation de ROS mitochondriales et de mitochondries dysfonctionnelles via l'induction des activités AMPK/AKT et PFBFK3. Améliorantun reinblessureofIL-22 via la régulation du métabolisme, la signalisation pertinente est certifiée dans les modèles animaux de lésions rénales induites par le cisplatine et de néphropathie diabétique.

Résumé

Les lésions rénales déclenchent la détérioration des états métaboliques dans les cellules tubulaires qui conduisent au développement de l'insuffisance rénale terminale (ESTD). L'interleukine-22 (IL- 22) est un antidote thérapeutique efficace pourun reinblessurevia la promotion de la récupération rénale, mais on sait peu de choses sur les mécanismes moléculaires sous-jacents. Ici, nous fournissons d'abord la preuve que IL-22 atténueun reinblessurevia la reprogrammation métabolique des cellules épithéliales tubulaires rénales (CET). Plus précisément, nos données suggèrent que l'IL-22 régule la fonction mitochondriale et la glycolyse dans les CET endommagés. D'autres observations indiquent que l'IL-22 atténue l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) mitochondriales et de mitochondries dysfonctionnelles via l'induction de la signalisation AMPK/AKT et des activités PFBFK3. Chez la souris, amélioration deun reinblessureet la nécrose et l'amélioration des fonctions rénales via la régulation de ces signaux métaboliques pertinents et l'aptitude mitochondriale de l'IL recombinant -22 sont certifiés dans les modèles animaux de lésions rénales induites par le cisplatine et de néphropathie diabétique (DN). Pris ensemble, nos résultats dévoilent de nouvelles connaissances mécanistes sur les effets protecteurs de l'IL-22 sur les reins et mettent en évidence les opportunités thérapeutiques de l'IL-22 et des régulateurs métaboliques impliqués dans diverses maladies rénales.

MOTS CLÉSinterleukine-22,un reinblessure, reprogrammation métabolique, dysfonctionnement mitochondrial

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1. INTRODUCTION

Aiguun reinblessure(IRA), un problème de santé publique courant associé à une mortalité et une morbidité élevées, affecte des millions de patients hospitalisés dans le monde et montre une incidence en augmentation rapide.1–3 La physiopathologie sous-jacente de l'IRA n'est pas entièrement comprise mais implique les dommages et l'apoptose des cellules épithéliales tubulaires (CET), en particulier dans le tubule proximal.4–7 Plusieurs types de littérature soutiennent que leurs dommages graves et soutenus provoquent souvent une réparation tissulaire incomplète et inadaptée, entraînant une réponse inflammatoire, une dégénérescence tubulaire, une fibrose rénale et une progression éventuelle vers insuffisance rénale terminale (ESTD).8–10 Malheureusement, à part les soins de soutien basés sur la dialyse, aucun traitement bien établi pourun reinblessuresont disponibles. Par conséquent, un traitement proactif est indispensable pour réduire les souffrances qu'il cause aux patients et les lourdes charges financièresun reinblessureaux individus et à la société.

L'interleukine-22 (IL-22), un membre important des cytokines de la famille IL-10, a récemment attiré énormément d'attention en tant qu'agent de survie dans de nombreux troubles provoqués par des lésions épithéliales.11–13 IL -22 suscite la protection des tissus et l'homéostasie principalement via l'activation de la voie de signalisation STAT3 et la promotion de la prolifération épithéliale. , et le traitement avec IL-22 peut protéger contre les lésions épithéliales rénales et accélérer la régénération tubulaire.16,17 Cependant, bien que de nombreuses preuves indiquent que l'IL- 22 est un antidote thérapeutique efficace pourun reinblessure, on sait peu de choses sur les mécanismes sous-jacents de la récupération des TEC induite par IL- 22-. Comprendre la base moléculaire de l'IL-22 est important à la fois pour explorer comment l'IL-22 agit pour inhiber l'IRA ou l'ESTD et pour découvrir les modificateurs moléculaires ainsi que les processus cruciaux impliqués dans la prévention des lésions rénales.

La réparation des reins après les dommages est un processus métaboliquement dépendant et compliqué.18 Des preuves récentes indiquent que les signatures métaboliques cellulaires peuvent réguler la survie et la plasticité des cellules rénales et ainsi fournir des informations mécanistes utiles sur la façon dont les processus métaboliques contrôlent la réparation des tissus.19,20 Plus précisément, ces résultats montrent que la reprogrammation métabolique par PGC1 ou le système S-nitroso-CoA réductase protège contreun reinblessure. Mécaniquement, l'augmentation de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) peut favoriser la croissance et les voies de signalisation défensives ou peut répondre aux demandes énergétiques plus élevées de la mitose et de la biosynthèse anabolique pendant la réparation des organes.19,21 Récemment, nos études ont démontré que l'IL-22 atténue dysfonctionnement mitochondrial dans le foie, qui implique les processus métaboliques cellulaires.22,24 Ainsi, nous nous demandons si l'IL-22 protège contre les lésions rénales et l'apoptose en régulant leurs états métaboliques. Pour déterminer les mécanismes de la réparation rénale médiée par l'IL-22, nous traitons les cellules épithéliales tubulaires proximales humaines (PTEC) avec une stimulation par le stress. Nous suggérons que l'IL-22 entraîne une reprogrammation métabolique pour améliorer la glycolyse et l'OXPHOS, qui préviennent le dysfonctionnement des TEC. Nous démontrons en outre que IL-22 a induit ce programme via l'activation de la signalisation AMPK/AKT et de ses modificateurs moléculaires pour atténuer le dysfonctionnement mitochondrial. Nos observations mettent en lumière la régulation des états métaboliques pour le traitement et la prévention des maladies rénales et fournissent de nouvelles informations pour développer de nouvelles interventions efficaces pour les lésions organiques en général.

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2. MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1 Réactifs

L'oligomycine, la roténone et le cyanure p-trifluorométhoxy phénylhydrazone (FCCP) ont été obtenus auprès de Sea Horse Biosciences; l'IL -22 recombinante a été fournie par Novoprotein (Chine) ; cisplatine (Crisp.), MitoTrackerGreen, LY294002, 5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1′,3,3′-tétraéthylbenzimidazolylcarbocyanineiodure (JC-1) et le composé C ont été obtenus de Beyotime Biotechnology (Chine); les anticorps ciblant Glut1, -Actin, p-AMPK, AMPK et GAPDH ont été achetés auprès d'Abcam ; les anticorps pour STAT3, p-STAT3 (Y705), AKT, p-AKT (S473), PFKFB3 et Caspase -3 ont été achetés auprès de Cell SignalingTechnology ; la rapamycine, l'acide palmitique (Palm.), le Z-VAD-FMK et le glucose ont été obtenus auprès de Sigma-Aldrich ; MitoSOX, Hoechst33342, MitoTracker Red et PKH26 ont été obtenus auprès d'Invitrogen.

2.2 Culture cellulaire

La cellule épithéliale du tubule proximal humain (HK{{0}}) a été obtenue auprès de la banque cellulaire de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire de Shanghai, Académie chinoise des sciences, et maintenue selon les protocoles standard. HK-2 a été ensemencé dans des plaques à six puits (1 × 106 cellules/puits) ou des 96-plaques à puits (1 × 105 cellules/puits) et cultivées dans un milieu RPMI1640 à 90 % (Gibco) additionné de 100 U/ml de pénicilline, 100 µg/ml de streptomycine et 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Gibco). Nous avons d'abord incubé HK-2 avec IL-22 (0,5 µg/ml) pendant 0,5 h, puis 50 mM de d-glucose ou 5 µg/ml de cisplatine ou 0,2 mM d'acide palmitique ou ou 4 µM de doxorubicine (DOX ) pendant 24h. Dans certains cas, les cellules ont été cultivées en présence de Z-VAD-FMK (10 µM), de composé C (5 µM), de LY294002 (20 µM) ou de rapamycine (50 nM) pendant les durées indiquées.

2.3 Expériences sur les hippocampes

Nous avons analysé les TEC à l'aide d'un analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF96 pour les changements du taux d'acide extracellulaire (ECAR) et du taux de consommation d'oxygène (OCR). En bref, HK-2 (1 × 105) a été cultivé sur des plaques 96-well Seahorse pendant la nuit. Ensuite, nous avons lavé les cellules avec un milieu de dosage hippocampe contenant 1 mM de pyruvate, 10 mM de glucose et 2 mM de glutamine (ou sans glucose pour tester ECAR) dans une atmosphère sans CO2 à 37◦C pendant {{18 }}.5h. Les données expérimentales ont été enregistrées après l'injection des inhibiteurs mentionnés ci-dessous à une concentration optimale de FCCP (1,0 µM), oligomycine (1,0 µM), roténone/antimycine A (0,5 µM), 2-DG (50 mM) ou du glucose (10 mM).

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2.4 Souris et modèles animaux

Des souris mâles BALB/c (6 à 8 semaines) ont été achetées chez Slaccas Experimental Animal Co. (Shanghai, Chine). Les souris Db/db et Db/m ont été fournies par le Model Animal Research Center de l'Université de Nanjing (Nanjing, Chine). Toutes les souris ont été conservées dans des installations exemptes d'agents pathogènes spécifiques (SPF) et cultivées selon des protocoles standard. Pour le modèle AKI, les souris BALB/c ont reçu du cisplatine (20 mg/kg) ou un contrôle salin par injection intrapéritonéale. Les souris Db/db ont été nourries avec un régime riche en graisses (HFD) aux moments indiqués pour induire une néphropathie diabétique (DN). Les souris Db/m ont été nourries avec des régimes alimentaires comme groupe témoin. Dans les expériences animales AKI, IL-22 a été injecté par voie intrapéritonéale à la dose de 0,5 mg/kg/jour ou 1,5 mg/kg/jour pendant 4 jours consécutifs. Dans des expériences sur des animaux DN, IL-22 a été injecté par voie intrapéritonéale à la dose de 2,5 mg/kg deux fois par semaine pendant huit semaines consécutives. Les souris témoins ont reçu la quantité appropriée de PBS. Nos procédures expérimentales animales ont été réalisées selon les protocoles évalués et approuvés par le Comité d'éthique des soins et de l'utilisation des animaux de l'École de pharmacie de l'Université de Fudan. La coloration immunohistochimique, la mesure du potentiel de la membrane mitochondriale, la coloration histologique et les espèces réactives de l'oxygène (ROS) des coupes rénales ont été réalisées comme décrit précédemment.22–24

2.5 PCR en temps réel

Nous avons obtenu l'ARN total par des réactifs TRNzol (Beyotime Biotechnology, Chine) à partir d'échantillons de cellules ou de tissus, puis les avons transcrits en ADNc à l'aide d'un kit de test de transcriptase inverse MMLV (Beyotime Biotechnology). Le niveau d'expression de l'ARNm a été analysé par les instruments de PCR en temps réel (BioRad) à l'aide du kit de test SYBR green qPCR-mix (Beyotime Biotechnology) et standardisé sur GAPDH.

2.6 Cytométrie en flux

Les cellules rénales ont été cultivées et traitées comme décrit ci-dessus. Les colorations MitoSOX (ROS mitochondrial), MitoTracker Green (masse mitochondriale totale) et MitoTracker Red (potentiel de membrane mitochondriale) ont été réalisées conformément aux instructions du fabricant et aux recherches précédentes.22–24 Nous avons obtenu les résultats par le Beckman Coulter Flow Cytometer et le Logiciel CytExpert (BD Biosciences).

2.7 Absorption de glucose

Nous avons mesuré les concentrations de glucose dans le surnageant de culture cellulaire par un test d'absorption de glucose selon le protocole du fabricant et des recherches antérieures (GAHK20; Sigma). La normalisation des résultats a été effectuée en fonction du nombre de cellules.

2.8 Renversement de gène

Nous avons utilisé le petit ARN interférent (siRNA; RiboBio, Chine) pour faire tomber les gènes spécifiques. Tout d'abord, Lipofectamine RNAiMAX et siRNA (100 pmol) ont été doucement mélangés par pipetage et incubés à 37◦C pendant 0,5 h. Ensuite, nous avons remplacé le milieu de culture cellulaire standard par un cocktail de transfection et incubé les cellules pendant 6 h pour la transfection du gène siRNA. Ensuite, nous avons remplacé le cocktail de transfection par un milieu de culture cellulaire frais. Après 48 h, les cellules rénales ont été incubées avec de l'IL-22 pour d'autres études.

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2.9 Transfert Western

Nous avons extrait les protéines totales des cellules ou des tissus par un tampon de lyse RIPA (Beyotime Biotechnology, Chine). Ensuite, nous avons collecté les lysats par centrifugation à 4◦C à 12 000 rpm pendant 10 min. Par la suite, les lysats ont été chauffés avec les tampons d'échantillon à 100 ° C pendant 15 min, soumis à une électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE) et électrotransférés sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (Millipore, Allemagne). Les membranes ont ensuite été bloquées avec 5% d'albumine de sérum bovin (BSA) pendant 2 h et co-incubées avec des anticorps primaires à 4°C pendant la nuit. Après trois lavages, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort (CST, USA). Les transferts de protéines ont été visualisés par le système d'imagerie par chimioluminescence améliorée.

2.10 Immunofluorescence

Les cellules rénales ont été fixées par 3 % à 4 % de paraformaldéhyde et perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100. Ensuite, nous avons bloqué les cellules avec 5 % de BSA pendant 2 h. Les cellules ont été incubées pendant une nuit avec l'anticorps anti-GLUT1 à 4°C, lavées quatre fois, puis colorées avec PKH26. Ensuite, les cellules rénales ont été colorées avec Hoechst 33342 et montées sur des lames. Les données ont été obtenues par microscopie confocale.

2.11 ARN-seq et bioinformatique

Les échantillons de TEC (2 × 107) ont été lysés et l'ARN total a été extrait à l'aide du mini kit RNeasy, conformément aux protocoles du fabricant (Beyotime, Shanghai, Chine). Le séquençage de l'ARN eucaryote a été réalisé en utilisant la technologie de séquençage de nouvelle génération (NGS) sur le système de séquençage Illumina HiSeq, fournissant une longueur de lecture de base 50-. L'alignement des lectures de séquençage a été effectué à l'aide de TopHat v2.0.12 par rapport à l'assemblage UCSC mm10. L'analyse de l'expression différentielle a été calculée à l'aide du package DESeq2 (http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html) et les analyses de signification statistique ont été effectuées dans R (v3.1.1 ; http://www .r-project.org/). La surreprésentation des voies a été réalisée à l'aide du package R ReactomePA.

2.12 Statistiques

Les données ont été exprimées en moyenne ± écart type (SD) et ont été présentées à l'aide de GraphPad Prism 5.0. Pour les résultats comparant deux groupes ou plus, les différences ont été calculées à l'aide du test t de Student ou de l'analyse de variance à un facteur (ANOVA) : ***p < 0.00="" 1,="" **p="">< 0,01="" et="" *p=""><>

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3. RÉSULTATS

3.1 IL-22 préserve le métabolisme cellulaire dans les CET

Comme il a été suggéré que les mitochondries sont des organites importants qui intègrent le métabolisme cellulaire et les processus apoptotiques, nous avons évalué la fonction mitochondriale dans les CET stimulés avecun reinblessurefacteurs et traités avec IL -22.25 Comme le montre la figure 1A–D, le taux de consommation basale d'oxygène mitochondrial (OCR), la capacité respiratoire maximale (MRC) et la respiration ont été bloqués de manière substantielle dans les TEC dans des situations de stress. Notamment, ces anomalies ont été largement prévenues par le traitement IL- 22. La glycolyse dans les TEC endommagés, mise en évidence par le taux d'acidification extracellulaire (ECAR), a également été nettement restreinte, par rapport à IL -22 plus TEC stimulés (Figure 1B et E). Nous avons en outre démontré que la phosphorylation oxydative compromise (OXPHOS) et la glycolyse dans les CET endommagés n'étaient pas les effets secondaires de l'apoptose via le co-traitement d'un inhibiteur de pan-caspase (Figure S1). Et les effets réparateurs médiés par l'IL-22-sur les défauts métaboliques étaient spécifiques aux TEC rénaux (Figure S2). De plus, l'IL-22 a favorisé l'OXPHOS et la glycolyse des cellules HK2 en l'absence de stimuli, indiquant que les effets de l'IL-22 sur les voies métaboliques n'étaient pas spécifiques aux TEC endommagés (Figure S3). De plus, nos résultats ont également indiqué que IL-22 favorisait l'expression et la translocation de IL-22R1. Pendant ce temps, la phosphorylation de STAT3 et les effets de reprogrammation métabolique de IL-22 ont été complètement désarmés par le renversement de IL-22R1 (Figure S4). Ces résultats suggèrent que IL-22 a restauré l'état métabolique des TEC en activant directement IL-22R1. Parce que plusieurs éléments de preuve avaient suggéré que Glut1 jouait un rôle principal dans la glycolyse et l'homéostasie du glucose,26 nous avons donc demandé si IL-22 affectait la translocation ou l'expression de Glut1. Comme prévu, nous avons démontré que IL-22 non seulement favorisait la translocation de Glut1 à la surface de la membrane cellulaire (PKH26) et l'expression de Glut1, mais augmentait également l'absorption de glucose (Figure 1F et G). Dans l'ensemble, ces observations ont indiqué que l'IL-22 pourrait améliorer l'OXPHOS et la glycolyse dans les TEC blessés.

FIGURE 1 IL-22 préserve la forme mitochondriale et la glycolyse dans les TEC. (A et B) Nous utilisons l'analyseur de flux extracellulaire Seahorse XF96 pour tester les changements dans le taux d'acide extracellulaire (ECAR) et le taux de consommation d'oxygène (OCR) des TEC. OCR et ECAR dans des TEC incubés avec 50 mM de glucose, ou 5 µg/mL de cisplatine, ou 0.2 mM d'acide palmitique, ou 4 µM de DOX en présence ou en l'absence d'IL{{8} }. (C) Capacité respiratoire maximale (MRC) des TEC évaluée par des changements en temps réel dans l'OCR. (D et E) Courbes dans l'OCR et l'ECAR des TEC après incubation avec l'oligomycine, le FCCP, le glucose, la roténone et le {{10}}DG. (F) Localisation et expression du nucléaire (bleu), Glut1 (vert) et de la membrane plasmique (rouge) dans les TEC. (G) Consommation de glucose dans les CET après traitement IL-22 pendant 24 h. n=3 ; barres d'échelle, 20 µm ; test t de Student (non apparié); ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.2 IL-22 améliore l'accumulation de mitochondries dysfonctionnelles dans les CET via l'activation de la mitophagie

formation de LC3 puncta dans les CET après exposition à des stimuli (figure 2F). Nous avons ensuite appauvri la mitophagie pour évaluer sa fonction sur le métabolisme des cellules tubulaires via siRNA-ATG5 (Figure S6). Nos données suggèrent que l'épuisement de la mitophagie dans les TEC inhibe de manière significative les effets protecteurs de l'IL-22 dans la préservation de la forme mitochondriale (figure 2E), indiquant que l'IL-22 prévient le dysfonctionnement mitochondrial via l'activation de la mitophagie.

FIGURE 2 IL-22 inhibe le dysfonctionnement mitochondrial et l'accumulation mitochondriale de ROS via l'induction de la mitophagie. (A) La masse mitochondriale a été colorée et évaluée par MitoTracker Green et cytométrie en flux. Le ROS mitochondrial a été évalué dans les TEC colorés avec MitoSOX (B). Le potentiel de la membrane mitochondriale a été évalué dans les TEC colorées avec MitoTracker Green et MitoTracker Red (C); L'accumulation mitochondriale de ROS a été évaluée par MitoTracker Green et MitoSOX (D). (E) Les résultats de l'image confocale suggèrent une production de ROS mitochondriale marquée avec MitoSOX. (F) Des images microscopiques représentatives ont indiqué la formation de ponctuations LC3-GFP en présence ou en l'absence de TEC IL-22 stimulés comme (A) pendant 24 h. (E) OCR a été évalué en présence ou en l'absence d'IL-22 et d'ARNsi-ATG5 pendant 24 h. n=3 ; test t de Student (non apparié); ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.3 IL-22 maintient l'intégrité mitochondriale des TEC via l'activation de la signalisation AMPK/AKT

La signalisation AMPK, en tant que plaque tournante de signalisation clé reliant la survie cellulaire et le métabolisme, le métabolisme contrôlé du glucose, la synthèse des lipides et la fonction mitochondriale.28 Selon l'effet protecteur rénal de l'interleukine -22 médié par la reprogrammation métabolique des TEC, nous avons évalué si IL-22 a régulé l'intégrité mitochondriale via l'activation de la transduction de signalisation AMPK. Nous avons constaté que IL-22 augmentait l'activité de la transduction de signalisation STAT3/AMPK/AKT dans les TEC blessés, comme en témoigne la phosphorylation de STAT3, AMPK et AKT (figure 3A). De plus, ces processus ont été bloqués dans les cellules tubulaires dépourvues de STAT3, ce qui a démontré que IL-22 régulait la signalisation AMPK/AKT via STAT3 (Figure 3B et C ; Figure S7). Nous avons en outre incubé des TEC avec le composé C et LY294002 pour inhiber directement les transductions de signalisation AMPK/AKT, puis évalué leurs fonctions mitochondriales et leurs états métaboliques. Les résultats ont révélé que le co-traitement avec ces inhibiteurs de signalisation empêchait de manière significative l'amélioration de l'OXPHOS et du flux glycolytique induits par le traitement à l'IL -22 (Figure 3D – I), ce qui suggérait que l'IL -22 favorisait le métabolisme des TEC via l'activation de l'AMPK. voie de signalisation /AKT.

FIGURE 3 L'induction de la signalisation AMPK/AKT par IL-22 maintient la forme mitochondriale. Les CET ont été stimulés avec du glucose 50 mM, ou du cisplatine 5 µg/mL, ou de l'acide palmitique 0.2 mM, ou du DOX 4 µM en présence ou en l'absence d'IL-22, composé C , ou LY294002 pour les heures indiquées. (A et B) L'activation de la voie de signalisation AMPK/AKT dans les TEC ou les TEC STAT3-WT et STAT3–KD a été évaluée par analyse Western blot. (C et D) Les modifications de l'OCR et de l'ECAR des TEC ont été analysées. (E) L'activation de la voie de signalisation AMPK/AKT dans les TEC a été évaluée par analyse Western blot. (F – I) Les modifications de l'OCR et de l'ECAR des TEC ont été mesurées dans les TEC par rapport aux TEC traités avec le composé C et le LY294002. test t de Student (non apparié); n=3 ; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.4 IL-22 préserve le métabolisme cellulaire et l'intégrité mitochondriale des TEC via l'induction de PFKFB3

De plus, pour explorer comment la forme physique et le métabolisme mitochondriaux des TEC ont été améliorés, nous avons utilisé l'analyse de séquençage d'ARN (ARN-seq) pour évaluer l'expression des gènes après une blessure par stimuli et un traitement IL-22. Nous avons démontré que plusieurs gènes ont été modifiés de manière significative dans les TEC après IL -22 incubation (figure 4A). À l'aide des bases de données disponibles, l'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes de ces gènes régulés à la hausse a été réalisée, ce qui a suggéré un enrichissement remarquable des gènes dans la voie de signalisation AMPK et la voie de signalisation des cibles MYC (Figure S8). Notamment, PFKFB3 a été significativement induit par IL-22 parmi les gènes au coursun reinblessurestimulation des facteurs (figure 4A). Ces observations ont également été indiquées par des images confocales, Q-PCR et western blot. L'expression élevée de PFKFB3 dépendait de la signalisation AMPK/AKT (Figure 4B et C ; Figure S9).

Des études antérieures avaient suggéré que PFKFB3 pourrait être régulé par de nombreuses transductions de signalisation pour accélérer la régénération et la réparation épithéliales après une blessure.29,30 Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que IL -22 induisait PFKFB3 pour préserver le métabolisme cellulaire des TEC et maintenir leur aptitude mitochondriale . Nous avons observé que l'inhibition de la signalisation AMPK/AKT réduisait l'expression de PFKFB3 (Figure 4D). Nous avons donc réduit au silence PFKFB3 pour étudier plus avant ses fonctions dans les TEC après incubation IL-22. Nos résultats ont indiqué que PFKFB3 réduit au silence atténuait les effets de reprogrammation métabolique de l'IL -22 sur la restauration de l'ECAR et de l'OCR (Figure 4E et F) et empêchait l'absorption de glucose ainsi que les mitochondries dysfonctionnelles (Figure 4G et H). De plus, nous avons en outre démontré que les effets de reprogrammation métabolique de IL-22 étaient complètement désarmés par STAT3-knockdown tandis que la surexpression de PFKFB3 pourrait être en mesure de sauver ces phénotypes, suggérant que IL-22 a restauré le état métabolique des cellules épithéliales rénales endommagées via le ciblage direct de la signalisation STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3 (Figure S10). Pris ensemble, ces résultats ont indiqué que l'activation de PFKFB3 jouait un rôle important dans la forme physique des mitochondries et l'élimination des mitochondries dysfonctionnelles aprèsun reinblessure.

FIGURE 4 IL-22 maintient l'intégrité mitochondriale et le métabolisme cellulaire des TEC via l'induction de PFKFB3. (A) Volcano plot pour l'expression des gènes dans les CET stimulés avec du glucose, ou du cisplatine, ou de l'acide palmitique, ou du CCl4 en présence ou en l'absence d'IL-22 pendant 24 h. (B) Les données microscopiques confocales ont démontré une surexpression de PFKFB3 dans les TEC après un traitement IL-22, qui nécessitait l'activation de la signalisation AMPK/AKT. (C) Les résultats de la PCR en temps réel indiquent que l'IL-22 a induit une surexpression de PFKFB3 dans les TEC, qui pourrait être inhibée par le bloc de signalisation AMPK/AKT. (D) L'activation de la voie de signalisation AMPK/AKT/PFKFB3 dans les TEC après traitement avec le composé C et LY294002. (E et F) ECAR et OCR dans les TEC en présence ou en l'absence d'IL-22, ou de si-PFKFB3 pendant 24 h. (G) Consommation de glucose dans les TEC après traitement IL-22 ou si-PFKFB3 pendant 24 h. (H) Le dysfonctionnement mitochondrial a été évalué dans les TEC colorés avec MitoTracker Red et MitoTracker Green. test t de Student (non apparié); n=3 ; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.5 IL-22 atténue les lésions rénales dans l'IRA induite par le cisplatine en supprimant l'accumulation rénale de ROS et le dysfonctionnement mitochondrial

Pour tester notre hypothèse selon laquelle l'IL-22 régulait les profils métaboliques rénaux pour supprimer les lésions des tubules rénaux in vivo, nous avons initialement évalué les fonctions rénales chez les souris traitées à l'IL-22- qui avaient reçu du cisplatine (Figure 5A). Quatre jours après l'injection de cisplatine, IL-22 a non seulement considérablement réduit les dommages cellulaires tubulaires et les hémorragies ; leur dysfonctionnement rénal avait également été significativement atténué, ce qui a été évalué par les taux sériques d'azote uréique sanguin (BUN) et de créatinine (Cr) (Figure 5B – D). Nous avons en outre suggéré que IL-22 empêchaitun reinblessureen améliorant la régénération rénale et en activant la signalisation AMPK/AKT et PFKFB3 (Figure 5E et F ; Figure S11). Ensuite, nous avons utilisé MitoSOX (colorant ROS spécifique aux mitochondries) et JC-1 (colorant dépendant du potentiel de la membrane mitochondriale) pour évaluer le dysfonctionnement mitochondrial impliqué dans le métabolisme cellulaire et l'apoptose. Dans les sections de rein de souris qui avaient été traitées avec du cisplatine, il y avait des accumulations comparables de ROS. Il convient de noter qu'à quatre jours après le traitement IL -22, les niveaux de ROS ont été nettement réduits dans les reins blessés par rapport aux ROS de souris après traitement au PBS (figure 5G). Prises ensemble, ces observations ont fourni la preuve que l'IL -22 jouait un rôle protecteur dans l'IRA induite par le cisplatine via le contrôle de la forme mitochondriale.

FIGURE 5 L'IL-22 atténue les lésions rénales dans l'IRA induite par le cisplatine via l'inhibition de l'accumulation rénale de ROS et des mitochondries dysfonctionnelles. (A) Diagramme schématique des protocoles expérimentaux pour évaluer les effets protecteurs de l'IL-22 dans le cisplatine (20 mg/kg) induit des lésions rénales. PBS comme groupe témoin véhicule et N-acétyl-l-cystéine (NAC, 150 mg/kg) comme groupe témoin positif. (B et C) Les taux sériques de BUN, les taux sériques de Cr, le poids des reins et le poids corporel ont été évalués. Des images représentatives HE (D), coloration Ki-67 (E), MitoSOX (G) et JC{{10}} (G) des sections de rein ont été présentées. (F) La comparaison de l'activation de STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 dans les extraits de rein des souris traitées à l'IL-22- a été évaluée par western blot. test t de Student (non apparié); n=3 ; ***p < 0,001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

3.6 IL-22 améliore les lésions rénales induites par le diabète via l'inhibition du dysfonctionnement mitochondrial grâce à l'activation de la signalisation AMPK/AKT et de PFKFB3

Nous et d'autres avions démontré que l'IL-22 pouvait exercer un pouvoir protecteur dans la néphropathie diabétique (DN), qui était la principale cause de l'ESTD.31–33 Pour étudier plus avant les mécanismes sous-jacents, nous avons nourri des souris db/db avec des régimes gras (HFD), puis les a traités avec IL -22 (2,5 mg/kg, IP) pendant 8 semaines (figure 6A). Lorsque les souris ont été nourries uniquement avec du HFD, nous avons constaté une fibrose tubulaire rénale et une dilatation, en plus de l'atrophie. En revanche, lorsque les souris ont été traitées avec IL -22, la fibrose rénale et l'histopathologie ont été significativement améliorées, ainsi que les fonctions rénales. Des fonctions rénales améliorées ont également été démontrées par une diminution des taux sériques de Cr, de BUN et des taux d'albumine urinaire totale / 24 h (EAU) (Figure 6B – E). Pour étudier si ces activités étaient associées aux mitochondries, nous avons évalué la fonction mitochondriale impliquée dans le métabolisme cellulaire et l'apoptose. Les résultats ont indiqué que les niveaux accrus de ROS mitochondriales et les mitochondries dysfonctionnelles accumulées étaient significativement atténués par le traitement IL-22 (Figure 6F et G). Pour étudier plus avant si les fonctions protectrices de l'IL-22 dans le rein étaient médiées par PFKFB3, nous avons injecté à des souris un adénovirus shRNA PFKFB3 pour renverser PFKFB3. Nos données ont indiqué que les effets bénéfiques de l'IL -22 sur les lésions rénales induites par HFD, la nécrose, la stéatose, le dysfonctionnement mitochondrial et l'accumulation de ROS et l'activation des voies de signalisation associées étaient significativement bloqués par le renversement de PFKFB3 (Figure 6B – G) . L'augmentation de l'expression de la signalisation AMPK/AKT a également été observée après traitement avec IL-22 (Figure 6H). Parallèlement à l'atténuation du dysfonctionnement rénal, les expressions de PFKFB3 et d'enzymes importantes du métabolisme cellulaire ont également été améliorées dans les reins des souris traitées à l'IL -22- (Figure 6H et I). De plus, l'analyse histologique des principaux organes n'a indiqué aucune lésion morphologique après l'injection d'IL-22, ce qui suggère que l'IL-22 pourrait être un antidote sûr sans effets secondaires importants ni réactions toxiques pourun reinblessuretroubles (Figure 12S). Dans l'ensemble, nos données suggèrent que l'IL- 22 atténue les lésions rénales via l'activation de la transduction de signalisation AMPK/AKT, l'inhibition de l'accumulation de ROS et la régulation de la fonction mitochondriale via PFKFB3.

FIGURE 6 IL-22 atténue les lésions rénales induites par le diabète grâce à la signalisation AMPK/AKT et à l'inhibition des mitochondries dysfonctionnelles via l'activation de PFKFB3. (A) Schéma de principe des protocoles expérimentaux pour évaluer les effets protecteurs de l'IL-22 dans les lésions rénales induites par le diabète. Db/m en tant que groupe témoin de véhicules. (B – D) Les taux sériques de BUN, les taux sériques de Cr et les EAU ont été évalués. Des images représentatives HE (E), MitoSOX (F) et JC-1 (G) des coupes rénales ont été présentées. (H et I) La comparaison de l'activation de STAT3/AMPK/AKT/PFKFB3 dans des extraits de rein de souris traitées à l'IL -22- a été évaluée par western blot. test t de Student (non apparié); n=3 ; ***p < 0.001,="" **p="">< 0,01,="" *p=""><>

4. DISCUSSION

L'IL-22 est sécrétée par les cellules immunitaires, telles que les cellules NK, les neutrophiles, les cellules lymphoïdes innées (ILC) et les cellules T, mais n'affecte pas directement ces cellules. Il régule principalement les fonctions des cellules épithéliales en raison de l'expression restreinte de l'IL-22R1 sur les cellules épithéliales, y compris les CET.15,34 Des études antérieures ont suggéré que l'IL-22 peut protéger contre les lésions épithéliales rénales et accélérer la régénération tubulaire par l'inhibition de l'inflammasome NLRP3 et l'activation de la signalisation STAT3 et AKT.16,31 Cependant, les mécanismes sous-jacents de cette protection ne sont pas encore élucidés. Pour mieux déterminer la base moléculaire de la fonction de l'IL- 22 dansun reinblessure, nous étudions d'abord si IL-22 peut atténuer le dysfonctionnement des cellules rénales et l'apoptose subséquente en régulant leurs états métaboliques. De plus, nous étudions deux modèles deun reinblessuremaladies (AKI et DN) avec l'administration d'IL-22 et comparer les observations avec celles des groupes témoins. Nous indiquons que l'IL-22 corrige la reprogrammation métabolique pour maintenir l'intégrité mitochondriale, diminue l'accumulation de ROS mitochondriales dans les TEC blessés et atténue les lésions rénales progressives et la nécrose. De plus, nos découvertes suggèrent que l'IL- 22 peut activer les voies de signalisation associées à l'AMPK/AKT dans les TEC et les reins, des médiateurs importants de la cicatrisation épithéliale et de la survie cellulaire, pour améliorer le dysfonctionnement mitochondrial et la détérioration des profils métaboliques et ouvrir un nouveau champ pour le mécanisme de protection rénale à médiation IL-22. Dans l'ensemble, nos résultats indiquent que les effets protecteurs rénaux de l'IL-22 sont médiés par des processus de reprogrammation métabolique.

Le rôle critique d'OXPHOS et de la glycolyse dans la protection des reins a été révélé dans des études antérieures, où l'équilibrage de l'utilisation du carburant par la S-nitrosylation inhibitrice de la pyruvate kinase M2 (PKM2) protège contreun reinblessure.19 Nos résultats, suggérant la promotion de l'OXPHOS et de la glycolyse par l'IL-22 via l'augmentation de l'expression des régulateurs métaboliques et de l'absorption du glucose, démontrent que l'IL-22 inverse la détérioration des états métaboliques associés àun reinblessure. Ces observations sont cohérentes avec les fonctions de protection rénale de l'irisine recombinante et également conformes aux découvertes sur les hépatocytes, où l'OXPHOS et la glycolyse sont nécessaires pour les fonctions cellulaires, mais si celles-ci sont inhibées, les cellules tubulaires primaires et les hépatocytes deviennent dysfonctionnels.35, 36

Le dysfonctionnement mitochondrial est devenu la base moléculaire clé qui intègre les profils métaboliques et la mort cellulaire. Ici, nous illustrons que lors de la stimulation des facteurs de blessure, le traitement des TEC avec IL -22 a amélioré l'accumulation de ROS mitochondriales et de mitochondries dysfonctionnelles par rapport à la diminution de l'intégrité et de la fonction mitochondriales dans les groupes témoins. Il est important de noter que les voies de signalisation AMPK, les capteurs d'énergie critiques, modulent les processus métaboliques pour maintenir l'homéostasie cellulaire et prévenir les dommages cellulaires ou tissulaires. Signalisation AMPK/AKT pour démontrer que l'IL-22 prévient le dysfonctionnement mitochondrial par une méthode directe, ce qui est vital pour maintenir la capacité respiratoire des TEC. De plus, nous démontrons que la signalisation IL-22 via STAT3 a des effets directs sur la préservation de la forme mitochondriale, car ceux-ci ont été étudiés précédemment selon lesquels la phosphorylation induite par STAT3 est essentielle pour préserver l'intégrité mitochondriale.40,41

Plusieurs types de littérature ont précédemment indiqué que PFKFB3 joue le rôle d'un modulateur central dans le métabolisme cellulaire.29–30,42 Ici, nous démontrons d'abord que IL-22 favorise l'activation de PFKFB3 via la signalisation AMPK/AKT dans les TEC, suggérant IL{ {6}} régule les états métaboliques en impliquant le contrôle de PFKFB3. De plus, des études antérieures indiquent en outre que PFKFB3 est important pour contrôler l'OXPHOS exagéré et la glycolyse dans de nombreuses cellules ou tissus.42,43 Conformément à ces études, nos observations indiquent également la promotion de l'OXPHOS et de la glycolyse dans l'IL-22- TEC traités via l'activation de PFKFB3. Parmi les nombreux modulateurs en aval de l'IL-22 qui ont été étudiés, nos données illustrent que PFKFB3 est significativement régulé à la hausse après le traitement de l'IL-22 pendant les dommages des TEC et que l'axe STAT3 – AMPK/AKT PFKFB3 est vital pour la préservation. de l'intégrité mitochondriale pendantun reinblessure(Figure 7). Ils restent à étudier si IL -22 régule également d'autres régulateurs métaboliques et processus liés aux lésions rénales en activant la voie de signalisation STAT3 – AMPK / AKT-PFKFB3.

FIGURE 7 Nos résultats illustrent un rôle important de l'IL-22 dans le contrôle du métabolisme des cellules rénales pour traiter les lésions rénales en activant l'axe STAT3-AMPK/AKT-PFKFB3. Ces résultats suggèrent que les opportunités thérapeutiques de l'IL-22 et le ciblage de la signalisation métabolique associée pourraient être directement favorables au traitement ou à la prévention de nombreuses lésions rénales

5. CONCLUSIONS

En conclusion, nous avons démontré le potentiel thérapeutique et les mécanismes sous-jacents de l'IL-22 dans les lésions rénales. IL-22 a régulé le métabolisme des cellules rénales via une reprogrammation métabolique pour préserver l'intégrité mitochondriale. L'inhibition de leurs régulateurs (c.-à-d. AMPK, Akt et PFKFB3) pourrait entraîner des profils métaboliques anormaux et une perte de la forme mitochondriale, comme indiqué dans les TEC avec traitement spontané-22, qui avaient augmenté l'accumulation de mitochondries dysfonctionnelles et de ROS mitochondriales. Plus important encore, les lésions rénales dues au dysfonctionnement mitochondrial et à l'accumulation de ROS dans les modèles de souris ont été considérablement atténuées par le traitement IL-22 grâce à l'activation de la signalisation STAT3-AMPK-AKT-PFKFB3. Ainsi, notre étude a indiqué que le ciblage de la signalisation métabolique associée pourrait être directement favorable à de nombreuses maladies rénales et l'IL-22 est un agent thérapeutique potentiel pour prévenir et traiter ces maladies.

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Tiré de : 'IL-22-reprogrammation métabolique rénale via PFKFB3 pour traiterun reinblessure' parWei Chen, et al

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