Progrès de la recherche et applications des anticorps protéiques fluorescents : une revue axée sur les nanocorps

Abstrait: Depuis la découverte des protéines fluorescentes (FP), leurs riches spectres de fluorescence et leurs propriétés photochimiques ont favorisé de vastes applications en recherche biologique. Les FP peuvent être classés en protéines fluorescentes vertes (GFP) et ses dérivés, protéines fluorescentes rouges (RFP) et ses dérivés, et FP proches infrarouges. Avec le développement continu des FP, des anticorps ciblant les FP sont apparus. L'anticorps, une classe d'immunoglobulines, est le principal composant de l'immunité humorale qui reconnaît et lie explicitement les antigènes. L'anticorps monoclonal, provenant d'un seul lymphocyte B, a été largement utilisé dans les tests immunologiques, les diagnostics in vitro et le développement de médicaments. Le nanobody est un nouveau type d’anticorps entièrement composé du domaine variable d’un anticorps à chaîne lourde. Comparés aux anticorps conventionnels, ces nanocorps petits et stables peuvent être exprimés et fonctionnels dans les cellules vivantes. De plus, ils peuvent facilement accéder aux rainures, aux coutures ou aux épitopes antigéniques cachés à la surface de la cible. Cette revue donne un aperçu de divers FP, des progrès de la recherche sur leurs anticorps, en particulier des nanobodies, et des applications avancées des nanobodies ciblant les FP. Cette revue sera utile pour la poursuite des recherches sur les nanocorps ciblant les FP, rendant ainsi les FP plus précieux dans la recherche biologique.

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Mots clés : protéine fluorescente ; anticorps monoclonal; nanocorps; progrès de la recherche; application

1. Introduction

La protéine fluorescente (FP) est la protéine outil la plus couramment utilisée dans la recherche en sciences biomédicales. Suite à l’utilisation accrue de FP, des anticorps FP ont également été développés. Par rapport à l’anticorps traditionnel (Figure 1A), les anticorps à chaîne lourde (HCAb) du camélidé (Figure 1B) et les nouveaux récepteurs d’antigènes d’immunoglobuline (IgNAR) des requins (Figure 1C) manquent naturellement de chaînes légères. L'anticorps à domaine unique (sdAb) est un anticorps entièrement composé de domaines variables de HCAb ou d'IgNAR. Son poids moléculaire est de 12 à 15 kDa, soit environ 1/10 de la taille d'un anticorps monoclonal ; c’est pourquoi on l’appelle également nanocorps. Le nanocorps, avec une taille plus petite, une stabilité élevée contre l'acide et la chaleur, une forte capacité de pénétration, une facilité de génie génétique et d'expression et une affinité élevée, a été appliqué dans divers domaines par des chercheurs scientifiques. Il peut facilement accéder aux rainures, aux coutures ou aux épitopes antigéniques cachés à la surface de la cible, reconnaissant de nombreux antigènes que les anticorps conventionnels ne peuvent pas reconnaître [1]. Par conséquent, les nanocorps ont été utilisés comme biomolécules dans les organismes et les systèmes de culture cellulaire en biologie du développement, comme chaperons cristallins pour l'état conformationnel en biologie stable, comme régulateurs ou inhibiteurs de l'activité enzymatique, comme réactifs immunohistochimiques pour l'analyse biochimique et comme anticorps secondaires en immunoblot et en immunofluorescence. –6]. Les nanocorps qui se lient spécifiquement au FP sont largement utilisés dans la localisation subcellulaire, les études des voies de signalisation intracellulaires, l'imagerie de cellules vivantes et les nanomatériaux ciblés [7–9]. En particulier, les nanocorps présentent des avantages uniques par rapport aux anticorps IgG traditionnels en matière d’imagerie à très haute résolution.

Figure 1. Diagrammes de structure des IgG (A), des HAb de camélidés (B) et des IgNAR de requin (C). VH, la région variable de la chaîne lourde ; VL, la région variable de la chaîne légère ; CH/C, la région constante de la chaîne lourde ; CL, la région constante de la chaîne légère ; VHH, le domaine variable de HCAb ; VNAR, le domaine variable d'IgNAR.

2. Aperçu des protéines fluorescentes

2.1. La découverte des protéines fluorescentes

La luminescence est un phénomène courant chez les invertébrés marins. Les coelentérés, notamment les méduses, les hydres et les coraux, émettent une fluorescence verte sous une lumière ultraviolette (UV) ou bleue, tandis que les cténophores émettent une fluorescence bleue. La protéine fluorescente verte (GFP) a été identifiée pour la première fois chez Aequorea victoria par Shimomura et al. en 1962 [10], puis cloné et exprimé en 1985 [11]. Les propriétés uniques et la structure stable de la GFP de type sauvage (wtGFP) ont donc incité de nombreux chercheurs à l’étudier. Depuis lors, sur la base des connaissances existantes et de sa structure cristalline, Tisen et ses collègues ont généré par mutation diverses protéines GFP avec différentes propriétés fluorescentes et ont élaboré le mécanisme de luminescence de la GFP (12). Concernant la recherche liée à la GFP, trois scientifiques (Shimomura, Chalfie et Tsien) ont remporté le prix Nobel de chimie 2008 pour la découverte de la GFP et leurs contributions exceptionnelles à son application.

La protéine ancestrale fluorescente rouge (RFP), à savoir DsRed, a été clonée à partir de coraux de récif non bioluminescents en 1999 [13]. Le RFP peut être utilisé avec le GFP pour résoudre des problèmes scientifiques que le GFP ne peut résoudre seul. Plus important encore, en raison du faible fond de RFP en imagerie intracellulaire, elle est plus adaptée aux applications dans la recherche en biosciences [14,15]. Grâce aux efforts de nombreux scientifiques, il a été rapporté que les spectres de fluorescence des FP couvrent toute la région visible et même la région proche infrarouge, fournissant ainsi une multitude d'outils pour visualiser et quantifier les protéines dans les cellules vivantes (16). La figure 2 résume le développement des PF.

Figure 2. Le développement de protéines fluorescentes. GFP, protéine fluorescente verte ; BFP, protéine fluorescente bleue ; EGFP, protéine fluorescente verte améliorée ; YFP, protéine fluorescente jaune ; RFP, protéine fluorescente rouge ; VHH, domaine variable de la chaîne lourde ; VNAR, nouveau récepteur antigénique variable. Le marqueur vert pâle indique les progrès de la recherche sur l'application de la GFP et le marqueur vert jaune indique les progrès de la recherche sur l'anticorps GFP.

2.2. Structure et propriétés fonctionnelles du GFP

La GFP est un FP acide naturel, globulaire et soluble. La structure primaire de la GFP est constituée d'un monomère composé de 238 résidus d'acides aminés, avec un poids moléculaire de 27 à 30 kDa. Sa structure cristalline présente un centre formé de 11 chaînes anti-parallèles, formant une structure cylindrique en forme de tonneau étroitement tassée. Le centre du barillet est protégé par un groupe électroluminescent de 4-(p-hydroxybenzylidène)-5-imidazolinone connecté à son hélice, les deux extrémités étant scellées par de courts segments d'hélice [17,18]. La maturation du chromophore ne nécessite aucun cofacteur autre que O2 [19]. GFP absorbe la lumière bleue ou la lumière UV et émet une fluorescence verte, avec le pic d'excitation principal à 395 nm, le pic d'excitation le plus bas à 475 nm et le pic d'émission à 509 nm. Le GFP est extrêmement stable et peut facilement résister à un traitement à haute température. La fixation de formaldéhyde ou l'inclusion de paraffine n'affectent pas ses caractéristiques de fluorescence. Grâce à une enquête approfondie sur la structure et le processus de maturation des FP, de plus en plus de chercheurs repensent la structure des FP pour leur fournir de nouvelles fonctions et propriétés, favorisant ainsi leur développement et leur application.

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2.3. Dérivés GFP

Les facteurs limitants dans les applications GFP sont le pH, la sensibilité aux ions chlorure et une mauvaise photostabilité. Des modifications ciblées de la GFP corrigent ces défauts, augmentant ainsi son rendement quantique, sa luminosité, son coefficient d'extinction molaire et sa photostabilité. De plus, plusieurs dérivés du GFP ont été créés pour élargir la gamme de couleurs émises, notamment le bleu, l'outremer, le cyan et le jaune.

En réponse à la faible intensité de fluorescence du wtGFP sous excitation par la lumière bleue et à son expression instable dans les cellules de mammifères, Zhang et al. a conçu une substitution d'acides aminés de la GFP (F64L et S65T), à savoir la GFP améliorée (EGFP), dont l'intensité de fluorescence est augmentée de 35- fois [20]. EGFP reste le mutant FP le plus couramment utilisé dans la région du feu vert, compte tenu de sa bonne photostabilité et de sa luminosité élevée. De plus, les propriétés de pliage du GFP ont été optimisées, obtenant un super dossier GFP (sfGFP) avec une super capacité de pliage. Le sfGFP comporte six nouvelles mutations, dont S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V et A206V. La sfGFP peut se replier efficacement même lorsqu'elle est exprimée en fusion avec des protéines insolubles, garantissant ainsi l'éclat de sa fluorescence (21). GFPuv, une autre forme modifiée de GFP, est optimisée pour la fluorescence sous lumière UV. Il génère une fluorescence verte plus brillante en présence de lumière UV avec un pic d'excitation à 395 nm et un pic d'émission à 509 nm et peut être utilisé pour identifier l'emplacement de différentes protéines intracellulaires (22,23). Trois substitutions d'acides aminés se produisent dans GFPuv, notamment F99S, M153T et V163A. Ces mutations induisent une expression de GFPuv 18- fois plus forte que celle de wtGFP chez E. coli. Le gène GFPuv est un gène synthétique dans lequel les cinq codons Arg basse fréquence sont remplacés par des codons adaptés à E. coli pour assurer une expression efficace de GFPuv.

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La mutation dirigée vers le site de Y66H construit la protéine fluorescente bleue (BFP) avec un pic d'excitation à 384 nm et un pic d'émission à ~ 445 nm. Son spectre d'excitation est proche de la lumière UV, qui endommage les cellules pendant le fonctionnement, et sa courte longueur d'onde d'émission induit une autofluorescence dans les cellules. Le BFP amélioré (EBFP) est faiblement luminescent et peu résistant au photoblanchiment et aux acides, avec un signal de fond élevé pour l'imagerie cellulaire. Trois mutants EBFP plus brillants ont été développés, dont Azurite [24], EBFP2 [25] et mTagBFP [26], qui sont 1.6-, 2.0- et 3.{{13}. }fold plus lumineux que EBFP, respectivement. mTagBFP, le BFP le plus brillant, est dérivé d'un mutant de la protéine fluorescente rouge (RFP) TagRFP [27], avec un coefficient d'extinction de 52,000 M−1 cm−1 et un rendement quantique de {{19 }}.63, ce qui améliore significativement sa résistance au photoblanchiment. La mutation de Y66F dans wtGFP aboutit à une protéine fluorescente outremer avec une longueur d'onde d'émission de 442 nm (28). Cependant, le faible rendement quantique de fluorescence du variant GFP-Y66F limite considérablement son applicabilité en imagerie. Une mutation supplémentaire de GFP-Y66F avec des substitutions d'acides aminés de T65Q, Y145G, H148S et T203V aboutit à la protéine fluorescente outremer Sirius, qui est 25 fois plus brillante que GFP-Y66F (29).

La protéine fluorescente cyan (CFP) a un pic d'excitation à 449 nm et un pic d'émission à ~ 482 nm, avec des propriétés spectrales comprises entre BFP et EGFP. De la même manière que pour le BFP, une mutation dirigée vers un site de Y66W est utilisée pour construire le CFP. Le CFP a de nombreuses applications dans la recherche en imagerie multicolore et en localisation en raison de sa photostabilité exceptionnelle. Par exemple, le gène codant pour la CFP a été optimisé pour la préférence des codons humains et est désormais disponible dans le commerce sous le nom commercial AmCyan1 (Clontech). De plus, il existe plusieurs mutants plus brillants que le CFP amélioré (ECFP), tels que Cerulean, mTFP (deux fois plus brillant que Cerulean) et turquoise (environ deux fois plus brillant que ECFP) [21,30].

Les mutations de la protéine fluorescente jaune (YFP) ne sont pas limitées au motif central du chromophore Y66 mais aux résidus structurellement adjacents à Y66. Le pic d'excitation de YFP est d'environ 518 nm, avec un pic d'émission d'environ 531 nm. Par rapport à la GFP, la fluorescence de YFP se déplace vers le spectre rouge, ce qui est principalement dû à la substitution de Thr par Tyr en position 203. La YFP améliorée (EYFP) est l'un des biocapteurs FP les plus fluorescents et les plus largement utilisés pour détecter le pH intracellulaire et concentrations d'ions chlorure. Cependant, il est très sensible aux ions acides et chlorures et est moins photostable que de nombreux PF dérivés de méduses [31]. mCitrine et mVenus, versions améliorées d'EYFP, sont actuellement les YFP les plus utilisées [32,33]. Les propriétés photophysiques de la GFP et de ses dérivés sont résumées dans le tableau 1.

Tableau 1. Propriétés photophysiques du GFP, du RFP et de leurs dérivés.

Tableau 1. Suite

2.4. Dérivés de l'appel d'offres

Le RFP est un autre FP largement utilisé. DsRed est un tétramère qui a tendance à former des multimères lors de fusions de protéines et peut être toxique lorsqu'il est exprimé de manière intracellulaire. Il a donc été conçu pour obtenir des monomères. L'appel d'offres le plus notable est la famille « mFruit », comprenant mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine et mStrawberry (Tableau 1), parmi lesquels mCherry, avec des mutations de K163Q et K83L, est le plus préféré. mCherry a une maturation rapide, de bonnes propriétés monomères et une meilleure photostabilité, bien qu'elle soit moins brillante [34]. Cependant, TagRFP sous sa forme monomère est environ trois à quatre fois plus brillant que mCherry, ce qui en fait un RFP monomère relativement brillant actuellement disponible (27). mKate est une nouvelle protéine fluorescente monomère rouge lointain dérivée d'une mutation à quatre sites de TagRFP avec un pic d'excitation à 588 nm et un pic d'émission à 635 nm, ce qui est seulement 45 % aussi brillant que l'EGFP ; sa protéine de dimérisation, Katushka, est 67 % aussi brillante que l'EGFP (35). mKate2, un mutant de mKate avec des substitutions d'acides aminés V38A, S165A et K238R, a environ le double de la luminosité de mKate (36). Par rapport au GFP et au RFP, mKate et Katushka présentent une meilleure profondeur d'imagerie et des signaux optiques plus riches pour l'imagerie par fluorescence intra-objet (35). Par conséquent, le développement de protéines fluorescentes dans le rouge lointain est plus utile pour la bioimagerie in vivo.

2.5. FP proche infrarouge

Les FP proches infrarouges (NIR) sont hautement recherchés comme marqueurs protéiques dans les applications d’imagerie. La plupart des FP NIR sont conçus à partir de photorécepteurs phytochromes bactériens (BphP) [37]. Le premier FP NIR utilisé en imagerie animale vivante est IFP1.4, une protéine fluorescente dérivée de BphP qui émet une fluorescence en se liant à un chromophore de biliverdine (BV) [38]. Par remaniement de l'ADN et mutagenèse aléatoire, un IFP2.0 plus brillant est ensuite développé (39). Bien que les IFP1.4 et IFP2.0 monomères puissent être obtenus en brisant l'interface de dimérisation du BphP, ils ont toujours tendance à se dimériser à des concentrations élevées. Une protéine monomère naturelle fluorescente infrarouge (IFP), mIFP, a été conçue en 2015 [40]. Il a été prouvé que le mIFP a des effets d’imagerie sonore sur les larves et les neurones de drosophile. Shcherbakova et al. ont conçu trois FP NIR monomères brillants avec des spectres distincts, à savoir miRFP670, miRFP703 et miRFP709 (41). Les FP NIR dérivés de BphP nécessitent au minimum deux domaines, PAS (Per-ARNT-Sim) et GAF (cGMP phosphodiestérase-adénylate cyclase-FhlA), pour attacher de manière covalente un chromophore BV et possèdent également une structure complexe en « nœud en huit » reliant topologiquement les domaines GAF et PAS, ce qui affecte leur repliement. Par conséquent, une autre classe de photorécepteurs bactériens, les allophycocyanines (APC), est utilisée pour concevoir des FP NIR, tels que smURFP (42). Bien que les FP NIR basés sur l'APC soient plus petits, ils se lient moins efficacement au BV, ce qui entraîne une luminosité significativement plus faible dans les cellules de mammifères que les FP NIR dérivés du BphP. Pour surmonter les défauts des FP NIR basés sur BphP et APC, un FP NIR à domaine unique nommé miRFP670nano a été développé à partir du cyanobactériochrome (CBCR), représentant le premier FP NIR dérivé du CBCR capable de lier efficacement le chromophore BV endogène et d'émettre une fluorescence brillante dans cellules de mammifères [43]. Un avantage essentiel du miRFP670nano par rapport aux FP NIR dérivés du BphP est une photostabilité élevée. Le miRFP670nano3 amélioré, avec 14 mutations par rapport au miRFP670nano parental, présente une photostabilité similaire à celle du miRFP670nano (44). Le tableau 2 résume les propriétés photophysiques des FP NIR.

Tableau 2. Propriétés photophysiques des FP NIR.

La découverte et l'application des PF ont fourni un outil de recherche puissant pour la biologie moderne. De nos jours, les FP sont devenus l'un des outils couramment utilisés par les scientifiques pour étendre leurs applications à de nombreux domaines de recherche, tels que la régulation de l'expression génique, le marquage des organites, la transmission du signal, le criblage de médicaments et les interactions biomoléculaires. La plupart des vecteurs de clonage exprimant les FP ont été commercialisés et sont disponibles auprès de sociétés commerciales.

3. Progrès de la recherche sur les anticorps protéiques fluorescents

3.1. Anticorps monoclonaux ciblant les protéines fluorescentes

L'anticorps est une sorte d'immunoglobuline sécrétée par les lymphocytes B. Les anticorps monoclonaux sont constitués de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères, la chaîne lourde étant constituée d'une région variable (VH) et de trois régions constantes (CH), et la chaîne légère étant constituée d'une région variable (VL) et d'une région constante (CL). ). Les chaînes lourdes sont liées de manière covalente par des liaisons disulfure, et la région CL de la chaîne légère est liée de manière non covalente au domaine CH1 de la chaîne lourde pour former une molécule d'anticorps stable (45). En raison de leur capacité de liaison spécifique aux récepteurs, les anticorps monoclonaux produisent diverses activités biologiques, telles que le blocage classique, la neutralisation, l'activation du complément, la destruction des cellules cibles via le récepteur Fc et la régulation de l'activité immunitaire. Ce sont des macromolécules biologiques essentielles largement utilisées dans les tests immunologiques, les diagnostics in vitro et le développement de médicaments. Les anticorps polyclonaux sont un mélange d'anticorps hétérotypiques dérivés du processus de réponse immunitaire de plusieurs cellules B, et chaque anticorps reconnaît un épitope différent du même antigène (45). Comparés aux anticorps polyclonaux, les anticorps monoclonaux détectent spécifiquement un épitope sur l'antigène et sont moins susceptibles de réagir de manière croisée avec d'autres protéines, produisant ainsi de faibles signaux de coloration de fond. De plus, la reproductibilité des résultats concernant les anticorps monoclonaux est supérieure à celle des anticorps polyclonaux dans les mêmes conditions expérimentales.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90 %) est purifié à l'aide d'une technique simple en 2-étape utilisant mAb FMU-GFP.5-résine Sépharose 4B couplée. De plus, toutes les protéines cibles recombinantes fonctionnelles couplées à la GFP peuvent être facilement et directement isolées des cellules, grâce à l'épitope GFP. Ces données suggèrent que cette méthode est plus efficace pour purifier la GFP que n’importe quelle méthode disponible et résout le problème du faible rendement et de la pureté de la plupart des méthodes de purification de la GFP.

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3.2. Nanocorps ciblant les protéines fluorescentes

3.2.1. Introduction du nanocorps

Les propriétés inhérentes des anticorps monoclonaux, telles que leur poids moléculaire élevé, leur structure complexe et leur activité biologique limitée, ont de plus en plus restreint leurs applications ultérieures. Il est donc urgent de développer des alternatives aux anticorps monoclonaux. En 1989, Ward et coll. ont préparé un domaine variable d'anticorps à chaîne lourde uniquement avec une faible capacité de liaison au lysozyme, suscitant l'intérêt pour la recherche sur les sdAb (48). En 1993, Hamers Casterman et coll. ont découvert pour la première fois un nouveau type d’anticorps dans le sérum de chameau, totalement différent de l’anticorps traditionnel des mammifères [49]. Ce type d'anticorps est appelé HCAb en raison de son absence naturelle de chaînes légères. HCAb se compose de CH2, CH3, de la région charnière et du domaine variable de HCAb (VHH), mais il possède toujours une pleine capacité de liaison à l'antigène. En 1995, Greenberg et coll. découvert des anticorps à chaîne lourde uniquement, connus sous le nom d’IgNAR, chez le requin nourrice (50). Il existe sous forme sécrétoire et liée à la membrane et se compose d'une région variable, appelée nouveau récepteur d'antigène variable (VNAR), et de plusieurs régions constantes. Par la suite, des IgNAR ont été trouvés chez le requin wobbegong, l'aiguillat commun, le requin corne et le requin bambou à points blancs, complétant ainsi les répertoires de sdAbs. Un nanocorps possède les caractéristiques d'un petit poids moléculaire, d'une affinité élevée, d'une forte stabilité, d'une bonne solubilité, d'une forte pénétration tissulaire et de la reconnaissance des épitopes d'antigènes cachés. Il a attiré une attention croissante dans le diagnostic des maladies, les réactifs immunitaires, la détection des agents pathogènes et le développement de médicaments (51). Avec le développement des techniques de biologie moléculaire et l’amélioration de la technologie de préparation d’anticorps génétiquement modifiés, les nanocorps sont devenus un domaine de recherche populaire en immunoessai. La figure 3 résume le développement des nanocorps à ce jour.

Figure 3. Le développement du nanobody. Le marqueur bleu clair indique les progrès de la recherche sur les médicaments à base de nanocorps. FDA, Administration des aliments et des médicaments ; EMA, Agence européenne des médicaments ; NMPA, Administration nationale des produits médicaux ; HAcb, anticorps à chaîne lourde ; IgNAR, nouveaux récepteurs d'antigènes Ig ; sdAb, anticorps à domaine unique ; VHH, domaine variable de HCAb ; VNAR, domaine variable d'IgNAR ; PD-L1, mort cellulaire programmée 1 ligand 1.

3.2.2. Nanocorps ciblant les protéines fluorescentes

Les protéines fluorescentes ont changé la biologie cellulaire et la biochimie en offrant des marqueurs protéiques fluorescents codés par des gènes simples à utiliser. Plusieurs agents de liaison étroite destinés à la recherche et aux cibles médicamenteuses ont été développés grâce à la synthèse et à la sélection de bibliothèques d'échafaudages protéiques au cours d'un développement parallèle (52). Un exemple est le développement de nanocorps, plus faciles à sélectionner avec une stabilité, une solubilité et un rendement améliorés [53]. Contrairement aux anticorps traditionnels, ces nanocorps petits et stables sont fonctionnels dans les cellules vivantes. Par conséquent, les nanocorps ayant une activité de liaison spécifique au FP constituent un outil puissant pour la fusion, la séparation et l’ingénierie cellulaire des FP dans divers domaines de la recherche biologique.

• Nanocorps dérivés de camélidés ciblant la GFP

Diverses protéines présentant d'excellentes caractéristiques de localisation subcellulaire ont été fusionnées à la GFP, créant ainsi des antigènes visuels permettant de détecter les protéines directement dans divers compartiments subcellulaires. En 2006, Rothbauer et coll. ont criblé un fragment d'anticorps spécifique de la GFP (cAbGFP4) en immunisant l'alpaga avec la GFP (54). Le test de résonance plasmonique de surface (SPR) de l'interaction entre cAbGFP4 et l'antigène GFP a montré une affinité élevée (KD=0,23 nM). De plus, le nanocorps anti-GFP a été combiné avec un RFP monomère, produisant l'anticorps visible se liant à la GFP utilisé pour examiner la distribution du nanocorps anti-GFP dans les cellules vivantes. Par filtration sur gel, immunoblot et tests de microscopie confocale, il a été démontré que le nanocorps spécifique de la GFP était distribué de manière stable dans les cellules de mammifères sans dégradation ou agrégation détectable des protéines, que l'on trouve couramment avec les fragments variables à chaîne unique. De plus, Kubala et al. caractérisé le complexe GFP: cAbGFP4 (Figure 4A) par cristallographie aux rayons X et calorimétrie par titrage isotherme (ITC) [55], révélant la base de la haute affinité et spécificité des nanocorps dans la liaison aux protéines. En 2020, quatre nanocorps anti-GFP distincts, appelés A12, B9, D5 et E6, ont été identifiés par phage display (56). Les tests PAGE natifs et d'immunoprécipitation ont révélé que ces nanocorps pouvaient se lier à la GFP in vitro et in vivo.

Figure 4. Schéma du complexe GFP-nanocorps. (A) cAbGFP4 (PDB : 3OGO, orange) ; (B) GBP1 (PDB : 3K1K, bleu clair) ; (C) GBP4 (PDB : 3G9A, rose) ; (D) LaG16 (PDB : 6LR7, jaune) ; (E) NbsGFP02 (PDB : 7E53, magenta). (F) Superposition structurelle des nanocorps ci-dessus avec le complexe GFP. GFP est affiché en vert.

La conformation des protéines est étroitement liée à la fonction et est généralement contrôlée par des facteurs régulateurs. Axel et coll. identifié sept liants spécifiques à la GFP, à savoir les protéines de liaison à la GFP (GBP) 1 à 7 (57). Parmi eux, GBP1 a augmenté la fluorescence de la GFP de 10- fois, tandis que GBP4 a induit une diminution de 5- fois de la fluorescence de la GFP ; par conséquent, ceux-ci ont été appelés respectivement « amplificateurs » et « minimisateurs ». Les analyses structurelles du complexe GFP-nanocorps (Figure 4B, C) ont révélé que les deux nanocorps provoquaient de modestes changements opposés dans le milieu chromophore, modifiant ses caractéristiques d'absorption (58). De plus, 25 nanocorps spécifiques à la GFP (LaG) ont été identifiés, avec des valeurs de KD allant de 0,5 nM à plus de 20 µM [59]. Un nanocorps bivalent (LaG-16-LaG-2) a montré l'affinité la plus élevée, avec une valeur KD de 36 pM. De plus, l’intensité maximale de fluorescence de la GFP a augmenté d’environ 60 % lorsqu’elle est incubée avec un excès de protéine LaG. Zhang et coll. ont rapporté la structure cristalline de GFPuv complexée avec LaG16 (Figure 4D) à une résolution de 1,67 Å (60). Le site de liaison de LaG16 sur le corps de GFP était situé de l'autre côté de l'amplificateur de GFP. Par conséquent, LaG16 et GFP-enhancer ont été fusionnés avec un lieur (GS) 4. Le nanocorps bivalent avait une affinité de 0,5 nM, démontrant la faisabilité de concevoir des liants protéiques cibles à très haute affinité par dimérisation de 2 nanocorps se liant à différents épitopes.

En 2014, Twair et al. préparé du sfGFP et vacciné un chameau adulte à une bosse. Sept nanocorps anti-sfGFP ciblant trois épitopes (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 et 08) ont été isolés (61). Sur la base de tests ELISA et d'immunotransferts, ces nanocorps ont reconnu le sfGFP marqué comme étant libre ou fusionné à l'hormone de croissance. De plus, la structure cristalline du nanocorps NbsfGFP02 complexé avec sfGFP (Figure 4E) a été établie à une résolution de 2,2 Å. L'affinité entre NbsfGFP02 et sfGFP a été déterminée à 15,8 nM par interférométrie de biocouche (BLI). La température de fusion était de 75,6 degrés pour NbsfGFP02 [62] ; il s’agit donc d’un candidat potentiel pour les nanocorps GFP dans les applications qui exigent des conditions de test difficiles. La plupart des nanocorps peuvent être fonctionnellement exprimés in vivo via une transfection plasmidique dans des cellules eucaryotes. Les nanocorps constituent donc un excellent outil pour identifier les caractéristiques structurelles ou dynamiques des cellules vivantes. En 2020, Zhou et al. ont proposé une nouvelle méthode d'expression des nanocorps construits se liant à la GFP (cAbGFP4) sous forme d'ARNm de transcription in vitro (IVT), appelé nanobody-mCherry (63). L'ARNm avec les régions non traduites et les analogues de coiffe inversée coiffés de nucléotides chimiquement modifiés et d'une queue poly (A) a été préparé in vitro et utilisé pour la transfection. Contrairement au nanocorps exprimé à l'aide de l'ADN plasmidique, le nanocorps anti-GFP exprimé à l'aide de l'ARNm IVT a été identifié dans les 3 heures suivant la transfection et dégradé dans les 48 heures. Par conséquent, l’expression de l’ARNm codé du nanocorps dans des cellules vivantes permet une délivrance efficace du nanocorps.

• Nanocorps dérivés de requins ciblant la GFP.

Wei et coll. ont démontré que les requins bambou produisaient une réponse immunitaire efficace contre la vaccination GFP, caractérisée par un nombre élevé de lymphocytes et d'IgNAR spécifiques de l'antigène (64). Au total, 7 nanocorps anti-GFP, dont BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 et 105, avec une affinité allant jusqu'à 0,3 nM, ont été isolés de requins bambou immunisés, ce qui implique que les requins bambou fabriquer des IgNAR de haute affinité. De plus, les VNAR bi-paratopiques ayant la plus forte affinité pour la GFP (20,7 pM) ont été construits et le caractère des nanocorps anti-GFP en tant qu'intracorps a été validé dans des cellules de mammifères. Ces résultats accéléreront la recherche et les progrès sur les sdAbs de requin bambou afin de fournir des nanocorps peu coûteux et faciles à utiliser pour l’industrie biomédicale.

• Nanocorps ciblant d'autres protéines fluorescentes.

Masabi est une protéine fluorescente verte monomère brillante. Li et coll. construit avec succès une bibliothèque d'anticorps de 4 × 1 07 transformants en immunisant des chameaux avec mWasabi comme antigène et criblé 3 nanocorps spécifiques de mWasabi de haute affinité, appelés Nb4, Nb6 et Nb27 (65). Ces nanocorps ont reconnu le wasabi seul ou lorsqu'il est combiné avec la mort programmée 1 (PD-1). Au total, 6 nanobodies (LaMs) ciblant mCherry avec une spécificité élevée ont été identifiés, avec des valeurs KD allant de 0,18 nM à 63 nM (59). De plus, trois nanocorps spécifiques de l'iRFP713- (BSR1, BSR3 et BSR4) avec des affinités de liaison nanomolaires ont été isolés (64). Ces données suggèrent que la vaccination des requins bambou peut produire des nanocorps de haute affinité. Dans l’ensemble, la capacité des nanocorps à se lier aux protéines cellulaires et à attirer les protéines de fusion FP permet un contrôle précis des processus et structures cellulaires dans les cellules vivantes. Ce piège FP-nano multifonctionnel permet des analyses microscopiques, biochimiques et fonctionnelles avec une combinaison unique de la même protéine. Les nanobodies ciblant les FP sont résumés dans le tableau 3.

Tableau 3. Résumé des nanocorps ciblant les FP.

4. Applications du nanocorps de protéines fluorescentes

4.1. Applications dans la détection des protéines

4.1.1. Détection des protéines intracellulaires

Comprendre la fonction des protéines nécessite une localisation fiable et quantifiable des protéines à haute résolution. Bien que l’utilisation d’anticorps pour marquer des protéines cibles soit bien établie en biologie moléculaire, cette technique est limitée par la taille et la multivalence des anticorps conventionnels. Compte tenu de la petite taille des nanocorps, ils peuvent être utilisés comme traceurs pour l’imagerie intracellulaire après ligature avec des molécules fluorescentes, des enzymes, des peptides, des récepteurs, de la biotine et d’autres médicaments. Par exemple, des nanocorps contre la FP ont été utilisés en imagerie par microscopie à super-résolution lorsqu'ils étaient marqués avec des colorants organiques (66,67). Les cellules Ptk2 qui expriment en continu la tubuline YFP ont été imagées à l'aide de cette approche et la résolution a été améliorée à 269 ± 37 Å, contre environ 450 Å avec les anticorps conventionnels.

Le marquage médié par les nanocorps offre une méthode rapide et polyvalente pour marquer presque toutes les structures de fusion dérivées de FP couramment accessibles pour une imagerie sophistiquée par microscopie de localisation de molécule unique (SMLM). Plus précisément, le SMLM bicolore peut étudier la localisation subcellulaire de toute construction de fusion fonctionnelle GFP et RFP lorsque des nanocorps contre GFP et RFP sont utilisés simultanément (68). Ainsi, de nombreux problèmes biologiques peuvent être rapidement résolus à l’aide de l’imagerie SMLM bicolore. Ariotti et coll. ont proposé une approche modulaire pour le marquage des protéines à base d'enzymes, permettant une vitesse et un échantillonnage améliorés pour analyser les distributions de protéines subcellulaires à la résolution EM (7). En concevant GBP4 directement sur l'étiquette APEX (ascorbate peroxydase de soja) modifiée, il a été démontré que l'APEX pouvait être dirigé vers n'importe quelle protéine d'intérêt marquée par la GFP. La fusion APEX-GBP4 permet une localisation remarquable des protéines à haute résolution dans les sous-domaines des organites et réduit considérablement le temps de caractérisation des distributions de protéines subcellulaires. De plus, il permet la résolution EM des protéines marquées par la GFP exprimées à des niveaux endogènes.

Une boîte à outils de plasmides codant pour des nanocorps spécifiques au FP a été générée et fusionnée en modules fonctionnels. Cette boîte à outils permet la visualisation et la manipulation des voies de signalisation intracellulaires dans les cellules vivantes, élargissant considérablement ses utilisations in vivo [9]. Ceux-ci incluent des capteurs fluorescents pour la visualisation dynamique de Ca2+, H+ et ATP/ADP, ainsi que des modules oligomères ou hétérodimères qui permettent le recrutement ou l'isolement des protéines et la reconnaissance des sites de contact membranaire entre organites. En 2017, Hercé et al. ont utilisé le peptide de pénétration cellulaire (CPP) pour transporter les anticorps directement dans les cellules à des fins d'immunomarquage et de manipulation des antigènes (69). Un système tirant parti de la forte affinité du CPP cyclique riche en arginine pour l'ARN du nucléole a été construit. En reliant le CPP cyclique riche en arginine au nanocorps GFP, la relocalisation de la GFP dans le nucléole peut être directement observée dans les cellules (Figure 5A). Par conséquent, ce système visualisé peut être utilisé pour suivre l’emplacement de la protéine et comparer quantitativement l’efficacité des différents CPP.

La technique de transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) est largement utilisée dans la recherche en sciences de la vie car elle permet une détection dynamique en temps réel de molécules de signalisation dans des conditions physiologiques dans les cellules vivantes. En raison de sa sensibilité et de sa spécificité exceptionnelles, l’analyse basée sur le transfert d’énergie par résonance de Förster (TR-FRET) résolue dans le temps devient de plus en plus populaire dans la recherche biomédicale. La méthode TR-FRET basée sur les nanocorps permet une quantification facile des protéines fluorescentes (de fusion) dans les lysats avec une sensibilité beaucoup plus élevée que les lectures conventionnelles de l'intensité de fluorescence (70).

Figure 5. Applications du nanocorps protéique fluorescent. (A) Visualisation des interactions protéine-protéine. Les nanocorps anti-GFP (Nb) liés aux peptides de pénétration cellulaire (CPP) peuvent pénétrer dans le noyau cellulaire. Si la protéine marquée par GFP n'interagit pas avec la protéine marquée par RFP, seule la protéine marquée par GFP se relocalise dans le nucléole via Nb-CPP, affichant une couleur verte. Cependant, si les deux protéines interagissent, les deux protéines se relocalisent dans le nucléole, affichant une couleur jaune. (B) Le nanocorps GFP permet le marquage sélectif des protéines de vésicules nouvellement exocytosées. Étape 1 : La protéine vésiculaire est couplée à la GFP et incubée avec un nanocorps non fluorescent (NbGFP), ce qui entraîne l'inaccessibilité de la GFP avec le nanocorps liant la fluorescence (NbGFP*). Étapes 2 et 3 : Après stimulation de l'exocytose cellulaire, la nouvelle protéine vésiculaire est exposée à la membrane plasmique et peut être marquée par NbGFP*. (C) Illustration schématique de dégradé. La dégradation sélective des protéines s'effectue par la voie de l'ubiquitine, qui est réalisée par une série complexe d'enzymes. La protéine F-box (FBP) dans les complexes protéine ligase (SCF) SKP1-CUL1-F-box est fusionnée au nanocorps anti-GFP (Nb) pour reconnaître la protéine de fusion GFP, et l'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine (E2) lie de manière covalente plusieurs molécules d'ubiquitine à la protéine cible. Par la suite, la protéine polyubiquitinée est dégradée par le protéasome. (D) Description schématique de BiCAP. La protéine HER est fusionnée aux fragments N-terminaux (GFP1) ou C-terminaux (GFP2) de la GFP. Lorsque les deux fusions forment un dimère, la GFP se replie et émet une fluorescence. Le dimère HER et ses protéines en interaction sont ensuite enrichis à l’aide d’un nanocorps GFP, qui n’a aucune capacité de liaison aux fragments GFP et permet ainsi l’isolement du dimère. (E) Système de transcription dépendant de la GFP. Le domaine de liaison à l'ADN (DBD) et le domaine d'activation (AD) sont fusionnés respectivement avec le nanocorps GFP 1 (Nb1) et le nanocorps GFP 2 (Nb2). En présence de GFP, DBD-Nb1 et AD-Nb2 peuvent activer le gène rapporteur de la séquence d'activation en amont (UAS), ce qui conduit à la régulation positive des gènes cibles. (F) Reconnaissance des protéines marquées par GFP sur les nanostructures d'ADN. Les nanostructures d'ADN avec deux sites de liaison sont ligaturées sur la résine magnétique, liées au nanocorps GFP (Nb) par appariement de bases complémentaires, puis incubées avec des protéines marquées par GFP. Par conséquent, les protéines marquées par la GFP peuvent être attachées avec précision aux nanostructures.

Figure 5. Suite.

4.1.2. Détection de protéines à la surface cellulaire

L'affichage de la surface bactérienne est une technologie prometteuse pour produire des protéines ancrées dans les cellules et concevoir des catalyseurs pour cellules entières. Bien que diverses protéines de la membrane externe soient utilisées pour l’affichage en surface, aucune méthode simple, universelle et compatible à haut débit n’est disponible pour évaluer et développer des systèmes d’affichage en surface. De plus, il est difficile de faire la distinction entre les protéines intracellulaires et celles affichées en surface. Wendel et coll. construit un système de détection d'affichage de surface basé sur la fluorescence en fusionnant le nanocorps GFP avec des ancrages de membrane externe (71). Deux protéines de membrane externe couramment utilisées ont été choisies comme points d'ancrage : la protéine A de la membrane externe (OmpA) et l'autotransporteur (C-IgAP). Par conséquent, deux modules d’affichage différents sont construits en fusionnant OmpA ou C-IgAP avec des nanocorps spécifiques à la GFP, visualisés en ajoutant de la GFP purifiée à l’extérieur. Bien que la GFP elle-même puisse être affichée à la surface des cellules, cette nouvelle méthode évite le problème des faux positifs puisque ce n'est que si la GFP se lie au nanocorps présenté à la surface des cellules que les cellules peuvent produire un signal fluorescent. Le test est compatible avec de nombreuses méthodes de détection de fluorescence, notamment la détection de fluorescence de cellules entières en plaque, la fluorescence en gel, la microscopie et la cytométrie en flux. Cette méthode d’affichage de surface peu coûteuse et facile à lire contribuera à démontrer le mécanisme de transport des protéines à la surface des cellules vivantes, permettant ainsi le développement rationnel de systèmes d’affichage de surface bactériens et de biocatalyseurs robustes pour cellules entières à l’avenir.

La libération de neurotransmetteurs nécessite une exocytose, une endocytose et la formation de nouvelles vésicules de fusion. Ce qui arrive aux protéines des vésicules après l’exocytose, lorsqu’elles sont laissées sur la membrane plasmique, est mal comprise. Ces protéines sont fréquemment conjuguées à des fragments GFP sensibles au pH (fluor). L’imagerie pHluorine étant généralement limitée par la diffraction de spots plusieurs fois plus grands que les vésicules, l’utilisation de nanocorps anti-GFP pour marquer sélectivement les vésicules exocytosées est précieuse (72). En reliant les nanocorps anti-GFP à des fluorophores chimiques adaptés à l'imagerie à super-résolution, la taille et l'intensité des protéines marquées par la pHluorine dans diverses conditions peuvent être détectées d'une manière impossible avec la pHluorine seule. Lors de la stimulation de l’exocytose, de nouvelles protéines vésiculaires sont exposées à la membrane plasmique, puis les nanocorps marqués par fluorescence se lieront à pHluorin (Figure 5B). Ainsi, la détection du pHluorine à base de nanocorps est un outil prometteur pour étudier les événements post-exocytose dans les neurones.

4.2. Applications dans la dégradation ciblée des molécules de protéines

Comparée à l’édition de gènes et à l’interférence d’ARN, la manipulation directe de biomolécules au niveau des protéines constitue une voie plus efficace pour les études sur la fonction des protéines, surmontant les limitations telles que les effets potentiels hors cible, l’inactivation des gènes et la perte de la fonction phénotypique essentielle des gènes. La dégradation ciblée des protéines constitue actuellement une stratégie de recherche majeure pour parvenir à la perte de fonction et à la protéolyse des protéines d’intérêt. Un dégradateur de protéines à base de nanocorps peut aider à obtenir une dégradation rapide et une régulation réversible des protéines d'intérêt. Caussinus et coll. développé une méthode de dégradation des protéines pour l'épuisement direct et rapide des protéines de fusion GFP cibles dans tout système eucaryote (73). En bref, pour éliminer la protéine de fusion GFP, un nanocorps anti-GFP est fusionné à la protéine F-box (FBP) dans les complexes SKP1-CUL1-F-box Protein (SCF) E3 ligase. pour reconnaître la protéine de fusion GFP. L'enzyme de conjugaison de l'ubiquitine (E2) lie de manière covalente plusieurs molécules d'ubiquitine à la protéine de fusion GFP cible. Par la suite, le complexe SCF dégrade la protéine polyubiquitinée ; ainsi, l’élimination de la protéine cible est facile à surveiller (Figure 5C). Cette technique, appelée dégradation de la protéine fluorescente verte (deGradFP), a été utilisée pour la dégradation de la GFP et de ses fusions dans des cellules de mammifères, des embryons de poisson zèbre (74) et des plantes (75).

4.3. Applications dans le système de purification par affinité par complémentation bimoléculaire

En 2016, Croucher et al. développé un système de purification par affinité par complémentation bimoléculaire (BiCAP) qui peut distinguer efficacement le dimère du récepteur du facteur de croissance épidermique humain (HER) (homologue et hétérologue) du monomère (76). Dans ce système, deux fragments complémentaires d'une molécule FP sont fusionnés avec deux protéines HER (HER1, HER2 ou HER3). Ces deux fragments ne peuvent pas être spontanément assemblés en protéines fluorescentes actives. Supposons cependant que les deux protéines HER interagissent entre elles. Dans ce cas, les deux fragments seront spatialement proches l’un de l’autre et complémentaires, les reconstruisant en une protéine fluorescente complète et active (Figure 5D). Le dimère HER et ses protéines en interaction peuvent être enrichis à l'aide d'un nanocorps GFP, qui n'avait aucune affinité pour les fragments GFP, permettant ainsi l'isolement et l'enrichissement du dimère. En analysant les protéines identifiées, il a été révélé que les trois dimères (HER2 : HER2, HER2 : HER3 et HER1 : HER2) ont des protéines d’interaction communes et leur Interactiveome spécifique. FAM59A, une protéine qui a spécifiquement interagi avec le dimère HER1:HER3, a médié l'activation de la voie kinase régulée par le signal extracellulaire, fournissant ainsi une nouvelle cible pour le traitement du cancer du sein.

cistanche plante augmentant le système immunitaire

4.4. Applications dans d'autres domaines

Le diagnostic in vitro précoce d'une maladie et le suivi des effets thérapeutiques constituent un problème majeur dans le diagnostic des maladies. Un agent de contraste idéal doit avoir une bonne pénétration dans les tissus, une affinité antigénique élevée et une capacité de clairance rapide avec un minimum de dommages aux tissus normaux. Les nanocorps ont le potentiel d’être des agents d’imagerie idéaux capables de traverser les vaisseaux sanguins et de pénétrer dans les tissus pour de meilleures applications d’imagerie et thérapeutiques.

Les FP éclairent non seulement les cellules et les processus biologiques, mais constituent également d’excellents échafaudages en raison de leur manque apparent de liaison avec de nombreux réseaux de protéines hôtes. En utilisant les GBP et les GFP comme échafaudage pour piloter la formation de complexes biologiquement actifs, Tang et al. créé une bibliothèque de facteurs de transcription hybrides qui contrôlent exclusivement l'expression des gènes en présence de GFP et de ses dérivés (77). La production de GFP contrôle l’expression de gènes spécifiques aux cellules (Figure 5E) et favorise le dysfonctionnement de la rétine et du cerveau de la souris. De plus, les souches transgéniques de souris et de poisson zèbre GFP sont modifiées pour obtenir une transcription dépendante de la GFP pour la surveillance photogénétique des circuits neuronaux. Ce travail établit la position de la GFP en tant qu’échafaudage polyvalent et ouvre la porte à la manipulation sélective de diverses cellules marquées par la GFP dans des souches transgéniques. Sur cette base, d’autres produits intracellulaires peuvent également être développés comme échafaudages spécifiques aux cellules dans les organismes multicellulaires.

Les nanostructures d'ADN sont devenues un outil essentiel et efficace pour étudier l'activité enzymatique et la fonction des protéines. Cependant, développer des stratégies universelles pour former des complexes protéiques sur des nanostructures d’ADN est difficile. L’une des difficultés réside dans la fixation des protéines d’intérêt aux nanostructures d’ADN. Sommese et al. ont proposé une nouvelle approche pour marquer les nanostructures d'ADN (78). En les fonctionnalisant avec un nanocorps GFP, la capacité de fixation des protéines peut être contrôlée avec précision (Figure 5F). Comparés aux aptamères d'ADN spécifiques de la GFP, les nanocorps présentent une spécificité, une stabilité et une affinité plus élevées envers la GFP. Par conséquent, l’application des nanostructures d’ADN en tant qu’échafaudage programmable dans la recherche biologique a été considérablement simplifiée en reliant les nanostructures d’ADN aux FP couramment trouvés dans les cellules, la biologie du développement et la biochimie des protéines.

5. Discussion sur les perspectives d'avenir

Comparés aux anticorps traditionnels, les nanocorps ont de meilleures propriétés physiques et chimiques et sont plus faciles à exprimer et à cribler. Les nanocorps ont une structure beaucoup plus simple que les anticorps conventionnels. Ils sont codés par un seul gène et peuvent être facilement produits par des micro-organismes, réduisant ainsi considérablement le coût de production. Bien que les nanocorps constituent une avancée majeure dans la recherche sur les anticorps, certains problèmes doivent encore être résolus. D'une part, ils présentent l'inconvénient d'un fonctionnement peu pratique et du coût élevé de la vaccination des animaux. De plus, comme HAb et IgNAR sont abondants dans les monocytes du sang périphérique, les nanocorps ciblant les antigènes FP sont généralement criblés à partir de bibliothèques immunitaires spécifiques de camélidés ou de requins. Avec la maturation des technologies de construction de bibliothèques et de développement de nanocorps, le criblage de nanocorps spécifiques au FP à partir de bibliothèques synthétiques constitue une nouvelle direction qui permettra de surmonter les inconvénients liés à l'immunisation des animaux, de raccourcir la période expérimentale et de réduire considérablement le coût. D’un autre côté, bien que le criblage et l’expression des nanocorps soient relativement simples, l’obtention de nanocorps FP présentant des valeurs d’application potentielles est un processus très compliqué. Le criblage des bibliothèques de nanocorps de phages ne peut pas éviter les faux positifs provoqués par la liaison de la surface du phage filamenteux avec l'antigène, tandis que la petite capacité des bibliothèques de nanocorps de levure et de bactéries constitue un autre problème difficile dans le criblage des nanocorps.

Les applications des nanocorps contre la FP continueront à augmenter à l'avenir. (1) Avec le développement de la technologie des anticorps intracellulaires, la détection de molécules intracellulaires dans les cellules vivantes est devenue accessible. Les nanocorps présentent des avantages uniques à cet égard, dans la mesure où (i) le nanocorps est petit et l'efficacité de l'entrée dans les cellules est bien supérieure à celle des anticorps traditionnels ; et (ii) le nanocorps peut être exprimé et fonctionnel dans des cellules vivantes. (2) Le nanocorps bispécifique est une sorte d’anticorps artificiellement modifié qui peut lier spécifiquement deux antigènes différents simultanément. Il peut être facilement construit à partir de nanocorps monovalents et exprimé dans des micro-organismes. Par conséquent, les nanocorps contre la FP offrent de larges perspectives d’application pour le développement de nanocorps bispécifiques.

6. Conclusions

Cet article passe en revue l’origine, la structure et les propriétés des PF. Les anticorps monoclonaux et les nanocorps ciblant les FP et leurs applications sont également résumés. Bien que les anticorps soient des outils précieux pour afficher les composants biologiques dans les cellules immobilisées, l’utilisation des anticorps traditionnels dans les cellules vivantes est limitée par le repliement et l’assemblage inefficaces de leurs chaînes lourdes et légères variables. La microinjection directe d’anticorps est la principale méthode utilisée dans les applications intracellulaires d’anticorps, ce qui est techniquement difficile et stressant pour les cellules. Les anticorps à domaine unique dérivés de chameaux ou de requins reconnaissent les antigènes grâce à leurs domaines variables de chaînes lourdes. Ces nanocorps petits et stables peuvent être exprimés et fonctionnels dans les cellules vivantes. Par conséquent, la génération de nanocorps ciblant les FP les rendra plus précieux dans la recherche biologique.

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