Assemblage du transcriptome De Novo basé sur ARN-Seq et découverte de gènes de la tige charnue de Cistanche Deserticola-Ⅱ

Classification fonctionnelle de toutes les transcriptions exprimées basée sur l'ontologie génétique et les bases de données KEGG

L'annotation Gene Ontology (GO) a été obtenue à partir du fichier d'association d'annotations et d'identités UniProt. Au total, 20 907 transcriptions, représentant 32,69 % du total des séquences exprimées, ont été attribuées à 1 745 termes fonctionnels. Parmi le total des termes GO fonctionnels, les affectations au processus biologique constituaient la majorité (1 116, 63,95 %), suivies par le composant cellulaire (329, 18,85 %) et la fonction moléculaire (300, 17,20 %). Les fonctions attribuées aux transcriptions exprimées couvraient un large éventail de catégories GO, et les 10 principaux termes GO avec les transcriptions les plus annotées étaient répertoriés dans le tableau 3. Nous fournissons la distribution de toutes les transcriptions exprimées dans trois catégories d'ontologie génétique (fonction moléculaire, composant cellulaire et processus biologique) dans le fichier supplémentaire (ensemble de données S3). Les termes GO liés aux fonctions de liaison et à l’activité transférase étaient principalement représentés dans la catégorie des fonctions moléculaires. Concernant les fonctions de liaison, la liaison cationique (4 394 transcrits) représentait la plus abondante, suivie par la liaison nucléotide/nucléoside (3 404 transcrits en moyenne) et la liaison protéique (2 422 transcrits). Dans le groupe d'activité transférase, la plupart sont ceux avec des groupes transférants contenant du phosphore (2 256 transcrits, 65,77 %). Parmi la catégorie des composants cellulaires, les transcrits étaient davantage localisés au niveau intracellulaire (10 581 transcrits en moyenne), tandis que parmi la catégorie des processus biologiques, les transcrits étaient plus impliqués dans le processus métabolique des biopolymères (6 683 transcrits en moyenne), suivi de la régulation du processus cellulaire (4 841 transcrits). ), l'expression des gènes (4 678 transcriptions) et le transport (3 512 transcriptions).

CISTANCHE TUBULOSA NATUREL POUR LA PRÉVENTION DE LA MALADIE D'ALZHEIMER PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Pour extraire les gènes impliqués dans la biosynthèse de la lignine et du PhG, 21 358 séquences protéiques potentielles non redondantes ont été recherchées par rapport aux séquences génétiques de 13 organismes végétaux dans la base de données KEGG, et elles ont été attribuées à 275 voies KEGG avec au moins 5 résultats. Les 10 principales voies avec les séquences les plus alignées sont répertoriées dans le tableau 4. La plupart des voies étaient impliquées dans des processus métaboliques primaires, tels que le métabolisme des acides aminés ou des protéines (ko01230, ko04141 et ko04120), le métabolisme des glucides (ko01200 et ko00500) et les nucléotides ou métabolisme des nucléosides (ko03018, ko00230 et ko00240). En outre, il existe 27 voies secondaires liées au métabolisme (Fig. 2), telles que la biosynthèse du squelette terpénoïde, la biosynthèse des phénylpropanoïdes, la biosynthèse des caroténoïdes, la biosynthèse des alcaloïdes de l'isoquinoléine et la biosynthèse des alcaloïdes du tropane, de la pipéridine et de la pyridine. Ces résultats fournissent une indication supplémentaire que des processus métaboliques actifs étaient en cours dans leC. déserticolatissu de la tige. Toutes les transcriptions exprimées associées aux voies KEGG ont été répertoriées dans le fichier supplémentaire (ensemble de données S4). Bien qu'il existe des voies considérablement modifiées entre C. deserticola et d'autres plantes, telles que le riz (ensemble de données S5), notre objectif principal dans cette étude est de révéler l'ensemble du profil transcriptome de la tige de C. deserticola et d'imaginer les voies associées de la biosynthèse des PhG. ce qui pourrait être utile pour guider la culture.

Gènes candidats codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse de la lignine

La lignine est le deuxième polymère terrestre naturel le plus abondant dans le règne végétal, constituant jusqu'à un tiers de la matière présente dans les parois cellulaires végétales. En tant que composant important des parois cellulaires, les lignines facilitent le transport de l’eau, fournissent un soutien mécanique et une intégrité structurelle et se défendent contre les agents pathogènes et les herbivores. Ces rôles de la lignine sont très précieux pour soutenir la croissance érective souterraine de C. deserticola dans le désert. Dans cette étude, nous avons présenté le tableau complet des voies de biosynthèse de la lignine chez C. deserticola (Fig. 3), dans lesquelles les monomères de lignine sont biosynthétisés à partir de la phénylalanine par une série de réactions enzymatiques, notamment l'hydroxylation, la méthylation, la réduction et le processus de polymérisation oxydative. Des enzymes liées à la biosynthèse de la lignine ont été détectées pour trois formes principalement synthétisées dans le tissu vasculaire (lignine p-hydroxyl-phényl (H), gaïacyl (G) et syringyl (S)) et la lignine 5-hydroxyl-gaïacyl qui n'a été identifiée que dans les plantes déficientes en COMT (acide caféique 3-O-méthyltransférase, EC 2.1.1.68) (telles que les plantes knock-down).

La phénylalanine ammoniaque-lyase (PAL, EC 4.3.1.24) est la première enzyme clé de la voie de biosynthèse de la lignine (Fig. 3) qui transforme la phénylalanine en acide cinnamique par désamination non oxydante. Au total, 6 297 lectures PAL ont été séquencées et 7 transcriptions PAL ont été assemblées chez C. deserticola (Tableau 5). Par comparaison des similarités de séquence, nous avons constaté que 4 d'entre elles (comp28550_c1_seq1/2/3/5) présentaient plus de 95 % de similarité avec la séquence connue d'ARNm de C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), tandis que comp28550_c1_seq4 et comp25940_c0_seq1 présentaient respectivement 77 % et 82 % de similitudes. La prédiction ORF a révélé que 5 transcrits avaient un potentiel de codage pour des protéines et étaient portés par un domaine lyase d'acide aminé aromatique (PF00221.14). Parmi eux, seul le transcrit comp28550_c1_seq4 pourrait coder pour une séquence protéique complète de 718 résidus d'acides aminés. Il a été rapporté que PAL était codé par une petite famille multigénique chez la plupart des espèces végétales, comme 4 chez Arabidopsis thaliana, 5 chez Populus trichocarpa, 3 chez Scutellaria baicalensis et 7 chez Cucumis sativus, etc. Notre analyse phylogénétique suggère qu'il y en avait 4. Gènes codant pour PAL chez C.

deserticola et nous les avons nommés respectivement CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 et CdPAL4 (Fig. S2). La 4-coumarate-CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12) et la trans-cinnamate 4-monooxygénase (CYP73A, EC 1.14.13.11) sont deux enzymes responsables de la transformation de l'acide cinnamique en dicoumarol-CoA en deux étapes inverses. ordres. Ils sont également dans les backbones et leurs valeurs d'expression FPKM sont respectivement de 39,57 et 51,93.

Les quatre types de lignines ont été biosynthétisées par différentes voies contrôlées par trois enzymes clés, la cinnamoyl-CoA réductase (CCR, EC 1.2.1.44), la shikimate o-hydroxycinnamoyltransférase (HCT, EC 2.3.1.133) et le ferulate{{1{ {56}}}}hydroxylase (F5H, EC 1.14.-.-). Le CCR a été signalé comme un point de contrôle de la voie des lignines [50, 51] qui catalysait le X-CoA (X incluant le dicoumarol, le caféoyl, le feruloyl, le 5-hydroxyl-feruloyl et le sinapoyl) en Y-aldéhyde (Y incluant p -cougar, caféoyl, coniféryl, 5-hydroxyl-coniféryl et snap), tandis que HCT catalysait le p-coumaroyl-CoA en acide p-coumaroyl shikimique/acide p-coumaroyl quinique. Les deux enzymes, tout comme un interrupteur, régulaient la biosynthèse des lignines P-hydroxyl-phényle ou des trois autres types de lignines. F5H était un autre commutateur de branche qui régulait la lignine syringyle et la lignine 5-hydroxyl-guaiacyl. D'autres enzymes importantes, notamment l'acide caféique 3-O-méthyltransférase (COMT, EC 2.1.1.68), la caféoyl-CoA O-méthyltransférase (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) et la cinnamyl-alcool déshydrogénase (CAD, EC 1.1.1.195 ) ont également été détectés exprimés. Des informations détaillées sur l'expression sont répertoriées dans le tableau 6. Ces gènes enzymatiques identifiés dans cette étude constitueront une ressource précieuse pour les études génomiques fonctionnelles de cette plante médicinale importante. 10 gènes liés à la voie de biosynthèse des lignines dans le tableau 6 ont été sélectionnés pour la vérification RT-qPCR afin de confirmer nos résultats RNAseq (Fig. 4), et leurs corrélations élevées (coefficient de corrélation de Pearson : 0,90343) ont indiqué une grande précision et reproductibilité de notre analyse du transcriptome. L'ensemble de données S1 répertorie les séquences d'amorces utilisées dans cette analyse.

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Gènes candidats codant pour les enzymes impliquées dans la biosynthèse des PhG

Les glycosides phényléthanoïdes (PhG) sont connus pour être les principaux ingrédients actifs de C. deserticola avec des activités d'amélioration de la puissance sexuelle, d'élimination des radicaux libres et d'anti-âge. Les trois composants chimiques des PhG sont l'acide organique, le saccharide et l'aglycon de phényléthanol (Fig. 3). Les acides organiques, notamment l'acide caféique, l'acide férulique et l'acide coumalique, sont des produits de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Les composants des saccharides, notamment le glucose et le rhamnose, sont des produits des voies du métabolisme des glucides, telles que le métabolisme de l'amidon et du saccharose, le métabolisme des sucres aminés et des sucres nucléotidiques, le métabolisme du fructose et du mannose, etc. Cependant, la voie de biosynthèse de la partie phényléthanol n'est pas encore claire. Ici, nous avons proposé deux voies possibles de biosynthèse du phényléthanol sur la base de nos données de séquence. L’une est la voie signalée de l’acide caféique ou de l’acide férulique, également connue sous le nom de voie de l’acide cinnamique, qui est similaire à la voie du squelette de la biosynthèse de la lignine. Une autre est basée sur la voie du métabolisme de la phénylalanine (Fig. 3), dans laquelle la transformation de la phénylalanine en phényléthanol a été obtenue par une « voie Enrlich » connue qui a été découverte pour la première fois dans la levure il y a un siècle et validée dans les fleurs de pétunia, les tomates et les roses. Quatre gènes enzymatiques codant pour l'aspartate/tyrosine aminotransférase, l'histidine-phosphate aminotransférase et l'amine primaire oxydase, responsables de la conversion de la phénylalanine en phényléthanol, ont été détectés exprimés dans la tige de C. deserticola. Le produit du phényléthanol peut être davantage oxydé par la monooxygénase ou méthylé par la méthyltransférase en ses dérivés (phényléthanol aglycon) qui participent à la biosynthèse du PhG. En résumé, deux voies de biosynthèse putatives du phényléthanol aglycon ont été proposées pourC. déserticolamais nécessite encore une étude plus approfondie.

Discussions

Ces dernières années, la génomique végétale s’est développée rapidement grâce à l’application de la technologie de séquençage de nouvelle génération, alors que peu de recherches se sont concentrées sur la génomique des plantes médicinales du désert. Il est urgent de mener des recherches génomiques ou transcriptomiques pour comprendre son adaptation aux environnements de sécheresse et de salinité et la voie de biosynthèse des principaux composants bioactifs. La découverte de novo du transcriptome de certaines plantes médicinales,

tels que Panax ginseng, Ginkgo biloba et Glycyrrhiza uralensis ont été exploités pour la première fois à l'aide de la plateforme Roche 454 pour sa longue longueur de lecture. En raison de la capacité d'assemblage efficace avec des lectures courtes, en particulier les lectures appariées privilégiées, le séquençage et l'assemblage du transcriptome basés sur Illumina ont également été largement utilisés pour les organismes modèles et non modèles. Dans la présente étude, nous avons généré environ 8G de lectures appariées de 101 pb et produit des séquences unigènes plus longues avec une longueur moyenne de 725 pb. Les données à grande échelle du transcriptome spécifique à la tige pourraient fournir des données de référence utiles et être utilisées pour exploiter le métabolisme secondaire des composants bioactifs de C. deserticola. 81,62 % du total des lectures brutes ont passé des filtres de qualité stricts (y compris le découpage de l'adaptateur et l'élimination des lectures de mauvaise qualité) avant l'assemblage, ce qui suggère la haute qualité de nos données de séquençage, et 82,08 % des lectures de haute qualité ont été utiles pour l'assemblage. D'autres lectures qui n'ont pas pu être utilisées pour l'assemblage peuvent provenir d'erreurs de séquençage, de paramètres d'assemblage, etc. Ces lectures de haute qualité inutilisées sont restées utiles pour améliorer l'assemblage de novo, combinées à des lectures plus longues à partir d'une autre plate-forme (telle que Roche 454) à l'avenir.

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Un grand nombre de transcriptions assemblées (30 098) ont montré des similitudes de séquence élevées avec des gènes connus dans les bases de données publiques, ce qui suggère que nos données appariées basées sur Illumina couvraient une fraction substantielle des transcriptions de C. deserticola. Les transcriptions sans succès BLAST peuvent être dues à des régions non traduites 3' ou 5', à un ARN non codant ou à de nouvelles séquences génétiques de C. deserticola. Les transcriptions exprimées ont été annotées selon un large éventail de catégories GO et de voies KEGG (Tableaux 3 et 4), dans lesquelles de nombreuses transcriptions ont été attribuées à des voies secondaires liées au métabolisme. Comme nous le savons, le phénylpropanoïde peut fonctionner comme un composé antimicrobien inductible très bénéfique pour un mode de vie souterrain [1], et également agir comme une molécule signal dans les interactions plante-microbe en plus de son utilité médicinale [68, 69]. Le terpénoïde est utilisé pour la biosynthèse de composants bioactifs (tels que le 6- désoxycatalpol) [70]. Nous avons constaté que les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse du squelette phénylpropanoïde et terpénoïde étaient très abondants chez C. deserticola. Plus important encore, la découverte de voies bien représentées de biosynthèse de la lignine (Fig. 3) a indiqué le processus métabolique actif de la lignine dans la tige de C. deserticola. Tous les gènes enzymatiques connus impliqués dans la biosynthèse de la lignine (Fig. 3) ont été détectés exprimés, et quatre enzymes clés, notamment PAL, CCR, HCT et F5H, présentaient une abondance d'expression plus faible (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 et 3,83, respectivement) par rapport à d'autres gènes enzymatiques (Tableau 6). La question de savoir si le changement d'expression de ces trois gènes pourrait ou non influencer la production de lignine chez C. deserticola mérite une étude plus approfondie. PAL est une enzyme clé dans la biosynthèse de la lignine et est également impliquée dans la biosynthèse du phénylpropanoïde, du resvératrol, des flavonoïdes et de la coumarine (71-74). Nous avons détecté quatre gènes PAL distincts dans le génome de C. deserticola (Fig. S2), ce qui coïncidait avec le fait que PAL était codé par une petite famille multigénique (39, 43, 45-49) et avons en outre prouvé qu'il pouvait jouer un rôle important dans le flux métabolique de carbone. .

Le PhG est le principal ingrédient actif de C. deserticola. Les gènes impliqués dans la biosynthèse du phényléthanol sont importants pour la qualité de C. deserticola. Nous avons déduit deux voies de biosynthèse différentes du phényléthanol et 17 gènes enzymatiques impliqués dans la biosynthèse du PhG dans la tige de C. deserticola. Les processus possibles après l'acide caféique/férulique (Fig. 3) ont également été déduits pour la première fois sur la base d'une formule développée d'intermédiaires et de propriétés catalytiques des enzymes correspondantes, dans laquelle l'acide caféique/férulique serait d'abord oxydé en dérivé de phénylpyruvate ; ensuite, le groupe carboxyle a été privé par les décarboxylases ; enfin, le groupe aldéhyde a été reconverti en groupe alcool par la déshydrogénase. Il s’agit de la première application de la technologie de séquençage à extrémités appariées d’Illumina pour étudier l’ensemble du transcriptome de C. deserticola et pour assembler des lectures de séquençage d’ARN sans génome de référence. Cette étude fournira des ressources utiles et des séquences génétiques pour la recherche future en génomique fonctionnelle et en protéomique sur C. deserticola.

Conclusions

Dans cette étude, nous avons profilé le transcriptome de la tige de C. deserticola sur la base de données de séquençage à haut débit, identifié des gènes impliqués dans les voies de biosynthèse de la lignine et déduit pour la première fois la voie potentielle de biosynthèse des PhG, ce qui accélérera certainement la compréhension. des processus physiologiques ambigus et de la grande valeur médicinale au niveau moléculaire. Jusqu'à présent, il s'agit de la première tentative visant à assembler de novo l'intégralité du transcriptome de la tige de C. deserticola et à détecter la voie de biosynthèse des composants médicinaux à l'aide d'ensembles de données de séquençage basés sur Illumina. Notre étude pourrait favoriser le développement de médicaments naturels et la sélection de cultivars présentant des caractéristiques médicinales.

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